针对GPVI的新的拮抗剂抗体及其Fab片段及其用途的制作方法

专利名称：针对GPVI的新的拮抗剂抗体及其Fab片段及其用途的制作方法
技术领域：
本发明公开了与人血小板膜蛋白糖蛋白VI (GPVI)特异性结合的新的抗体及其单价片段或衍生物。本发明的抗体是来自杂交瘤克隆390的抗体和与同被来自杂交瘤克隆390的抗体识别的构象表位类似的表位结合的抗体。这些抗体和Fab片段能够阻断胶原结合，因此防止血小板被胶原活化。本发明还涉及用于产生所公开的抗体和Fab片段的杂交瘤克隆和表达质粒。本发明还涉及单价抗体片段在制造用于治疗血栓形成和其它血管疾病的研究试剂、诊断剂及免疫治疗剂中的用途。另一方面，本发明涉及防止受体通过患者特异性抗Fab抗体诱导的受体聚簇而活化的方法。发明背景 血小板功能在动脉血栓形成和心血管疾病中十分重要。目前，用抗血小板药物治疗患有心血管疾病的患者是理所当然的事。尽管各种临床上成功的抗血小板治疗的可获得性，但仍然存在对新治疗的未被满足的巨大医学需求。这种不足主要是由当前可获得的药物的功效有限所造成的，特别是在药物功效一安全性(出血)相关性方面。干扰血小板活化和粘附的早期事件(一种不被当前使用的药物靶向的机制)，可能是改进功效一安全性边缘(margin)的有吸引力的方法。胶原受体糖蛋白(GPVI)在血小板活化的这些早期事件中非常重要，因此是干扰这个机制的主要靶标(Nieswandt B和Watson SP, Blood. 2003年7月15日；102 (2) :449-61)。已使用来自小鼠和人的血小板,在几个体外和体内系统中描述了GPVI的抗血小板和抗血栓形成作用。缺乏GPVI的血小板变得对胶原(内皮下基质最重要的血栓形成组分之一)无反应(Lockyer S.等，Thromb Res. 2006 ; 118 (3) : 371-80)。此夕卜，小鼠研究表明，GPVI缺陷引起有效抑制受损血管壁上的动脉血栓形成，而又不增加对自发性出血的易感性。所有这些数据表明，GPVI代表治疗动脉血栓形成的有效而安全的靶标。GPVI在起始血栓形成中的重要作用表明，抑制该受体可有益于动脉血栓形成综合征。这利 用了生物治疗性蛋白(例如抗体)这种用于抑制GPVI的具有临床意义的策略。而且，由于GPVI与其配体胶原的相互作用似乎涉及扩大的蛋白质表面，因此与其它策略相比，使用抑制性GPVI结合蛋白更可能成功干扰这种蛋白质-蛋白质相互作用。在若干动物模型中已显示了 GPVI功能被抗体和Fab片段抑制的概念的体内证明。仍需要GPVI活性的临床有效抑制剂。GPVI是只在血小板和巨核细胞上表达的主要胶原受体。与胶原结合诱导受体聚簇和随后的血小板活化。这是血栓形成的起始事件之一。现有抗血小板药物通过靶向这个过程的晚期事件而干扰血栓形成。这些药物的严重副作用是长期出血，这就限制了它们的使用。有若干系列证据显示，靶向血栓形成的早期事件(例如GPVI)可以是高度抗血栓形成的，又不对出血易患性有重大影响。通过中和单克隆抗体(mAb)，可成功地抑制胶原和GPVI之间的相互作用。然而，因为mAb是二价分子，因此它们可诱导GPVI-受体聚簇，并因此诱导血小板活化。为了克服这一点，开发了单价抗体片段例如Fab片段。遗憾的是，这些单价抗GPVI Fab片段的深度安全性特征分析揭示了仍以患者特异 性方式诱导血小板活化的潜力。为了提供用于治疗缺血性事件的安全治疗药，不得不消除所开发的Fab分子的这种活化潜力。直到现在，这个问题都未得到解决。发明概述
在第一个方面，本发明提供与人GPVI和与灵长类动物GPVI特异性结合的新的单克隆抗体(来自克隆390)。另一方面，本发明涉及来源于来自克隆390的抗GPVI mAb的可变结构域序列的重组Fab片段。这些抗GPVI抗体和Fab片段识别人GPVI蛋白的Dl和D2结构域中的特异性构象表位。抗GPVI mAb和Fab片段两者能够抑制胶原与GPVI结合。将抗GPVI Fab片段人源化并进行改造，旨在改进其与人GPVI的亲和力。对人源化变体的生物物理特征进行了描述。 除了抑制胶原以外，抗GPVI Fab片段还能够抑制在富含人血小板的血浆和人全血两者中胶原诱导的血小板聚集。这些Fab片段还能够在胶原包覆的表面上抑制流动中的血栓形成。因此，抗体在人中抑制GPVI似乎成为有吸引力的抗血栓形成策略。出人意料的是，本发明的抗GPVI Fab诱导GPVI耗尽表型。因此，能够诱导GPVI耗尽表型的抗GPVI Fab片段构成本发明的另一个目的。本发明还提供用于防止Fab片段被预先存在的抗体识别的方法，所述方法在于通过加入分子掩蔽(mask) Fab的C末端。本发明还提供用于防止Fab片段被针对Fab C末端的新抗体识别的方法，所述方法在于通过加入分子掩蔽Fab的C末端。本发明还提供用于防止在使用抗GPVI Fab时血小板活化的方法，其中通过加入分子掩蔽Fab的C末端。本发明的另一个目的是在C末端携带分子的Fab片段。还提供DNA和蛋白质序列以及用于表达本发明的抗GPVI和Fab片段的载体。本发明的抗血栓形成药可用于治疗血栓形成性疾病或血管疾病。本发明还提供包含药学有效量的本发明的GPVI特异性单克隆抗体片段与合适赋形剂的抗血栓形成组合物。在本发明的另一方面，所述抗体可用于诊断有风险的需要抗血栓形成治疗的患者。本发明还包括用于诊断的包括抗GPVI抗体或其片段的试剂盒。本发明还提供用于制备本发明的GPVI抗体、抗体片段和掩蔽的抗体Fab片段的方法。发明详述
在第一个方面，本发明提供与人GPVI特异性结合的新的单克隆抗体和其片段，特别是来自杂交瘤克隆390的抗GPVI mAb。本发明的抗体拮抗GPVI的全部或部分活性。在本发明的第二个方面，本发明人证实，在Fab重链(HC) C末端上加入肽具有避免Fab分子被一些患者中预先存在的抗Fab抗体识别的掩蔽作用，从而防止血小板活化和相关副作用。本文所用“来自杂交瘤克隆390的单克隆抗体”或“来自克隆390的单克隆抗体”是指由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 8限定的抗体及其衍生物，包括人源化抗体、Fab片段和人源化Fab片段或尤其本申请所述这些分子的任何改进形式。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，具体地讲涵盖任何同种型(例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体和抗原结合片段。可通过重组方法，例如在噬菌体或类似载体中选择重组抗体文库，或者通过用抗原或编码抗原的核酸免疫动物，产生与特定抗原有反应性的抗体。典型的IgG抗体由通过二硫键连接的两条相同的重链和两条相同的轻链组成。每条重链和轻链含有恒定区和可变区。每个可变区含有3个称为“互补决定区”(“CDR”)或“超变区”的区段，其主要负责与抗原的表位结合。它们常称为⑶R1、⑶R2和⑶R3，从N端顺序编号。可变区中较高度保守的部分称为“构架区”。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体及其片段(包括抗体Fab片段)包含由SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22和SEQ ID NO:23限定的6个⑶R。在另一个实施方案中，本发明的抗体及其片段(包括抗体Fab片段)包含由SEQID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:38,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:23 限·定的6个CDR。在另一个具体方面，本发明的抗体Fab片段包含
(a)重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)，其具有由SEQID NO: 18、SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20 (或SEQ ID NO:38)限定的氨基酸序列；和
(b)轻链可变区(LCVR)的互补决定区(CDR)，其具有由SEQID NO:21, SEQ ID NO:22(或SEQ ID NO:39)和SEQ ID NO:23限定的氨基酸序列；和
其中可将各CDR的至少2个氨基酸残基变成另一个氨基酸残基而又不直接破坏与GPVI表位残基的接触。本文所用“直接破坏与GPVI表位残基的接触”是指改变与GPVI表位残基接触并描述于本文提供实施例的晶体结构中的抗体氨基酸残基。本文所用“VH”是指抗体免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFV、dsFV、Fab、Fab’或F(ab’)2片段的重链。提及“VL”时是指抗体免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’ 或 F (ab，)2 片段的轻链。“多克隆抗体”是在一个或多个其它不同抗体之中或在一个或多个其它不同抗体存在下产生的抗体。一般而言，多克隆抗体是由一种B淋巴细胞在产生不同抗体的若干其它B淋巴细胞存在下产生的。多克隆抗体一般可直接获自经免疫的动物。本文所用的“单克隆抗体”是获自基本均质的抗体群的抗体，即形成该群的抗体基本相同，除了可以少量存在的可能的天然存在的突变。这些抗体针对单一表位，因此是高特异性的。本文所用术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括任何天然存在的、酶法可获得的、合成的或遗传改造的与抗原特异性结合形成复合物的多肽或糖蛋白。可采用任何合适的标准技术，例如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变结构域和任选恒定结构域的DNA的操作和表达的重组遗传工程技术，从例如完整抗体分子得到抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括(i) Fab片段；(ii) F(ab’)2片段；(iii) Fd片段；(iv) Fv片段；(V)单链Fv (scFv)分子；(vi) dAb片段；和(vii)由模拟抗体超变区(例如分离互补决定区(CDR))的氨基酸残基组成的最小识别单元。其它经改造的分子例如双链抗体、三链抗体、四链抗体和微型抗体(minibody),也包括在本文所用表述“抗原结合片段”内。本文所用术语“Fab片段”相当于抗体的轻链(LC)加部分重链(HC)。Fab分子通过蛋白酶切割IgG分子而产生，或通过表达重组分子而产生。通常除去重链恒定结构域的部分(Fe部分)。本文所用术语“掩蔽的Fab片段”或“掩蔽的Fab”相当于含有抗体轻链(LC)加部分重链(HC)的Fab片段，且其中HC的C端被肽延伸以掩蔽Fab不被患者中预先存在的抗体识别。
采用只含有胞外Dl和D2结构域的人重组GPVI蛋白，通过小鼠免疫技术产生杂交瘤，来获得本发明的抗体。用于免疫的蛋白质的序列相当于SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4。首先针对其识别人GPVI蛋白的能力，但也针对其阻断胶原与人GPVI蛋白结合的能力以及以高亲和力与GPVI蛋白结合的能力，对所得到的mAb进行选择。所述抗体与灵长类动物GPVI具有交叉反应性(如图2所示)，而对鼠、大鼠、狗、猪或兔GPVI不存在交叉反应性。所选择的mAb能够以PM亲和力与人GPVI蛋白结合(如表I所示)，并以小于10μ g/mL的IC50值阻断胶原与人GPVI蛋白结合(如图IA所示)。该抗体还能够阻断胶原与非人灵长类动物GPVI结合(如图IB所示)。另一方面，本发明涉及来源于来自克隆390的抗GPVI mAb的可变结构域序列的重组Fab片段。Fab片段可通过本领域已知的任何方法制备。例如，可通过无花果蛋白酶切割获得蛋白水解Fab片段，或者可通过将所需序列克隆至表达载体中来制备重组Fab片段(例如如实施例3B中所述)。像抗GPVI mAb 一样，Fab片段能够抑制胶原与GPVI结合。使Fab片段与GPVI共结晶，通过X射线晶体学分析以确定被GPVI蛋白上的Fab识别的表位。该分析可供界定包括人GPVI胞外结构域的Dl和D2结构域两者的构象表位。用于表位的编号系统相当于除去20个残基信号序列的GPVI，如图16和SEQ ID N0:32所
/Jn ο在本发明的一个方面，提供与人GPVI构象表位特异性结合并接触人GPVI残基(包括Ser 43、Arg 67和Asp 81)的分离抗体或抗原结合片段。在本发明的另一方面，抗体或抗原结合片段额外与两个或更多个选自以下的GPVI残基接触Pro4、Lys7、Glu40、Lys41> Leu42、Ser44> Ser45、Arg46、Arg65> Trp76> Leu78、Pro79> Ser80> Gln82、Serl65 和Argl66。在本发明的另一方面，抗体或抗原结合片段额外与3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上、10个以上、11个以上、12个以上、13个以上、14个以上、15 个以上选自以下的 GPVI 残基接触Pro4、Lys7、Glu40、Lys41、Leu42、Ser44、Ser45、Arg46、Arg65、Trp76> Leu78、Pro79> Ser80> Gln82、Serl65 和 Argl66。本文所用“接触残基”定义为这样的残基其与GPVI抗原残基的距离或反向距离小于4. 5 A，如应用例如CCP4软件包的NCONT软件程序或等同软件程序，在GPVI抗体或抗体的抗原结合片段与GPVI抗原之间的晶体结构中测量。在一个实施方案中，抗体Fab片段与人GPVI的构象表位结合并接触人GPVI残基，其包括 Ser 43、Arg 67 和 Asp 81。在另一个实施方案中，抗体Fab片段与人GPVI的构象表位结合并接触人GPVI残基，其包括Pro4、Lys7、Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46、Arg65、Arg67、Trp76、Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、Gln82、Serl65、Argl66。本发明的mAb识别相同的构象表位，因为Fab片段含有来自克隆390的抗GPVImAb的可变结构域序列。因此，另一方面，本发明提供抗GPVI抗体(包括Fab片段)，其识别包含于人GPVI蛋白的胞外Dl和D2结构域中的构象表位。因此，另一方面，本发明提供单克隆抗GPVI抗体，其识别包含以下氨基酸的构象表位
Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46。
另一方面，本发明提供抗GPVI抗体，其识别包含以下氨基酸的构象表位
Trp76、Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、Gln82。在另一个实施方案中，抗GPVI抗体识别包含以下氨基酸的构象表位
Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46、Trp76、Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、
Gln820在另一个实施方案中，抗GPVI抗体识别包含以下氨基酸的构象表位
Pro4、Lys7、Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46、Arg65、Arg67、Trp76、Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、Gln82、Serl65、Argl66。在另一个实施方案中，抗GPVI抗体识别存在于下列氨基酸中的构象表位
Pro4、Lys7、Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46、Arg65、Arg67、Trp76、
Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、Gln82、Serl65、Argl66。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体Fab片段主要包括人GPVI的Dl结构域。本发明的抗体可定义为这样的单克隆抗GPVI抗体，其(i)完全抑制包含SEQ IDNO. 6的HC和SEQ ID NO. 8的LC的抗体与人GPVI结合，和(ii)与类似于被包含SEQ IDNO. 6的HC和SEQ ID NO. 8的LC的抗体识别的构象表位的表位或该构象表位的一部分结合，通过生物物理学方法例如表面等离振子共振(如描述于Karlsson R, Larsson A. (2004),J. Mol. Biol. 248，389_415 的 Biacore)测定的亲和力为至少 10 nM (KD 彡 1(Γ8 M)。本文所用术语“KD”是指特定抗体/抗原相互作用的解离常数。反映人GPVI蛋白与本发明的抗体和Fab之间的相互作用的Kd包括在[10〃 ；10_1°]区间内。对人GPVI有特异性的抗体表现Kd = 10_7 M，优选Kd = 10_8 M，更优选Kd = 10_9 M。具有最高亲和力的抗体可为Kd = 10, M以下，例如10_n M或10_12M。术语“特异性结合”等意指抗体或其抗原结合片段与GPVI抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合可以解离常数为I xlO—6 M以下为特征。用于测定两个分子是否特异性结合的方法是本领域众所周知的，包括例如实施例2和实施例3中的平衡透析、表面等离振子共振等。例如，用于本发明上下文的“特异性结合”人GPVI的抗体包括以例如在表面等离振子共振测定中测量的下列Kd结合人GPVI或其部分的抗体小于约1000 nM、小于约500 nM、小于约300 nM、小于约200 nM、小于约100 nM、小于约90 nM、小于约80 nM、小于约70 nM、小于约60 nM、小于约50 nM、小于约40 nM、小于约30 nM、小于约20 nM、小于约10 nM、小于约5nM、小于约4 nM、小于约3 nM、小于约2 nM、小于约I nM或小于约O. 5 nM。“表位”是抗原上抗体与之结合的位点。如果抗原是聚合物，例如蛋白质或多糖，则通过抗原聚合物折叠而使连续残基或非连续残基紧密靠近而形成表位。在蛋白质中，由连续氨基酸形成的表位通常保持暴露在变性溶剂中，被称为“线性表位”，而由非连续氨基酸形成的表位通常在所述暴露下丧失，被称为“构象表位”。本文所用术语“相似表位”涉及这样一组氨基酸，其位于与由结晶学分析描述的实际参与来自克隆390的抗体和人GPVI蛋白胞外结构域之间的相互作用的氨基酸相同的区域。相似表位可包括若干差异，例如在参比表位附近多达5个氨基酸差异。相似表位还可在鉴定为形成表位的氨基酸(即与GPVI蛋白相互作用的氨基酸)中存在一个或多个修饰。鉴定为参比表位的一部分的一个或多个氨基酸可缺失，且一个或多个其它氨基酸残基可存在以形成相似表位。例如，与来自杂交瘤克隆390的抗体相比，可改变多达5个氨基酸而又不影响抗体特性。因此，针对一种特异性抗体的表位所处的区域包括一些潜在的其它相互 作用氨基酸。鉴于此，相似表位可定义为与参比抗体竞争结合的区域。当中和抗体与这类区域结合时，受体的一个或多个细胞信号转导途径被抑制，导致靶向受体或更多通常有效的蛋白质的一个或多个生物功能特异性受损。本文所用“中和”或“封闭性”抗体应指这样的抗体，其与GPVI的结合⑴干扰GPVI和胶原之间的相互作用，(ii)和/或(iv)导致GPVI的至少一种生物功能受抑制。由GPVI中和抗体或封闭性抗体引起的抑制不一定完全，只要采用合适的测定法可检测即可。本文描述了用于检测GPVI抑制的示例性测定法。例如，在美国专利6，448，380中说明了与特定生物活性有关的蛋白质中存在拓扑区。可使用GPVI-Fc融合蛋白作为俘获抗原，通过竞争性ELISA测定法，选择与得自克隆390的抗体一样识别类似表位的抗体。将用GPVI-Fc融合蛋白包被的板与杂交瘤上清液或得自克隆390的抗体或抗原结合片段一起温育。不同抗GPVI抗体(通过任何标准技术标记)与表位封闭的GPVI结合的缺乏表明识别类似表位。可通过竞争性Biacore分析实施等同的选择策略，该分析中GPVI被固定，而得自克隆390的抗体(片段)用来封闭表位。接着，针对与表位封闭的GPVI的结合，对候选的其它GPVI结合抗体进行分析。因此，可选择识别与本发明抗体识别的表位类似的表位的抗体，并可采用X射线分析，通过共晶体结构分析进一步表征。本发明还涉及人源化和经改造的抗GPVI抗体及其片段。在本发明的情况下，采用之前W02009/032661中描述的方法使抗GPVI Fab片段人源化，但是可以使用本领域已知的任何人源化方法。根据对Fab与GPVI的晶体复合物的分析，引入若干突变用于人源化，目的在于改进Fab对人GPVI的亲和力。因此，产生了 LC的3种变体和HC的5种变体。分别将用于LC (VL)和HC (VH)的这些Fab变体概括于表6和表7。在所有可能的组合中，本发明特别涉及下列组合
分别对应于 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 10 的 VLl 与 VHl分别对应于 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 11 的 VLl 与 VH2分别对应于 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 12 的 VLl 与 VH3分别对应于 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 13 的 VLl 与 VH4分别对应于 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 14 的 VLl 与 VH5分别对应于 SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 11 的 VL2 与 VH2分别对应于 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 11 的 VL3 与 VH2分别对应于 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 13 的 VL3 与 VH4
在一个优选的实施方案中，抗GPVI Fab的人源化变体是对应于SEQ ID NO. 15与SEQID NO. 12的VLl与VH3的缔合。在本发明的一个方面，可通过加入标签或氨基酸突出端(肽)，对抗GPVI抗体的VH进一步修饰以掩蔽抗体不被预先存在的抗体识别。可将6个以上组氨酸残基的序列，特别是(His)6 或(His)7 或(His)8 或者例如 GlyGlyGlyGlySer 或(GlyGlyGlyGlySer) 2 等单元加到重链C端上。本文所用“经改造的Fab片段”是指经遗传改造以在c端含有重链肽突出端的Fab片段。该突出端导致将之前的c端掩蔽，并防止Fab片段被预先存在的抗Fab抗体识别和 彡口口 在本发明的另一个实施方案中，提供包含人源化重链(HC)氨基酸序列和人源化轻链(LC)氨基酸序列和c端突出端的组合的经改造的Fab片段。经改造的Fab片段还包含选自以下的重链可变区(HCVR)氨基酸序列和轻链可变区(LCVR)氨基酸序列的组合
(a)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 10)；
(b)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 11)；
(c)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 12)；
(d)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 13)；
(e)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 14)；
(f)LCVR (SEQ ID NO. 16)和 HCVR (SEQ ID NO. 11)；
(g)LCVR (SEQ ID NO. 17)和 HCVR (SEQ ID NO. 11);和
(h)LCVR (SEQ ID NO. 17)和 HCVR (SEQ ID NO. 13)。其中c 端突出端选自 SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36 和 SEQ ID NO:37。在一个具体的实施方案中，本发明涉及这样的单克隆抗体，其包含SEQ ID NO. 6的HC和SEQ ID NO. 8的LC或与这些序列有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性但保持与所述单克隆抗体相同活性的序列。在一个更具体的实施方案中，本发明的抗体Fab片段包含(a)具有由SEQ ID NO:6限定的氨基酸序列的重链可变区；和(b)具有由SEQ ID N0:8限定的氨基酸序列的轻链可变区。本发明还涉及编码本发明的抗GPVI抗体和Fab的核酸。在一个实施方案中，核酸分子编码抗GPVI抗体的HC和/或LC。在一个优选的实施方案中，单一核酸编码抗GPVI抗体的HC，另一个核酸分子编码抗GPVI抗体的LC。在一个具体的实施方案中，编码来自杂交瘤390的抗体的HC和LC多肽的核酸或多核苷酸分别对应于SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 7或与这些序列有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性但保持与所述单克隆抗体相同活性的序列。编码选自SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 15,SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 17的多肽或与这些序列有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性但保持与所述单克隆抗体相同活性的序列的多核苷酸也是本发明的组成部分。本发明提供包含本发明的多核苷酸的载体。在一个实施方案中，所述载体含有编码抗GPVI抗体的HC的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述多核苷酸编码抗GPVI抗体的LC0本发明还提供包含编码融合蛋白、修饰抗体、抗体片段及其探针的多核苷酸分子的载体。本发明的载体含有SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 7的多核苷酸或编码选自以下的多肽的任何多核苷酸SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ IDNO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16 和 SEQID NO. 17，或与这些序列有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性但保持与所述单克隆抗体相同活性的序列。
为了表达本发明的抗GPVI抗体或Fab的HC、HC和/或LC的片段，将编码所述HC和/或LC的多核苷酸插入表达载体，使得基因与转录和翻译序列有效连接。表达载体包括质粒、YAC、黏粒、反转录病毒、EBV衍生的附加体及技术人员可了解的适宜确保所述重链和/或轻链表达的所有其它载体。技术人员应认识到，可将编码HC/或HC片段和LC的多核苷酸克隆至不同载体或相同载体中。在一个优选的实施方案中，将所述多核苷酸克隆至相同载体中。本发明的多核苷酸和包含这些分子的载体可用于转化合适的哺乳动物或微生物宿主细胞。转化可以是通过将多核苷酸导入细胞宿主的任何已知方法。这类方法为本领域技术人员所熟知，包括葡聚糖介导的转化、磷酸钙沉淀、Polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封入脂质体、生物射弹注射和将DNA直接显微注射入核。本发明的人源化和经改造的变体具有拮抗GPVI途径活性的完整功能。具体讲，它们能够抑制胶原与GPVI结合。它们还能够在人富含血小板的血浆和人全血两者中抑制胶原诱导的血小板聚集。另外，它们还能够在胶原包覆的表面上抑制流动中的血栓形成。本发明的抗GPVI Fab片段与GPVI结合的特征在于血小板表面上发生GPVI耗尽表型。这是一种新的和未预料到的抗GPVI Fab片段的作用机制。可通过被这些分子靶向的新的表位来测定本文所述Fab片段的这种独特性质。本文所用“GPVI耗尽表型”是指当抗体或抗原结合片段在血小板表面上与GPVI受体分子结合时，防止血小板上GPVI途径的活化的细胞状态。这种GPVI耗尽表型可取决于两种不同的机制(i)从细胞表面除去或耗尽GPVI受体，或者(ii)抗体或抗原结合片段以不可逆方式与GPVI受体分子结合，使得保持对受体的抑制持续细胞寿命。两种情况下的表型只有随血小板更新而逆转。这些抗GPVI Fab片段诱导GPVI耗尽表型的事实呈现功效方面的两个优势
i)如果受体脱落至少是该机制的部分，则该过程一般不依赖于Fab与GPVI结合。这就意味着如果一部分细胞表面GPVI被Fab占据(例如30%)可诱导脱落，则脱落过程不限于被Fab占据的30%的GPVI受体，而是还扩大到游离GPVI。这就意味着用显著较少的Fab可实现100%的GPVI封闭(通过耗尽)。ii)抑制作用具有长期作用已知Fab片段具有非常短的血浆半寿期，约为1-2小时，这对于其中靶标需要长久抑制的几种适应症可能是有问题的。至于所述受体的耗尽或不可逆占据的机制，该作用的持续时间(根据药效动力学性质)将与Fab的药代动力学性质无关联。这是因为血小板不能够置换被影响的受体，一旦诱导耗尽或不可逆抑制，则受体在血小板寿命内保持缺乏或不可获得。这相当于作用持续时间延长至数天，这取决于血小板的半寿期(人血小板为10天)。所有这些性质表明本发明的Fab是治疗栓形成疾病和血管疾病的合适的候选药物。基于抗体的生物学的重要靶标类别是可被单克隆抗体以高特异性封闭的膜受体。IgG形式的全长抗体通过其Fv部分结合并封闭其靶标。Fe部分向这些分子中加入其它功能，导致抗体衍生细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(⑶C)。这些活性常常是mAb作用方式(MoA)、尤其是肿瘤学应用的重要组成部分。然而，在其它应用领域，ADCC/⑶C活性不必减到最低或者不是必需的。因此，需要多种缺乏Fe部分的抗体片段，例如Fab分子。开发单价抗体片段的另一个原因来源于祀标生物学(target biology)。许多膜受 体在受体聚簇后开始信号转导Uf^BGPVI)。如果这类受体应被封闭，则单价抗体片段是精选的天然形式。对于许多临床应用而言，抗体片段例如Fab片段是比完整抗体适合得多的形式。这种优势取决于将其与完整抗体相区分来的Fab片段的若干独特性质，具体地说
-单价如果应避免分子的交联，则需要-缺乏Fe结构域如果Fe功能是不必要的或不需要的，则需要-低分子量测定药代动力学和药效动力学行为以及组织分布为了在给予患者后保持抗体Fab片段的这些所需性质，应避免Fab片段与非靶标分子的相互作用。如前所述，通过IgG分子重链的恒定结构域(Fe部分)的缺失获得Fab片段。遗憾的是，Fe的除去暴露出新的C端(或C端)肽，即新表位(neoepitope)。在人中能够与Fab片段的C末端特异性相互作用的一类特定的蛋白质已有报道，并被鉴定为针对抗体片段(例如 Fab)的预先存在的抗体(Kormeier 等(1968) J. Immunol. 100 (3) ; 612-21 ；Persselin 和 Stevens (1985) J. Clin. Invest. 76 ;723_30)。这些预先存在的抗体在生命早期形成，并且是患者依赖性的。至于作为新的治疗药的单克隆抗体和抗体片段的开发，预先存在的抗Fab抗体的存在出于上述原因限制并使治疗性Fab分子的使用复杂化。另外，如前所述，Fab的C末端是用于产生抗体的优选表位(Christopoulos C等，1994)。然而，即使在患者没有或有少量抗C端的预先存在的抗体的情况下，在给予治疗性Fab后可能出现针对该表位的新抗体的产生，导致对与预先存在的抗体所述一样的这种限制。实际上，治疗性Fab分子被抗Fab C端表位的预先存在的抗体或新的抗体结合可改变分子的药代动力学和药效动力学行为(例如受体活化而非抑制，根据从单价成为二价分子的变化)、产生新的复合物和功能(例如加入具有其所有效应子功能的抗体Fe部分)和改变复合物的大小，其也可具有组织分布的结果。因此，这种现象代表了需要避免的显著安全性和功效风险。为了避免这些限制，可按本发明对抗GPVI Fab分子的描述，通过在Fab的C末端添加分子来掩蔽被抗Fab抗体识别的新表位。这个原理对于开发全部治疗性抗体片段是必需的，其中靶标生物学防止使用二价分子(例如在受体通过聚簇活化的情况下)，因此严格需要利用单价分子。因此，为了能够对所有患者进行最安全的治疗，以及避免患者特异性药代动力学和药效动力学变异性，应对Fab分子进行修饰以掩蔽在C末端产生的Fab特异性新表位，所述表位可被预先存在的或新产生的抗Fab片段抗体识别。本发明涉及其中将分子加到C端的Fab片段。该分子可以是肽或任何其它分子类型，能够掩蔽表位但又不干扰Fab与靶标结合。在一个具体的实施方案中，能够掩蔽Fab片段的新表位的所述分子是可包含1-100个氨基酸、1-50个氨基酸、1-20个氨基酸、1-15个氨基酸或1_10个氨基酸的肽。例如，His标签、G4S或(G4S) 2序列段肽可构成合适的分子。
另一方面，本发明涉及在其重链C末端携带分子的Fab。在具体实施方案中，在其C末端携带分子的Fab片段特异性识别GPVI。在一个优选的实施方案中，在前述Fab片段中选择该Fab片段。在一个具体的实施方案中，Fab重链的序列相当于包含SEQ ID NO. 29或SEQ IDNO. 30 或 SEQ ID NO. 31 的序列。在另一个实施方案中，Fab重链的序列相当于存在于SEQ ID NO. 29或SEQ IDNO. 30 或 SEQ ID NO. 31 中的序列。本发明还涉及防止Fab片段被针对C末端的预先存在的抗体或新抗体识别的方法，所述方法在于通过加入分子来掩蔽C末端。因此，该分子可供防止不需要的Fab-抗体复合物的产生。本发明还涉及防止在使用抗GPVI Fab时血小板活化的方法，所述方法在于通过加入分子掩蔽Fab的C末端。另一方面，本发明涉及用于制备在其C末端携带分子的修饰的Fab的方法，所述方法包括以下步骤
a.将分子加到Fab的C末端
b.在合适的系统中产生修饰的Fab，包括在细菌、酵母或哺乳动物细胞系中
c.纯化修饰的Fab
可将所产生的Fab在合适的溶液中进一步配制。另一方面，本发明在于本发明说明书中描述的抗GPVI抗体、特是Fab片段，在治疗以下某些临床适应症时防止血栓形成事件中的用途例如急性冠状动脉综合征、经皮冠状动脉介入、缺血性中风、颈动脉狭窄或外周动脉闭塞性疾病。此外，它可用于预防再狭窄和动脉粥样硬化。本发明还涉及含有本发明的抗GPVI抗体，特别是Fab片段与合适赋形剂的组合物。该组合物可用于治疗血栓形成性疾病和血管疾病。另一方面，本发明涉及制备本发明的抗体的方法。在本发明的另一方面，抗体可用于诊断GPVI表达变化。已描述了血小板表面上GPVI表达的变化以及血浆中可溶性GPVI (GPVI的切割的胞外结构域)的出现和浓度与病理生理学状况(例如急性冠状动脉综合征、短暂性缺血发作或中风)可能极为相关(Bigalke B 等，Eur J Neurol. , 2009 年 7 月 21 日；Bigalke B.等，Semin ThrombHemost. 2007 年 3 月;33 ⑵:179-84)。因此，这些参数的测量可用来鉴定有前述病况风险、需要抗血栓形成治疗和对抗GPVI治疗可能特别敏感的患者。因此，本文所述抗体和抗体片段可用作确定血小板表面上以及血浆样品中GPVI的存在情况和数量变化的诊断工具和作为诊断试剂盒的组成部分。抗体及其片段可用来诊断可获益于抗血栓形成治疗的有风险的患者。用于诊断患者中GPVI变化的这种方法，可包 括(i)使所述患者的血小板或血浆样品与本发明的抗体或其Fab片段接触，(ii)测量所述抗体或Fab与存在于所述样品中的细胞的结合，和(iii)将步骤(ii)中测量的结合与正常参比受试者或标准的结合进行比较。本发明还包括检测人GPVI表达变化的诊断试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗体或其片段。在一个具体的实施方案中，本发明的试剂盒可作为ELISA测定试剂盒提供。在本发明的另一方面，针对在给予本发明的掩蔽Fab或其它抗体之前抗Fab抗体的存在情况筛选患者。本发明还提供制备本发明的抗GPVI抗体或Fab片段的方法，所述方法包括以下步骤
a.培养含有编码本发明的一个HC或HC片段和一个LC的DNA序列的细胞系
b.纯化在培养基中表达的抗体或Fab
c.以合宜的形式配制抗体
为了表达本发明的抗体，可以使用能够产生免疫球蛋白的任何表达细胞系。可以使用来源于哺乳动物的表达细胞系以及任何其它表达系统，例如酵母细胞(A. H. Horwitz等PNAS. 1988年 11 月；85(22) : 8678-82)或细菌细胞(Chiba Y, Jigami Y. Curr Opin ChemBiol. 2007 年 12 月；11(6) : 670-6)。可通过例如本领域技术人员已知的任何方法实现抗体的纯化。抗体的配制取决于这类抗体预期应用。根据应用，例如药物应用、兽医应用或诊断应用，可冻干或者不冻干、溶于合适的溶液。应注意的是，这种一般说明以及下面的详细说明只是示例性和说明性的，并且对于本发明不应是限制性的。说明书中包括的


了旨在解释本发明原理的几个本发明的实施方案。附图简述
图I :胶原结合的抑制，通过竞争ELISA。(A)针对hGPVI-Fc和(B)针对弥猴GPVI-Fc的剂量依赖性(IC50)。图2 :通过ELISA对针对人和灵长类动物GPVI选择的杂交瘤mAb进行交叉反应性分析。图3 :通过无花果蛋白酶切割来自杂交瘤克隆390的IgG产生的Fab。图4 :通过抗GPVI Fab片段(VLl与VH3)抑制胶原诱导的血小板聚集。图5 :表明在Fab和人GPVI胞外结构域蛋白之间的相互作用的晶体学数据。(A)GPVI蛋白的D2结构域和Fab之间的相互作用。(B)在GPVI蛋白的Dl结构域和Fab之间的相互作用。(C) GPVI蛋白的D1-D2结构域和Fab之间的相互作用。图6 :在胶原诱导的全血聚集中抗GPVI Fab片段抑制活性的IC50曲线的实例。
图7 :抗GPVI-Fab片段抑制流动中血栓形成的实例。图8 :抗GPVI Fab以浓度依赖性方式引起GPVI表面表达的降低。图9 :抗GPVI Fab以时间依赖性方式引起显著的GPVI耗尽。图10 -M GPVI Fab对离体全血血小板聚集的作用(激动剂1 μ g/ml)。A—在Img/kg IV推注给予后。B—在3 mg/kg IV推注给予后。图11 :全血血小板聚集测定中抗GPVI Fab的体外活性(激动剂1 μ g/ml)。图12 : IV推注给予抗GPVI Fab对血小板计数的作用。A — 3ml/kg的PBS溶媒(对照)之后。B—O. 01 mg/kg 的抗 GPVI FAb 之后。C一O. I mg/kg 的抗 GPVI FAb 之后。D—I mg/kg 的抗 GPVI FAb 之后。E—3 mg/kg 的抗 GPVI FAb 之后。
图13 :在iv给予抗GPVI Fab后，血小板上GPVI受体表达的FACS分析。垂直线把左侧GPVI阴性血小板与右侧GPVI阳性血小板分隔开来。A—给药前。B—给药后24小时。C一给药后48小时。D—给药后72小时。E—给药后150小时。图14 -M GPVI Fab对血小板活化的作用。在对照组图中，加入惊厥肽。组图A中，在IgG耗尽后加入Fab。在组图B中，加入修饰的Fab。图 15 =A-Fab 对照；B—Fab_His 标签；C—FabGly4Ser 和 Fab-(Gly4Ser) 2。图16 :除去20个残基信号序列的GPVI (对应于SEQ ID NO:32)。黑体残基表示与抗体CDR接触的构象表位。
实施例实施例I :GPVI的重组胞外Dl和D2结构域的产生 A—hGPVI-hFc融合表汰质粒(hGPVI-hFc)的构津
使用含有人cDNA的质粒作为PCR模板，扩增编码237个氨基酸残基重链恒定区(包括人免疫球蛋白IgG的铰链区、CH2和CH3结构域)的DNA片段。使用人基因组DNA作为PCR模板，扩增编码205个氨基酸残基人GPVI Dl和D2胞外结构域的DNA片段。该人GPVI Dl和D2片段包括信号序列，相当于野生型蛋白质(NP_057447/ Q9HCN6)的氨基酸M1-T205。将所得的编码人GPVI Dl和D2及人Fe区的扩增、切割和纯化的PCR产物通过连接PCR结合，并使用EcoRI和NotI位点，通过InFusion方法，连接至杆状病毒表达载体PVL1393中。所得的GPVI-Fc ORF被列为SEQ ID NO. 1，其相应的蛋白质序列被列为SEQ ID NO. 2。B—GPVI-tev-his 表达质粒(GPVI-tev-his)的构建
使用含有前述GPVI-Fc的质粒作为PCR模板，扩增人GPVI Dl和D2胞外结构域，其包括相当于野生型蛋白质(Swissprot Q9HCN6)中的氨基酸M1-T205的信号序列。反向引物含有编码tev切割识别序列和代表构建体C端的His标签的7个组氨酸残基的DNA。所得的扩增PCR片段用限制性内切核酸酶EcoRI + NotI切割，并连接至杆状病毒表达载体pVL1393中。所得ORF被列为SEQ ID NO. 3，其相应的蛋白质序列被列为SEQ ID NO. 4。C—hGPVI-hFc 和 GPVI-tev-his 蛋白的表汰和纯化
将生长在SF900 II无血清悬浮培养基(Invitrogen)中的SF9细胞用表达质粒和FlashBac 杆状病毒 DNA (Oxford Expression Technologies)共转染。使用 Cellfectin 转染试剂(Invitrogen)进行转染。5小时后，将5%总胎牛血清加入转染培养物中。将细胞在28°C下培养5天。含有重组病毒的培养上清液用于在含有5%胎牛血清的SF900 II悬浮培养基中进行较大规模的病毒扩增。对于蛋白质表达,将生长在ExCell 405 (SAFC)中的HighFive (Invitrogen)细胞用适量的病毒母液转导，并在27°C下培养72小时。在收获细胞培养物后，上清液经过滤澄清(O. 22 μ m)。对于纯化，在A蛋白基质(GE Healthcare)上俘获Fe-融合GPVI蛋白变体，并通过pH变化洗脱。采用Superdex 200 (GE Healthcare)通过SEC对蛋白质精加工(polish)和最终的超滤浓缩步骤后，蛋白质用于ELISA和进一步的测定。对于纯化，将有His标签的GPVI蛋白变体直接从上清液中俘获在IMAC基质(HisTrap, GE Healthcare)上，并通过咪唑(imidazol)梯度洗脱。使用 Superdex 75 (GE Healthcare)通过SEC对蛋白质精加工并超滤后，蛋白质用于所示的实验。实施例2 :功能性抗GPVI mAb的产生和选择 A—抗GPVI mAb的产生
采用 Kilpatrick 等人(1997. Hybridoma 16 :381389)描述的 RIMMS 方法，产生 GPVI特异性抗体。在14天进程中以3-4天的间隔，使6-8周龄雌性BALB/c小鼠(S082342 ；CharlesRiver Labs, Bar Harbor, ME)各接受4轮用纯化的可溶性有his标签的GPVI蛋白(按照实施例I所述制备)免疫。对于在第O天的第一次免疫,将在Titermax佐剂(TierMax Gold Adjuvant ；Sigma#T2684)中乳化的5 μ g抗原沿小鼠背部皮下给予接近引流淋巴结的6个部位。在RIBI佐剂(Sigma Adjuvant系统；Sigma #S6322)中乳化的另外5 μ g抗原沿腹部给予6个并列部位。以类似方式，在第4、7和11天给予加强免疫。最后一次注射后4天，处死小鼠。无菌分离出双侧胭淋巴结、浅表腹股沟淋巴结、腋窝淋巴结和肱(branchial)淋巴结，用新鲜RPMI培养基洗涤。从淋巴结释放出淋巴细胞，所得单一细胞悬液用RPMI培养基洗涤两次后，使用聚乙二醇将其与P3X63-AG8. 653骨髓瘤细胞融合。融合后，将细胞混合物在培养箱中于37°C温育16-24小时。将所得细胞制备物转移到选择性半固体培养基中，无菌铺板于100 mm培养皿中，在37°C下温育。开始选择后10天，针对杂交瘤生长对板进行检查，挑出可见集落，置于含有200μ L生长培养基的96孔板中。将96孔板保持在37 °C的培养箱中2_4天。B—识别人GPVI蛋白的mAb的筛选
使用GPVI-Fc融合蛋白(按照实施例I所述制备)作为俘获抗原，通过ELISA进行抗GPVI IgG产生的初步筛选。板用GPVI-Fc融合蛋白包被，将杂交瘤上清液加到板中，通过使用与辣根过氧化物酶(Sigma ；#A9044)缀合的兔抗小鼠IgG检测。通过加入TMB-H202缓冲液观测抗体结合，并在450 nm的波长下读数。在从96孔板选择的367个杂交瘤中，129个杂交瘤对抗人GPVI抗体产生是阳性的，然后111个在细胞扩增后得到证实。C一抗GPVI mAb阻断胶原与人GPVI结合的能力
在竞争ELISA结合测定法中，针对其阻断胶原与人GPVI-Fc融合蛋白结合的能力进行了二次筛选以表征所有人GPVI特异性mAb的功能性质。使用订制的胶原包被的96孔板(Pierce)。将人GPVI-Fc融合蛋白和杂交瘤上清液的预温育混合物加入板中，通过使用与辣根过氧化物酶(Sigma ；#A0170)缀合的山羊抗人IgG-Fc，检测胶原-人GPVI-Fc复合物。通过加入TMB-H202缓冲液观测抗体结合，并在450 nm的波长下读数。在100个GPVI结合杂交瘤中，22个杂交瘤阻断GPVI-Fc与胶原结合(阈值90%抑制)。采用如图IA所示的竞争ELISA测定法，证实预选择的mAb对人GPVI的阻断性质是剂量依赖性的。与通过使用小鼠IgG同种型测定试剂盒(SEROTEC ；#MMT1)测定的一样，所有拮抗剂mAb与IgGl K是同种型(数据未显示)。D—杭GPVI mAb的结合件质
通过表面等离振子共振(BIAcore 2000)进行最后一次筛选以评价GPVI封闭性抗体的结合性质。在该项分析中，我们评价了人GPVI蛋白与固定在共价连接CM芯片的抗Fe抗体
上的抗人 GPVI mAb 的相互作用。采用 Canziani 等，2004. Anal. Biochem. 325:301-307描述的方案，进行了各个mAb的结合动力学测定。所有封闭性mAb显示与人GPVI呈(亚)纳摩尔范围的亲和力(表I)。根据靶标亲和力，选择来自杂交瘤克隆390的抗体用于进一步开发。复I :选定的抗hGPVI mAb的亲和力和缔合速率/解离速率
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E—抗GPVI mAb与灵长类动物GPVI蛋白的交叉反应性性质
通过ELISA，针对其结合灵长类动物GPVI-Fc蛋白的能力，对表I列举的GPVI特异性mAb进行了评价。板用灵长类动物GPVI-Fc融合蛋白包被，将抗hGPVI mAb加入板中，用与辣根过氧化物酶(Sigma ；#A9044)缀合的兔抗小鼠IgG检测。通过加入TMB-H202缓冲液观测抗体结合，并在450 nm的波长下读数。通过在半固体培养基中培养，对预选择的杂交瘤进行克隆。以125个细胞/mL接种至培养皿中，针对GPVI结合、GPVI阻断活性和与灵长类动物GPVI的交叉反应性筛选显示显著生长的克隆。如图IB和图2所示，所有mAb均与灵长类动物GPVI交叉反应。用于灵长类动物(食蟹猴(lfecaca /kscicWaris或cynomolgus) GPVI的胞外结构域的序列如SEQ ID NO. 27和SEQ ID NO. 28所述。F—杭GPVI mAb的重链和轻链序列的测定
如下获得编码单克隆抗体可变结构域的cDNA :用来自Qiagen的Oligotex试剂盒，从杂交瘤细胞中提取mRNA。利用Gene Racer试剂盒(Invitrogen)、55 °C下的转录酶Superscript III (Invitrogen)和表 2 所述引物(RACEM0G1 或 CKF0R),通过 RACE 方法,经RT-PCR扩增相应的cDNA。用55°C下的聚合酶Phusion (Finnzymes)和亦在表2中描述的引物，通过PCR扩增cDNA片段。表2.用于RT-PCR和PCR的引物
权利要求
1.一种抗体Fab片段，其与人GPVI特异性结合并诱导GPVI耗尽表型。
2.权利要求I的抗体Fab片段，其中所述抗体Fab片段与人GPVI的构象表位结合，并接触包括Ser 43、Arg 67和Asp 81的人GPVI残基。
3.权利要求I或2的抗体Fab片段，其中所述Fab片段包含 (a)重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)，其具有由SEQID NO: 18、SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20限定的氨基酸序列；和 (b)轻链可变区(LCVR)的互补决定区(CDR)，其具有由SEQID NO:2U SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23限定的氨基酸序列；且 其中各CDR的至少2个氨基酸残基可变成另一个氨基酸残基而又不直接破坏与GPVI表位残基的接触。
4.权利要求1-3中任一项的抗体Fab片段，其中所述抗体Fab片段包含SEQID NO. 6的重链和SEQ ID NO. 8的重链或与这些序列有至少80%同一性的序列，只要保持抗体Fab片段结合特异性即可。
5.前述权利要求中任一项的抗体Fab片段，所述抗体Fab片段是人源化的。
6.权利要求5的抗体Fab片段，其中所述人源化Fab片段包含选自以下的重链可变区(HCVR)氨基酸序列和轻链可变区(LCVR)氨基酸序列的组合(a)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 10)；(b)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 11)；(c)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 12)；(d)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 13)；(e)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 14)；(f)LCVR (SEQ ID NO. 16)和 HCVR (SEQ ID NO. 11)；(g)LCVR (SEQ ID NO. 17)和 HCVR (SEQ ID NO. 11);和(h)LCVR (SEQ ID NO. 17)和 HCVR (SEQ ID NO. 13)。
7.—种经改造的Fab片段，其包含人源化重链(HC)氨基酸序列和人源化轻链(LC)氨基酸序列的组合，其中所述人源化重链还包含c端突出端，所述c端突出端包含额外的氨基酸残基，且其中所述c端突出端防止被抗Fab抗体识别。
8.权利要求7的经改造的Fab片段，其中所述c端突出端选自SEQID NO:35,SEQ IDNO:36 和 SEQ ID NO:37。
9.权利要求7或8的经改造的Fab片段，其中所述Fab片段如权利要求1_6中任一项所限定。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1-9中任一项限定的抗体Fab片段和药学上可接受的载体或赋形剂。
11.一种编码选自以下的多肽的多核苷酸SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 17或与这些序列有至少80%同一性的序列，只要所述多肽保持其结合特异性即可。
12.一种用于制备权利要求1-9中任一项限定的抗体Fab片段的方法，所述方法包括以下步骤a.培养表达权利要求1-9限定的抗体Fab片段的细胞系， b.纯化在培养基中表达的Fab片段， c.以合宜形式配制Fab片段。
13.权利要求1-9中限定的抗体Fab片段，其用于预防或治疗血栓形成性疾病和血管疾病。
14.一种用于防止抗体Fab片段被预先存在的抗体识别的方法，所述方法在于通过加入分子掩蔽抗体Fab片段的c末端。
15.一种用于防止在使用抗GPVI Fab时血小板活化的方法，所述方法在于通过加入分子掩蔽抗体Fab片段的c末端。
全文摘要
本发明公开了与人血小板膜蛋白糖蛋白VI(GPVI)特异性结合的新的抗体及其单价片段或衍生物。本发明的抗体是来自杂交瘤克隆390的能够诱导GPVI耗尽表型的抗体及其片段抗体。这些抗体和Fab片段能够阻断胶原结合，因此防止血小板被胶原活化。本发明还涉及用于产生所公开的抗体和Fab片段的杂交瘤克隆和表达质粒。本发明还涉及单价抗体片段在制备用于治疗血栓形成及其它血管疾病的研究试剂、诊断剂及免疫治疗剂中的用途。本发明还涉及在C末端携带分子的Fab，以及使用这类修饰的Fab防止Fab被抗体识别的方法。本发明涉及用于防止在使用抗GPVIFab时血小板活化的方法。
文档编号C07K16/28GK102725309SQ201080061679
公开日2012年10月10日 申请日期2010年12月17日 优先权日2009年12月18日
发明者B.卡梅伦, C.恩格尔, C.朗格, C.科维伊, E.劳, F.布朗什, I.福肯, J.克吕普, K.克鲁尔, M.洛伦茨, N.博兰, P.弗洛里安, P.沃内罗夫, T.兰格, T.达布杜比, V.米科尔 申请人:赛诺菲