用的。
[0115] 另外，本发明是设及将人Fc 丫 Rllla固定化于不溶性载体而得到的吸附剂的发明； 前述吸附剂特异地吸附抗体中的具有糖链的抗体，因此能够简便地识别糖链有无附加于抗 体，运样的识别到目前为止是困难的。另外，通过使用本发明的吸附剂能够特异地纯化具有 糖链的抗体，因此能够有效率地制造具有糖链的抗体。
【附图说明】
[0116] 图1是人化丫 Rllla的示意图。图中的数字表示序列号1中记载的氨基酸序列的号。 图中的S表示信号序列;EC表示细胞外区域;TM表示细胞膜贯穿区域;C表示细胞内区域。
[0117] 图2是表示对置换了 1个氨基酸的化结合性蛋白质的抗体结合活性进行了评价的 结果的图。图中的野生型表示没有氨基酸置换的Fc结合性蛋白质。
[0118] 图3是表示对置换了 1个氨基酸的化结合性蛋白质的热稳定性进行了评价的结果 的图。图中的野生型表示没有氨基酸置换的Fc结合性蛋白质。
[0119] 图4是表示使用了FcR5a固定化凝胶的抗体的洗脱的色谱图。图中的Fr表示回收的 级分的位置。
[0120] 图5是表示附加于抗体的糖链结构的列表的图。图中的N1至N8对应于表10的N1至 N8; Ml和M2对应于表11的Ml和M2。
[0121] 图6是表示使用了化R5a固定化凝胶的抗体纯化的结果的图（SDS-PAGE)。分别地， (A)表示人IgGl的纯化结果；（B)表示人IgG3的纯化结果。
[0122] 图7是具有糖链的人IgGl (有糖链的人IgGl)与去除了糖链的人IgGl (去除糖链的 人IgGl)利用SDS-PAGE比较了分子量的图。图中的泳道（1)是具有糖链的人IgGl;泳道(2)是 去除了糖链的人IgGl。
[0123] 图8是将具有糖链的人IgGl和去除了糖链的人IgGl与人Fc 丫 RlllaW及蛋白A的结 合性进行了比较的图。(A)是人FcyRIIIa的结果；（B)是蛋白A的结果。
[0124] 图9是对于具有糖链的人IgGl和去除了糖链的人IgGl用本发明的吸附剂进行了分 离的结果。（1)是具有糖链的人IgGl的结果；（2)是去除了糖链的人IgGl的结果。
【具体实施方式】
[0125] 实施例
[0126] W下，为了对本发明进一步详细地进行说明示出了实施例，本发明并不限定于实 施例。
[0127] 实施例1化结合性蛋白质或人化丫 RIIla表达载体的制备
[012引（1)基于从序列号1中记载的人化丫 Rllla氨基酸序列中的第17位的甘氨酸(Gly) 至第192位的谷氨酷胺(Gin)为止的氨基酸序列，使用DNAworks法(Nucleic Acids Res.， 30，e43,2002)，设计将密码子由人型转换成大肠杆菌型的核巧酸序列。将设计的核巧酸序 列示于序列号2。
[0129] (2)为了制备包含序列号2中记载的序列的多聚核巧酸，合成包含序列号3至20中 记载的序列的寡核巧酸，使用前述寡核巧酸，进行下述所示的二阶段PCR。
[0130] (2-1)第一阶段的PCR:制备表1所示的组成的反应液，对该反应液在98°C下进行5 分钟热处理之后，在98°C下进行10秒的第1步骤、在62°C下进行5秒的第2步骤、在72°C下进 行90秒的第3步骤，将运3步骤作为1个循环的反应重复进行10个循环，合成多聚核巧酸，将 其作为化化1。需要说明的是，表1中的DNA混合物是指将具有序列号3至20中记载的序列的 18种寡核巧酸分别采集一定量进行混合而成的溶液。
[0131] [表 1]
[0132]
[0133] (2-2)第二阶段的PCR: W(2-l)中合成的FcRpl作为模板、将具有序列号21(5'- TAGCCATGGGCATGCGTACCGAAGATCTGCCGAAAGC-3'）和序列号 22(5'- CCCAAGCTTAATGATGATGATGATGATGGCCCCCTTGGGTAATGGTAATATTCACGGTCTCGCTGC-3'）中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物进行实施。具体而言，制备表2所示组成的反应液，对该反应 液在98°C下进行5分钟热处理之后，在98°C下进行10秒的第1步骤、在62°C下进行5秒的第2 步骤、在72°C下进行1.5分钟的第3步骤，将运3个步骤作为1个循环的反应重复进行30循环 来头施。
[0134] [表 2]
[0135] _
[0136] ~(3)对(2)中得到的多聚核巧酸进行纯化，用限制酶Ncol和化ndin进行消化之后/ 与预先用限制酶化〇1和化ndin进行了消化的表达载体祀TMa化（日本特开2011-206046号 公报)连接，使用该连接产物转化大肠杆菌化21株(呢3)。
[0137] (4)对得到的转化体用包含50yg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养之后，使用 QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制），提取表达载体祀T-eFcR。
[0138] (5)在(4)中制备的表达载体祀T-eFcR中的编码人化丫 Rllla的多聚核巧酸及其周 边的区域中，基于链终止法而使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing ready Reaction kit(The;rmo Fisher Scientific Inc.制）供于循环测序反应，利用全自动DNA sequencer ABI Prism 3700 DNA analyzer(Thermo Fisher Scientific Inc.制闲核巧 酸序列进行解析。需要说明的是，进行该解析时，使用具有序列号2 3 ( 5 ' - TAATACGACTCACTATAGGG-3 '）或序列号24 (5 ' -TATGCTAGTTATTGCTCAG-3 '）中记载的序列的寡 核巧酸作为测序用引物。
[0139] 分别地，将表达载体pET-eFcR表达的多肤的氨基酸序列示于序列号25中；将编码 该多肤的多聚核巧酸的序列示于序列号26中。需要说明的是，序列号25中，第1位的甲硫氨 酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲 硫氨酸(Met)为止为连接子序列;第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 人化丫 Rllla的细胞外区域(序列号1的第17位至第192位为止的区域）；第209位至第210位 为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。
[0140] 实施例2向化结合性蛋白质导入突变W及基因文库的制备
[0141] 对于实施例1中制备的化结合性蛋白质表达载体祀R-eFcR中的编码化结合性蛋白 质的多聚核巧酸部分，通过易错PCR随机地实施突变导入。
[0142] (1)作为模板使用实施例1中制备的祀T-eFcR进行易错PCR。易错PCR如下进行:在 制备表3所示的组成的反应液之后，将该反应液在95°C下进行2分钟热处理、在95°C下进行 30秒的第1步骤、在60°C下进行30秒的第2步骤、在72°C下进行90秒的第3步骤，将运3步骤作 为1个循环的反应进行35循环，最后在72°C下进行7分钟热处理。通过前述易错PCR对编码化 结合性蛋白质的多聚核巧酸良好地导入突变，其平均突变导入率为1.26%。
[0143] [表 3]
[0144]
[0145] ~(2)对（1)中得到的PCR产物进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行消化，与' 预先用相同限制酶消化了的表达载体祀TMalE(日本特开2011-206046号公报)连接。
[0146] (3)连接反应结束之后，通过电穿孔法将反应液导入至大肠杆菌化2UDE3)株，用 包含50yg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养(37°C下18小时）之后，将形成于平板上 的菌落作为随机突变体基因文库。
[0147] 实施例3热稳定化Fc结合性蛋白质的筛选
[0148] (1)将实施例2中制备的随机突变体基因文库(转化体)接种于包含50yg/mL的卡那 霉素的2YT液体培养基(蛋白腺16g/L、酵母提取物lOg/L、氯化钢5g/L)200化，使用96孔深孔 平板在30°C下振荡培养一晚。
[0149] (2)培养之后，将扣L的培养液继续植入50化L的包含0.05mM的IPTG(isopropyl-f3- D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖巧）、0.3%的甘氨酸和50yg/mL的卡那 霉素的2YT液体培养基中，使用96孔深孔平板，进一步在20°C下振荡培养一晚。
[0150] (3)培养之后，将通过离屯、操作得到的培养上清用包含150mM的氯化钢的20mM的 Tris盐酸缓冲液(PH7.4)稀释2倍。对于稀释后的溶液，在45°C下进行10分钟热处理。
[0151] (4)对于（3)的进行了热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性、W及（3)的没 有进行热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，分别用下述所示的ELISA法进行测定， 将进行了热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除W没有进行热处理时的Fc结合性 蛋白质的抗体结合活性，从而计算出残留活性。
[0152] (4-1)将作为人抗体的丫-球蛋白制剂（The 化emo-Sero-Therapeutic Research Insti化te制）W化g/孔固定化(4°C下18小时)于96孔微孔平板的孔，固定化结束后，利用包 含2%(w/v)的SKIM MILK(抓公司制)和150mM的氯化钢的20mM的Tris盐酸缓冲液(PH7.4)进 行封闭(blocking)。
[0153] (4-2)用洗涂缓冲液(包含0.05%[w/v]的Tween 20、150mM的化Cl的20mM Tris- HCl缓冲液(pH7.4))进行洗涂之后，添加评价抗体结合活性的包含化结合性蛋白质的溶液， 使Fc结合性蛋白质与固定化Y-球蛋白反应(30°C下1小时）。
[0154] (4-3)反应结束后，用前述洗涂缓冲液进行洗涂，Κ?(Κ)μLν孔添加稀释至l(K)ng/mL 的Anti-6His抗体(Bethyl Laboratories公司制）。
[0155] (4-4)30°C下使之反应1小时，用前述洗涂缓冲液进行洗涂之后，W50化/孔添加 TMB化roxidase Substrate化化公司制）。通过W50化/孔添加1M的憐酸来停止显色，用酶 标仪(Tecan Japan制）测定450nm的吸光度。
[0156] (5)用(4)的方法对约2700株的转化体进行评价，从中选择表达与野生型（没有氨 基酸置换)Fc结合性蛋白质相比较热稳定性提高了的Fc结合性蛋白质的转化体。对于前述 选择的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制）制备表达载体。
[0157] (6)对于得到的表达载体中所插入的编码化结合性蛋白质的多聚核巧酸区域的序 列，通过与实施例1(5)的记载同样的方法解析核巧酸序列，从而确定氨基酸的突变位点。
[0158] (5)中选择的转化体表达的化结合性蛋白质的、相对于野生型（没有氨基酸置换） 化结合性蛋白质的氨基酸置换位点W及热处理后的残留活性（％ )总结示于表4中。包含序 列号1中记载的氨基酸序列中的第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基 并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生MetlSArg(该标记表示序列号1的第18位 的甲硫氨酸置换为精氨酸，W下同样）、Val27Glu、Phe29LeuJhe29Ser、Leu30Gln、 Tyr35Asn、Tyr35Asp、Tyr35Ser、Tyr35His、Lys46Ile、Lys46Thr、Gln48His、Gln48Leu、 Ala50His、Tyr51Asp、Tyr51His、Glu54Asp、Glu54Gly、Asn56Thr、Gln59Arg、Phe61Tyr、 Glu64Asp、Ser65Arg、Ala71Asp、Phe75Leu、Phe75Ser、Phe75Tyr、Asp77Asn、Ala78Ser、 Asp82Glu、Asp82Val、Gln90Arg、Asn92Ser、Leu93Arg、Leu93Met、Thr95Ala、T'hr95Ser、 Leull0Gln、Argll5Gln、Trpll6LeuJhell8Tyr、Lysll9Glu、Glul20Val、Glul21Asp、 Glul21Gly、Phel51SerJhel51Tyr、Serl55Thr、Thrl63Ser、Serl67Gly、Serl69Gly、 Phel71Tyr、Asnl80Lys、Asnl80Ser、Asnl80Ile、Thrl85Ser、Glnl9 化 ys 的至少任一种氨基酸 置换的Fc结合性蛋白质与野生型的Fc结合性蛋白质相比较，可W说热稳定性提高了。
[0159] [表 4]
[0160]
[0161]将表4所示的进行了氨基酸置换的Fc结合性蛋白质中残留活性最高的产生了 化127G1U和Tyr35Asn的氨基酸置换的化结合性蛋白质命名为FcR2,将包含编码化R2的多聚 核巧酸的表达载体命名为祀T-FCR2。将化R2的氨基酸序列示于序列号27,将编码化R2的多 聚核巧酸的序列示于序列号28。需要说明的是，序列号27中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26 位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为 止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为化R2的氨基酸 序列（相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位为止的甘氨酸 (Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序列号27中，分 别地、化127G1U的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位的位点。
[0162] 实施例4氨基酸置换化结合性蛋白质的制备
[0163] 通过累积实施例3中判明的、与Fc结合性蛋白质的热稳定性提高相关的氨基酸置 换，谋求进一步的稳定性提高。置换氨基酸的累积主要使用PCR进行，制备W下(a)至(g)所 示的巧中Fc结合性蛋白质。
[0164] (a)对于化R2进一步进行了化e7化eu的氨基酸置换的化R3
[01化](b)对于化R2进一步进行了化e7化eu和Glul21Gly的氨基酸置换的化R4
[0166] (C)对于化34进一步进行了 Asn92Se;r的氨基酸置换的化尺5曰
[0167] (d)对于化R4进一步进行了 Glu54Asp的氨基酸置换的化R5b [016引 （e)对于化R5a进一步进行了 Glu54Asp的氨基酸置换的化R6a
[0169] (f)对于化R加进一步进行了 Glul2(Wal的氨基酸置换的化R6b
[0170] (g)对于化R&i进一步进行了 Glul2(Wal的氨基酸置换的化R7
[0171] W下，对于各化结合性蛋白质的制备方法详细地进行了说明。
[0172] (a)FcR3从实施例3中已经明确的、设及热稳定性提高的氨基酸置换中选择 Val27Glu、Tyr35Asn和化e7化eu，从而制备野生型的化结合性蛋白质中累积了运些置换的 FcR3。具体而言，对于编码FcR2的多聚核巧酸进行产生Phe75Leu的突变导入，从而制备 FcR3〇
[0173] (a-l)W实施例3中取得的祀T-FcR2为模板实施PCR。该PCR中的引物使用具有序列 号24和序列号29(5 ' -AGCCAGGCGAGCAGCTACCTTAT TGATGCG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸。 PCR如下进行：制备表5所示组成的反应液之后，对该反应液在98°C下进行5分钟热处理，98 °C下进行10秒的第1步骤、55°C下进行5秒的第2步骤、72°C下进行1分钟的第3步骤，将运3步 骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72°C下进行7分钟热处理。将扩增的PCR产物供于 琼脂糖凝胶电泳，从该凝胶中使用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN制)进行纯化。将 纯化的PCR产物作为m3F。
[0174] 敵]
[0175]
[0176] (a-2)将实施例3中取得的pET-FcR2作为模板、将具有序列号23和序列号30(5'- CCACCGTCGCCGCATCAATAAGGTAGCTGC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此W外， 与(曰-1)同样地进行。将纯化的PCR产物作为m3R。
[0177] (a-3)将(a-1)和(a-2)中得到的巧巾PCR产物(m3F、m3R)混合，制备表6所示组成的 反应液。进行如下PCR:对该反应液在98°C下进行5分钟热处理之后，98°C下进行10秒的第1 步骤、55°C下进行5秒的第2步骤、72°C下进行1分钟的第3步骤，将运3步骤作为1个循环的反 应进行5循环，从而得到连接了 m3F和m3R的PCR产物m化。
[017 引[表 6]
[0179]
[0180] (a-4)将(a-3)中得到的PCR产物m化作为模板，将具有序列号23和序列号24中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物，进行PCRdPCR如下进行：制备表7所示组成的反应液之后， 对该反应液在98°C下进行5分钟热处理，在98°C下进行10秒的第1步骤、在55°C下进行5秒的 第2步骤、在72°C下进行1分钟的第3步骤，将运3步骤作为1个循环的反应进行30循环。由此 制备编码对FcR2导入了 1位点氨基酸置换的FcR3的多聚核巧酸。
[0181] [表 7]
[0182] _
[0183] ~(a-5)对(a-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行' 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0184] (a-6)对得到的转化体用添加了 5(nyg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从 回收的菌体(转化体）中提取质粒，从而得到包含编码化R3的多聚核巧酸的质粒祀T-FCR3， 所述FcR3是对野生型Fc结合性蛋白质进行了 3位点氨基酸置换的多肤。
[0185] (a-7)按照与实施例1(5)同样的方法进行祀T-FCR3的核巧酸序列的解析。
[0186] 将附加了信号序列和聚组氨酸标签的化R3的氨基酸序列示于序列号31、将编码前 述化R3的多聚核巧酸的序列示于序列号32。需要说明的是，序列号31中，第1位的甲硫氨酸 (Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲硫 氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 FcR3的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位为 止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序列 号31中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位、 化e7化eu的亮氨酸存在于第91位的位点。
[0187] (b)FcR4从实施例3中已经明确的、设及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置 换中选择化127Glu、Tyr35Asn、化e7化eu和Glul21Gly，从而制备野生型的化结合性蛋白质 中累积了运些置换的化R4。具体而言，通过对编码化R2的多聚核巧酸进行产生化e7化eu和 Glul21Gly的突变导入来制备FcR4。
[018引（b-1)用与(a-1)同样的方法得到PCR产物m3F。另外，将实施例3中取得的、表达包 含Ala71Asp、Phe75Leu和Glul21Gly的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质（表4)的质粒作为模 板，将具有序列号24和序列号29中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与(a-1)同样 的方法进行PCR，从而得到PCR产物m4R。
[0189] (b-2)将由（b-1)得到的巧帕CR产物(m3F、m4R)进行混合之后，按照与(a-3)同样的 方法进行PCR，将m3F和m4R连接。将得到的PCR产物作为m4p。
[0190] (b-3)将(b-2)中得到的PCR产物m4p作为模板、将具有序列号23和序列号24中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码化R4的多 聚核巧酸。
[0191] (b-4)对(b-3)中