用于鉴定布罗莫结构域抑制化合物的融合蛋白和方法
【专利说明】用于鉴定布罗莫结构域抑制化合物的融合蛋白和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求2013年3月15日提交的美国申请系列第61/798,644号和2013年11 月11日提交的美国申请系列第61/902,690号的优先权的权益，所述申请通过引用并入本 文。
[000引背景
[0004] 染色质是DNA与蛋白质的复杂组合。其在真核细胞的细胞核内被发现并且被分为 异染色质(凝聚的）和常染色质（展开的）形式。组蛋白是染色质的主要蛋白质组分，用作DNA 围其缠绕的线轴。染色质的功能是将DNA包装成更小的体积W容纳进细胞，增强DNAW使得 能够进行有丝分裂和减数分裂，W及用作控制表达和DNA复制的机构。染色质结构由一系列 对组蛋白尤其是组蛋白H3和H4的翻译后修饰（最常见地在延伸至核屯、核小体结构外部的 "组蛋白尾"内）控制。组蛋白尾易于释放出来参与蛋白质间相互作用，并且也是最易受到翻 译后修饰的组蛋白的部分。运些修饰包括乙酷化、甲基化、憐酸化、泛素化、SUMO化。运些表 观遗传标志物通过特殊酶书写和删除，所述酶将标签置于组蛋白尾内的特定残基上，从而 形成表观遗传密码，所述密码随后由细胞解释W允许染色质结构的基因特异性调控，并从 而允许转录。
[0005] 在所有种类的蛋白质中，组蛋白是其中最易于受到翻译后修饰的。组蛋白修饰是 动态的，因为它们可响应于特定刺激而被添加或除去，并且运些修饰指导染色质的结构变 化和基因转录的变化。不同种类的酶，即组蛋白乙酷基转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酷基酶 化DAC)，使特定的组蛋白赖氨酸残基乙酷化或去乙酷化(Str化1 K.，Genes Dev.，1989，12， 5,599-606)〇
[0006] 组蛋白的共价修饰是基因表达的基本控制机制，和在真核细胞中起作用的主要表 观遗传机制之一化ouzarides,Cell ,128,693-705(2007))。因为不同的转录状态确定基本 细胞过程，诸如细胞类型规范、谱系定型、细胞活化和细胞死亡，所W它们的异常调控是一 系列疾病的核屯、（Medzhi to V等，Nat. Rev . Immunol. ,9,692-703(2009); Porte la等， Nat.Biotech. ,28,1057-1068(2010))。基因表达的表观遗传控制的基本组成部分是具有结 合于此类修饰的专口基序的蛋白质对组蛋白修饰的解释。其中，布罗莫结构域已演化来结 合于乙酷化组蛋白并且通过运样做，他们代表了染色质结构与基因转录之间的根本联系 (Fi 11 ipakoppou 1OS等，Ce 11，149，214-231 (2012))。
[0007] 布罗莫结构域，其长度约为110个氨基酸，在大量染色质结合蛋白中均有发现，并 且已在约70种人蛋白质中被鉴定，通常与其它蛋白质基序相邻(Jea皿ougin F.等，Trends Biochem.Sci. ,1997,22,5,151-153;和 Tamkun J.W.等，Cell ,1992,7,3,561-572)。布罗莫 结构域与经修饰的组蛋白之间的相互作用可W是染色质结构变化和基因调控背后的重要 机制。含布罗莫结构域的蛋白质已牵设疾病过程包括癌症、炎症和病毒复制。参见，例如， Prinjha等，Trends 陆arm.Sci. ,33(3): 146-153(2012)和Muller等，Expert Rev. ,13(29): 1-20(2011年9月）。
[0008] 细胞类型特异性和适当的组织功能性需要最终受它们的环境影响的不同转录程 序的严格控制。对该转录稳态的改变与许多疾病状态直接相关，最特别地是癌症、免疫炎 症、神经性障碍和代谢疾病。布罗莫结构域存在于用于控制独特的疾病相关转录途径的关 键染色质修饰复合物内。运通过含有布罗莫结构域的蛋白质中的突变与癌症W及免疫及神 经功能障碍相关的观察得W突显。因此，跨家族的布罗莫结构域的选择性抑制为作为人功 能障碍的新型治疗剂创造各种机会。
[0009] 存在对癌症、免疫性病症和其它布罗莫结构域相关疾病的治疗的需要。运样，需要 用于鉴定为布罗莫结构域抑制化合物的化合物的方法。
[0010] 本文中引用的所有参考资料，包括专利申请和出版物通过引用整体并入。
[00川概述
[0012] 本文中提供了包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融合蛋白和 其使用方法。本发明的一个方面是包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融 合蛋白，其中多个融合蛋白能够再定位和/或形成斑。
[0013] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，融合蛋白包含含有至少一个染色质结合模块 的第一染色质结合多肤，其中所述第一染色质结合多肤的染色质结合模块的至少一个已被 缺失、被第二染色质结合多肤的至少一个染色质结合模块取代和/或替代。在某些实施方案 中，融合蛋白包含含有至少一个染色质结合模块的第一染色质结合多肤，其中所述第一染 色质结合多肤的染色质结合模块的至少一个已被第二染色质结合多肤的至少一个布罗莫 结构域模块替代。
[0014] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，融合蛋白包含1、2、3、4、5和/或6个染色质结 合模块中的约任一个。
[0015] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述报告模块是巧光报告模块。在某些实施 方案中，所述报告模块包括EGFP、TurboGFP、dsRed2、dsRed-Express2或ZsGreen。
[0016] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述融合蛋白包含核定位信号(NLS)。在某些 实施方案中，所述化S是SV40大T-抗原化S或核浆素的化S。
[0017] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述染色质结合模块位于报告模块的5'。在 任何融合蛋白的某些实施方案中，所述染色质结合模块位于报告模块的3'。
[0018] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述染色质结合模块是布罗莫结构域模块， P皿指模块、染色质域模块、MBT结构域模块、tudor结构域模块、PWWP结构域模块、A孤结构域 模块、Zf-CW结构域模块、错蛋白重复模块或WD40模块。在某些实施方案中，所述染色质结合 模块是布罗莫结构域模块。
[0019] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构域模块包含BRG1、 PCAF/KAT2B、BAZ2B、B畑1、B畑8、BRFP1、BRFP3、BRG1、CBP/CREBBP、PCAF/KAT2B、TRIM24和/或 ZMYND8的任一个的至少一个布罗莫结构域。在某些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构 域模块包含B畑2、B畑3、B畑4、BRD9、B畑T和/或BRG1的任一个的至少一个布罗莫结构域。在 某些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构域模块包含81?61、81?^1八60?2、？〔4。和/或了八尸1 的任一个的至少一个布罗莫结构域。在某些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构域模块 包含BRD4和/或BRD9的至少一个布罗莫结构域。
[0020] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述布罗莫结构域多肤包含BRGUPCAF/ ZMYND8的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。在某些实施方 案中，布罗莫结构域多肤包含BRD2、B畑3、BRD4、B畑9、BRDT和/或服G1的任一个或包含至少 一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述布罗莫结构域多 肤包含81?61、81?^1^60?2、？〔4。和/或了4。1的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块的 其片段的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述布罗莫结构域多肤包含服D4和/或服D9或包 含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述布罗莫结 构域多肤包含全长布罗莫结构域多肤。
[0021] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，融合蛋白能够多聚化。在某些实施方案中，融 合蛋白能够形成二聚体、Ξ聚体或四聚体。在某些实施方案中，融合蛋白能够形成二聚体。 在某些实施方案中，融合蛋白能够形成四聚体。
[0022] 本发明的一个方面是编码本文所述融合蛋白的核酸序列（例如，DNA或RNA)。本发 明的一个方面是包含所述核酸序列的表达盒。本发明的一个方面是包含所述表达盒的细 胞。
[0023] 本发明的一个方面是包含本文所述融合蛋白的细胞。
[0024] 在某些实施方案中，所述细胞是C册-KUC0S-7、肥K293、肥K293T、肥K293FT、HeLa、 MDCK或U20S细胞。在某些实施方案中，所述细胞是COS-7、化La或U20S细胞。
[0025] 本发明的一个方面是用于确定测试化合物是否是布罗莫结构域抑制化合物的方 法，所述方法包括(a)将包含含有至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融合蛋 白的本文所述细胞与所述测试化合物接触和(b)确定所述测试化合物是否诱导融合蛋白的 再定位和/或增加融合蛋白斑的形成，其中融合蛋白的再定位和/或斑的形成的增加表明所 述测试化合物是布罗莫结构域抑制化合物。
[0026] 本发明的一个方面是包含本文所述融合蛋白、核酸、表达盒或细胞的试剂盒。
[0027] 附图简述
[0028] 图1描绘本发明的某些融合蛋白。
[0029] 图2描绘显示当报告模块包含可形成多聚体(例如，二聚体或四聚体）的蛋白质时 融合蛋白响应于抑制剂而形成点/斑。
[0030] 图3描绘ZsGreen-BRD4融合蛋白（A)和在两个布罗莫结构域模块中具有阻止与染 色质结合的点突变的ZsGreen-BRD4融合蛋白（B)的定位。突变型ZsGreeen-BRD4融合蛋白即 使在抑制剂不存在的情况下亦被定位至细胞核中的点/斑块中（图3B)，而野生型融合蛋白 在相同条件下显示弥散定位(图3A)。
[0031] 图4描绘显示抑制化合物阻止布罗莫结构域结合染色质（其利用化echst 33342来 进行染色）的其它结果。
[0032] 图5描绘显示融合蛋白再定位的快速动力学的结果。可通过随后斑形成来实时监 测抑制剂的作用。
[0033] 图6描绘显示再定位和斑形成是可用于测定细胞环境中抑制剂的效力的可滴定表 型的结果。
[0034] 图7呈现关于响应于抑制剂的斑形成的可能机制的一个非限制性模型。
[003引图8A-B描绘在B畑2、BRD3、BRD4和B畑T布罗莫结构域抑制化合物JQ1不存在(A)和 存在(B)的情况下ZsGreen-BRD2融合蛋白的定位。JQ1处理导致ZsGreen-BRD2融合蛋白与染 色质的相互作用的破坏和点/斑的形成。
[0036] 图9A-B描绘在JQ1不存在(A)和存在(B)的情况下ZsGreen-BRD3融合蛋白的定位。 JQ1处理导致ZsGreen-B畑捕虫合蛋白与染色质的相互作用的破坏和点/斑的形成。
[0037] 图10A-B描绘在服D9布罗莫结构域抑制化合物抓i-B和抓i-C不存在(A)和存在(B) 的情况下BRD9-ZsGreen融合蛋白的定位。抑制剂处理导致BRD9-ZsGreen融合蛋白与染色质 的相互作用的破坏和点/斑的形成。
[0038] 图11A-B描绘BRD9-ZsGreen融合蛋白（A)和在布罗莫结构域模块中具有阻止与染 色质结合的点突变(N216Y)的BRD9-ZsGreen融合蛋白（B)的定位。缺少对染色质的结合亲和 力的突变型BRD9-ZsGreen即使在染色质抑制化合物不存在的情况下亦形成巧光点。
[0039] 图12A-D描绘使用DMSO(A)和BRD9布罗莫结构域抑制化合物BDi-D(B)的BRD9- mVenus融合蛋白的定位，和在布罗莫结构域模块中具有阻止与使用DMSO(D)处理的染色质 (C)的结合的点突变(N216Y)的突变型BRD9-mVenus的定位。布罗莫结构域抑制化合物和布 罗莫结构域突变都不导致巧光点/斑的形成。
[0040] 图13A-C描绘在CECR2布罗莫结构域抑制化合物BDi-E不存在(A)和存在(B)的情况 下化S-CECR2.BD-ZsGreen融合蛋白的定位。BDi-E处理导致当不结合于染色质时化S- CECR2.抓-ZsGreen斑的形成。
[0041] 图14描绘显示其它检测方法(其包括生物化学法诸如使用分级分离和免疫印迹） 的结果。
[0042] 图15A-B描绘在TAF1布罗莫结构域抑制化合物BDi-F不存在(A)和存在(B)的情况 下化S-TAF1. BD1. BD2-ZsGreen的定位。结果显示抑制剂破坏融合蛋白与染色质的结合，并 且融合蛋白在从染色质释放后形成斑。
[0043] 图16描绘在两个布罗莫结构域内都具有阻止对染色质结合的点突变的突变型 化S-TAF1.抓1.抓2-ZsGreen蛋白的定位(A)。结果显示即使在抑制化合物不存在的情况下 突变型融合蛋白亦形成斑(B)。
[0044] 图17A-B描绘在BAZ^布罗莫结构域抑制化合物BDi-G不存在(A)和存在(B)的情况 下BAZ2B-B畑9-ZsGreen融合蛋白（其中B畑9布罗莫结构域模块已被842沈的布罗莫结构域 模块替代的B畑9布罗莫结构域多肤）的定位。抓i-G处理导致BAZ2B-B畑9-ZsGreen融合蛋白 与染色质的相互作用的破坏和点/斑的形成。
[0045] 图18描绘在PCAF布罗莫结构域抑制化合物BDi-H不存在(A)和存在(B)的情况下， PCAF-BRD9-ZsGreen融合蛋白（其中BRD9布罗莫结构域模块已被PCAF的布罗莫结构域模块 取代的BRD9布罗莫结构域多肤）的定位。抓i-H处理导致PCAF-BRD9-ZsGreen融合蛋白与染 色质的相互作用的破坏和点/斑的形成。
[0046] 详述
[0047]本发明的某些方面设及包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融 合蛋白，其中多个融合蛋白能够形成斑。运些融合蛋白可用于确定测试化合物是否是染色 质抑制化合物。本发明的某些实施方案提供利用所述融合蛋白确定测试化合物是否是染色 质抑制化合物的测定。虽然不必是本发明的限制，但据信在未处理状态下，融合蛋白通过染 色质结合模块与染色质之间的相作用结合染色质。例如，布罗莫结构域模块结合于乙酷化 染色质。当所述染色质结合模块结合位点被抑制剂阻断时，所述融合蛋白与染色质解离并 形成斑。细胞祀标衔接测定可用于监测w剂量依赖性方式进行的斑的形成。细胞核中的斑 可使用例如巧光检测，通过高容量显微镜来可视化和定量，W测定测试化合物作染色质抑 制化合物的效力。
[004引一般技术
[0049] 本发明的实践，除非另有说明，否则将使用分子生物学（包括重组技术）、微生物 学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域普通技术人员的能力范 围内。此类技术在文献中被全面解释，诸如"Molecular Cloning:A LaboratoiT Manual"， 第二版（Sambrook等，1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Μ. J. Gait,编辑，1984); "Animal Cell Culture"(R. I.Freshney，编车茸，1987);"Methods in Enzymology" (Academic Press,Inc.);"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel等， 编辑，1987,和定期更新）；''PCR:The Polymerase 畑 ain Reaction", (Mullis 等，编辑， 1994);"A Practical Guide to Mole州lar Cloning"(Perbal Bernard V.,1988)。
[0050] 可使用本领域中已知的标准技术产生本发明中使用或描述的寡核巧酸、多核巧 酸、肤、多肤和小分子。
[0051 ]