利用酪氨酸酶制备的儿茶酚型结构物质、其制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及利用具有广的基质特异性的酪氨酸酶(tyrosianse)以高的生产率和收率筛选性地从多种单酸型结构物质(monophenolic compounds)仅生成儿茶酸型结构物质的方法。由此，本发明可实现利用酶反应的功能性儿茶酚型结构物质的批量生产，且可适用于原料化及医疗用产品生产。
【背景技术】
[0002]据报告，很多儿茶酸型结构物质(catechol derivatives)在抗氧化、抗癌、抗炎症或抗病毒等效果中呈现好的生理活性，与单酸型结构物质(monophenolic compounds)相比，其效果更高。尤其，儿茶酚型结构物质作为酪氨酸酶(tyrosinase)的抑制剂利用，并具有减少基于酪氨酸酶的黑色素(melanin)的生产的效果。并且，众所周知，在大豆甙元((^1(^6；[11，来源于大豆的异黄酮)中，特异性地实现邻轻基化(ortho-hydroxyIat1n)的3 ’ -邻轻基大豆式元(3 ’ -ODI，3 ’ -orthohydorxydaidzein)的一部分存在于熟成的大酱中，预防由紫外线引起的皮肤癌，并抑制与癌转移相关的活性(见(:，2010^01.285挪.21458;JBC,2011 ,vo1.286，pp.14246)。作为来源于序菜素(apigenin)的儿茶酸型物质，轻基化的木犀草素(luteol in)在抗氧化性好的洋蓟(ari choke)中可提取极少量，据最新报告，可在乳腺癌治疗中使用(Food Chemistry，2013，"Luteolin sensitises drug-resistanthuman breast cancer cells to tamoxifen via the inhibit1n of eye I inE2express1n〃)。除此之外，众所周知，橄榄油中的轻基酪醇(hydroxytyrosol)、葡萄酒中的白皮杉醇(piceatannol)等的儿茶酸型物质还用作强力的抗氧化剂。高分子物质上的儿茶酚型结构物质可摹仿贻贝蛋白质的功能，其应用领域从医疗物质至表面改性纳米工程正广泛地进行研究(Annu Rev Mater Res.2011 I 41:99-132B1fouling 2012,28:8,865-877) ο
[0003]在利用以往的生物催化剂来生产儿茶酚型结构物质的情况下，利用包括P450酶在内的多种单加氧酶(mono-oxigenase)。但是，在大部分的单加氧酶的情况下，需要辅酶，并需要用于电子传递的双还原酶(reductase)。这会影响基质的生物转化反应速度，并由低的收率和生产率引起。相反，酪氨酸酶的单酚结构物质氧化反应相对快(作为参考，来源于蘑燕类的酪氨酸酶的kcat/Km值为大致lOOOmM—h-1)，不伴随用于辅酶的电子传递反应的双酶。
[0004]但是，酪氨酸酶的问题如下:使单酚型结构物质羟基化，来在生产儿茶酚型结构物质的第一次轻基化反应(monophenolase activity)之后，在单酸型结构物质中生物转化的儿茶酸型结构物质借助酪氨酸酶的第二次氧化反应(dipehnolase activity)生物转化为醌型物质(quinonic compounds)。通常，醌型物质形成自由基(radical)来快速形成黑色素(melanin)，生成的黑色素以稳定的结构体具有阻隔紫外线区域的光的功能。
[0005]酪氨酸酶由活性部位周边6个组氨酸(Hi stidine)固定两个铜离子，上述两个铜离子之间的距离在包括铜的儿茶酚氧化酶(catechol oxidase)和其他酪氨酸酶组中规定地保持。根据氧的存在与否，并根据在两个铜之间结合的氧原子的数量，酪氨酸酶区分为三种形态，即，脱氧形态(脱氧-酪氨酸酶((16017-171'0 8；[1^86))、氧形态(氧-酪氨酸酶((《7-tyrosinase))及甲硫氨酸形态(甲硫氨酸-酪氨酸酶(met_tyrosinase))。
[0006]脱氧形态(脱氧-酪氨酸酶(deoxy-tyrosinase))为两个铜离子之间不包含氧的形态，若不供给氧，则成为无法进行羟基化及氧化反应的非活性体。
[0007]若在空气中，氧在溶剂中解离或供给过氧化氢，则在脱氧形态的两个铜离子之间固定一个氧(02)分子，并将这种形态称为氧形态(氧-酪氨酸酶(oxy-tyrosinase))。在这种氧形态中，若单酚的氧原子与一个铜离子相结合，则开始酪氨酸酶的第一次羟基化反应。
[0008]作为上述第一次轻基化反应(monophenolase activity)，氧分子键断裂，一个氧原子与邻位碳相结合，插入羟基，在酪氨酸酶的两个铜之间仅残留有一个氧原子。将这种形态称为甲硫氨酸形态(甲硫氨酸-酪氨酸酶(met-tyrosinase))。此时，儿茶酸型结构物质和甲硫氨酸-酪氨酸酶分离，两个铜之间的一个氧原子重新排列已形成的角度，并准备第二次氧化反应(diphenolase activity)。
[0009]甲硫氨酸形态可使儿茶酚型结构物质氧化，但不参与单酚型的羟基化反应。在第一次羟基化反应之后，从芳香环上的两个羟基的残基中去除氢离子，从而连续发生与残留的一个氧原子相结合来生成水的氧化反应。若使用完结合的两个氧原子，则两个铜离子之间被空出，并重新回到脱氧形态。在单酚型初始基质中，通过两次生物转化(羟基化反应及氧化反应)生成的产物为邻-苯醌形态的结构物质。
[0010]在第二次氧化反应(diphenolase activity)中，可从儿茶酸型结构物质的两个轻基中去除氢，来与两个铜相结合，一个氧原子从儿茶酚型物质中接收两个电子来还原为水(diphenolase activity)。如上所述，甲硫氨酸形态可使儿茶酸型结构物质氧化，但不参与单酚型的羟基化反应。因而，在氧-酪氨酸酶的单酚型结构物质的氧化反应之后，生成的儿茶酚型结构物质无法由甲硫氨酸-酪氨酸酶氧化的情况下，甲硫氨酸-酪氨酸酶因无法转换为脱氧-酪氨酸酶而积累，酪氨酸酶被失活。
[00??] 与第一次轻基化反应(monophenolase activity)的反应速度常数(kl)相比，第二次氧化反应(diphenolase activity)的速度常数(k2)大大致10倍左右，因而在积累作为中间生成物的儿茶酚型结构物质方面存在困难。酪氨酸酶的研究焦点主要集中在黑色素的形成反应和其抑制剂的作用，因而在应用其的多种儿茶酚型结构物质形成反应最优化技术中，本研究可视为最初技术。
[0012]现有技术文献
[0013]专利文献
[0014]专利文献1:韩国特许公开10-2012-0114072
[0015]专利文献2:韩国特许登录10-0878394
[0016]非专利文献
[0017]非专利文献1:L-抗坏血酸对酪氨酸酶的单酚酶活性产生的影响，B1chemJ.19930ctober l；295(Pt 1):309-312
[0018]非专利文献2:用于单酚酶/双酚酶激活比率的酪氨酸酶的方向进化，Enzyme andMicrobial Technology，Volume 47，Issue 7，8December 2010，Pages 372-376
【发明内容】
[0019]技术问题
[0020]适用生物学方法的儿茶酚型结构物质的代表性生产方法可分为两种情况，S卩，儿茶酚和其他结构的结合方法和单酚型结构物质的羟基化反应。
[0021 ] 相当于第一种情况的代表性反应为日本味之素(Aj inomoto)公司多巴(DOPA)生产方法。利用酪氨酸-苯酸裂解酶(tyrosin-phenol Iiase)使儿茶酸、乙酸及氨生物转化为多巴(DOPA)，并最高可生产100g/L左右。为了利用裂解酶生产儿茶酚型结构物质，需要筛选与儿茶酚可形成碳-碳键的特异性基质和相应的裂解酶。由此，在多种儿茶酚型结构物质的生产上存在局限。
[0022]相当于第二种情况的苯类结构物质或单酚型结构物质的羟基化反应有利用单加氧酶(monooxygenase)的方法。单加氧酶作为氧化还原酶的一种，需要借助电子传递系统的电子的供给。代表性的单加氧酶反应酶为细胞色素P450(cytochrome P450)，从位于酶的中心的血红素(heme)结构的铁离子的氧化还原作用诱导反应。使细胞色素P450的基质特异性转换，从而适用于多种结构的儿茶酚型结构物质的生产。但是，在大部分的单加氧酶的情况下，需要辅酶，并需要用于电子传递的双还原酶(reductase)。这会影响基质的生物转化反应速