度，并由低的收率和生产率引起。
[0023]作为除此之外的其他生物催化羟基化反应有酪氨酸酶的应用。酪氨酸酶的活性部位主要存在于蛋白质表面，在多种儿茶酚型结构物质的生产中，优点为对单酚型结构物质的酪氨酸酶的基质特异性广。并且，酪氨酸酶的单酚结构物质氧化反应相对快(作为参考，来源于蘑菇类的酪氨酸酶的kcat/Km值为大致lOOOmM—工)，不伴随用于辅酶的电子传递反应的双酶。但在酪氨酸酶的情况下，将多种单酚型结构物质用作基质，从而具有与所提及的上述两种情况相比，可更快地转换为儿茶酚型结构物质的优点，但同时还快速使儿茶酚型结构物质氧化，从而形成醌形态。生成的醌型物质容易形成自由基，来形成黑色素等的高分子物质，或使周边物质氧化。
[0024]为了有效地积累作为中间体的儿茶酚型结构物质，需要研究基于醌型物质的还原的儿茶酚型物质的积累、已积累的儿茶酚型物质的氧化防止、随着儿茶酚型物质积累而失活的酪氨酸酶的重新激活。
[0025]本发明的目的在于，通过如上所述的三种研究，提供利用酪氨酸酶以高的生产率和收率生产功能性儿茶酚型结构物质的生产方法。
[0026]解决问题的手段
[0027]为了抑制酪氨酸酶的第二次氧化反应，并有效地生产儿茶酚型结构物质，本技术的战略大致分为三个部分，即，基于醌型物质的还原的儿茶酚型物质的积累、已积累的儿茶酚型物质的氧化防止、失活的酪氨酸酶的重新激活。
[0028]具体地，第一，本发明提供如下方法，即，使通过酪氨酸酶的第二次氧化反应生产的醌型物质有效地重新还原为儿茶酚型结构物质。
[0029]第二，本发明提供如下方法，S卩，针对通过酪氨酸酶的第一次羟基化反应生成的儿茶酚型结构物质，诱导与其他元素的配位键，来从酪氨酸酶的第二次氧化反应中得到保护。
[0030]第三，本发明提供有效调节酪氨酸酶的三种活性形态来将酶活性最优化的技术。当儿茶酚型结构物质未氧化时，不容易去除甲硫氨酸-酪氨酸酶的一个氧原子，因而酪氨酸酶处于失活状态。像这样处于失活状态的酪氨酸酶可借助还原力来重新激活。
[0031]具体地，本发明提供如下。
[0032](I)利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法的特征在于，其包括以下步骤(a)至步骤(C)中的一个步骤，步骤(a)，导入还原力来使通过酪氨酸酶的过氧化反应生成的醌型结构物质还原为儿茶酚型结构物质;步骤(b)，利用过渡金属离子或硼离子使生成的儿茶酚型结构物质形成配位键；以及步骤(C)，导入还原力来使甲硫氨酸-酪氨酸酶激活。
[0033](2)根据(I)所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法，其特征在于，在步骤(a)或步骤(C)中使用的还原力从选自由电化学、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、抗坏血酸、半胱氨酸、对香豆酸、羟胺、儿茶酚、邻苯三酚及咖啡酸组成的组中的物质提供。
[0034](3)根据(I)所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法，其特征在于，单酚型结构物质选自由酪氨酸氨基酸、酪醇、白藜芦醇、大豆甙元、染料木素、芹菜素、根皮素、苯酚、对香豆酸、对硝基苯酚、对甲酚、对乙烯基苯酚及邻氨基苯酚组成的组中。
[0035](4)根据(I)所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法，其特征在于，儿茶酚型结构物质选自由木犀草素、3-羟基根皮素、3’-邻羟基大豆甙元、二羟四氢黄酮、白皮杉醇、羟基酪醇、多巴(dopa)、咖啡酸、3，4-二羟基硝基苯、3，4_二羟基甲苯及3，4_ 二羟基苯乙烯组成的组中。
[0036](5)根据(I)所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法，其特征在于，还包括分离纯化儿茶酚型结构物质的步骤(d)，在上述步骤(d)中，在有机溶剂中溶解包含儿茶酚型结构物质的生成物来取得水层，降低取得的水层的PH之后，还在有机溶剂中溶解来取得有机层，并使有机层蒸发来取得j L茶酚型结构物质。
[0037](6)根据(I)所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法，其特征在于，单酚型结构物质为高分子上的酪氨酸残基。
[0038](7)高分子交联反应方法的特征在于，利用通过(6)所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法来制备的儿茶酚型结构物质。
[0039]发明效果
[0040]本发明涉及利用酪氨酸酶的功能性儿茶酚型结构物质的制备及其应用，可适用于多种来源的酪氨酸酶。这是根据酪氨酸酶基质特异性概括在多种单酚型结构物质中向功能性儿茶酚型物质的羟基化反应的，可实现现有的难提取或难以进行有机化学合成的儿茶酚型结构物质的生产，从而可贡献于其生理学功效实验。最近，有很多对黄酮/异黄酮系列的氢氧化物的抗癌性相关研究。但是，难以实现位置特异性的有机合成法，并且在提取自然极少存在的羟基黄酮/异黄酮方面也存在局限。通过本研究，可使功能性儿茶酚型结构物质的生产变得容易，且可进行更多的与此相关的生理学研究及新材料/功能性原料开发。
[0041]并且，利用酪氨酸酶可使作为蛋白质上的单酚型氨基酸残基的酪氨酸(tyrosine)羟基化为多巴，这可改良性质成为可摹仿贻贝蛋白质的粘结功能的蛋白质。像这样，改良性质的蛋白质可发展为组织工程的支架(scaffolds)，进一步可开发为功能性蛋白质给药系统(drug delivery system)(Annu Rev Mater Res.2011 I；41:99-132；B1fouling,2012,28:8,865-877；Current Opin1n in B1technology2013，24:1-7)。
【附图说明】
[0042]图1为用于由酪氨酸酶生成有效的儿茶酚型结构物质的示意图，图1的a为单酚型结构物质，图1的b为儿茶酚型结构物质，图1的c为醌型结构物质，图1的d为与儿茶酚型结构物质的其他元素形成配位键的结构体。并且，图1的I为酪氨酸酶的第一次羟基化反应，图1的2为酪氨酸酶的第二次氧化反应，图1的3为脱氧-酪氨酸酶将一个氧分子放入存在于活性部位内的两个铜之间，并成为氧化-酪氨酸酶的反应，图1的4为借助使甲硫氨酸-酪氨酸酶的一个氧原子还原的还原剂的反应，图1的5为羟基化的儿茶酚型结构物质形成配位键的反应，图1的6为使醌型结构物质还原来重新积累为儿茶酚型结构物质的反应，图1的7为过氧化的醌型物质高分子化为黑色素的反应。
[0043]图2作为罗列在酪氨酸酶全细胞反应中添加的还原剂的表，在添加各个还原剂(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、L-抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、羟基醌、1-萘酚、对香豆酸、姜黄素、儿茶酚、邻苯三酚或阿魏酸)的情况下，在白藜芦醇(trans-resveratrol)中呈现羟基化的白皮杉醇(piceatannol)的相对生产量。
[0044]图3为有关三种不同来源的酪氨酸酶(BMT_tyr:巨大芽孢杆菌酪氨酸酶、ABS_tys:双孢蘑燕酪氨酸酶、SAV_tyr:除虫链霉菌酪氨酸酶)的酪氨酸氨基酸(L-tyrosine)和多巴(L-dopa)的单加氧酶反应速度和双加氧酶反应速度的比较表。
[0045]图4为表示从单酚型结构物质通过酪氨酸酶的羟基化反应生成的多个儿茶酚型结构物质的反应式。
[0046]图5为通过pH调节确认羟基化的3邻羟基大豆甙元(3 ’ -ODI，3 ’ -orthohydorxydaidzein)是否形成配位键的高性能-液相层析的定量分析。
[0047 ] 图6为通过pH调节确认轻基化的二轻四氢黄酮(orobo I)和木犀草素(luteo Iin)是否形成配位键的高性能-液相层析的定量分析。
[0048]图7a为以时间为单位观察pH9的硼酸缓冲液中包含ImM的大豆甙元及10nM的酪氨酸酶的5mL体外(in vitro)反应中的3’ -邻轻基大豆式元的生产率的曲线图。
[0049]图7b为以时间为单位观察pH9的三(羟甲基)氨基甲烷(tris-HCl)中包含300μΜ的大豆甙元及10nM的酪氨酸酶的5mL体外反应中的3邻羟基大豆甙元的生产率的曲线图。
[0050]图8为以时间为单位观察添加了羟胺或抗坏血酸的ImM的染料木素的羟基化反应的曲线图。
[0051]图9为以时间为单位观察添加了羟胺或抗坏血酸的ImM的白藜芦醇的羟基化反应的曲线图。
[0052]图10为用于分离/纯化生成的儿茶酚型结构物质的技术的示意图，在实施例5中详细且明确地示出了其方法。
[0053]图1la表示利用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)分析从大豆甙元(daidz