ein)生成的3’-邻轻基大豆式元(3’-0DI)的结果，由I表示的保留时间(retent1n time)18.18分为通过气相色谱法(GC)分离的3’-邻轻基大豆式元，由a表示的486.48、m/z为分子量(TMS)的m/z，由b表示的471.50、111/2为分子量013)-15的111/2，由(3表示的383.39、111/2为分子量013)-103的!11/2。
[0054]图1Ib表示利用气相色谱-质谱联用仪分析从白藜芦醇(trans-resveratrol)生成的白皮杉醇(piceatannol)的结果，由I表示的保留时间(retent1n time) 14.82分为通过气相色谱法分离的白皮杉醇，由a表示的532.53、!11/2为分子量(^15)的1]1/z，由b表示的517.45、111/2为分子量(了]^)-15的111/2。
[0055]图12示出根据pH的儿茶酚型结构物质与铁离子形成配位键的状态。
【具体实施方式】
[0056]以下，对本发明进行更详细的说明。
[0057]只要无其他定义，在本发明中使用的所有技术性术语及科学性术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的术语相同的含义。通常，在本说明书中使用的命名法及以下记述的实验方法为在本技术领域中众所周知且通常使用的方法。
[0058]本发明提供利用酪氨酸酶或表达酪氨酸酶的微生物(全细胞)来生产儿茶酚型结构物质的方法。
[0059]并且，提供为了抑制基于酪氨酸酶的过氧化反应的儿茶酚型结构物质的生物转化反应而形成配位键来积累的方法。
[0060]并且，本发明提供使通过过氧化生成的醌型物质有效地还原为儿茶酚型结构物质的方法。
[0061]具体地，本发明可通过i)基于醌型物质的还原的儿茶酚型物质的积累、ii)已积累的儿茶酚型物质的氧化防止、iii)随着儿茶酚型物质积累而失活的酪氨酸酶的重新激活，有效地积累儿茶酚型结构物质。
[0062]第一，本发明提供可有效地使通过酪氨酸酶的第二次氧化反应生产的醌型物质重新还原为儿茶酚型结构物质的方法。由此有可能延迟醌型结构物质高分子化为黑色素。这是因为多个自由基借助还原力而稳定化，且因为醌型物质接收电子，从而可重新转换为儿茶酚型结构物质。不对酶活性产生坏影响而可使用的有效的还原力有电化学方法和图2的还原剂目录中明确示出的化合物之类的还原剂。若在氧化反应中添加目录中的还原剂，则可确认暗的黑色素的形成被延迟。此时，虽然延迟黑色素的形成，但是可确认作为初始基质的单酚型物质持续减少，由此判断为如上所述的还原力仅影响黑色素的形成，而与酪氨酸酶的活性降低无关。上述还原力可从选自由电化学、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、抗坏血酸、半胱氨酸、对香豆酸、羟胺、儿茶酚、邻苯三酚及咖啡酸组成的组中的物质提供。优选地，上述还原力可利用葡萄糖脱氢酶(glucosedehydrogenase)等的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)(NAD(P)H)再生产酶来在反应中持续提供，这在体内(in vivo)生产儿茶酚型物质时，可更有效地得到应用。
[0063]第二，本发明提供如下方法，S卩，针对通过酪氨酸酶的第一次羟基化反应生成的儿茶酚型结构物质，诱导与其他元素的配位键，来从酪氨酸酶的第二次氧化反应中得到保护。众所周知，儿茶酸型结构物质根据pH与铁离子形成配位键(Proc Natl Acad Sci USA.201115，108(7) ,2651-2655)。这种道理与贻贝蛋白质结合于有机物中的金属离子来具有粘结力的道理相同(Annu Rev Mater Res.2011 41，99_132)。基于此，除了铁离子之外，对酪氨酸酶的活性无害，并筛选了与儿茶酚型结构物质形成配位键的物质，通过用于本研究的实施例的实验来进行。
[0064]硼(B)具有sp2杂化轨道函数，但当存在路易斯碱(Lewisbase)时，成为sp3。据报告，儿茶酚型结构物质起到路易斯碱的作用，根据pH，与一个或两个儿茶酚物质形成配位键(BBA，2002，1569，35-44)。与硼酸相结合的复合体的亲水性增加，由于这种机制，当稳定具有二醇(d1l)的糖时，使用硼酸离子，当从咖啡豆或茶叶中提取咖啡因时还使用硼酸离子。形成配位键的儿茶酚型物质的羟基全部与硼酸形成配位键，因而不被酪氨酸酶氧化。因而，当排除第二次氧化反应，而仅观察第一次羟基化反应时还利用(JACS，2003 ,vol.125,43,13034-13035)ο
[0065]第三，本发明提供有效调节酪氨酸酶的三种活性形态(脱氧形态、氧形态及甲硫氨酸形态)来将酶活性最优化的技术。当儿茶酚型结构物质未氧化时，甲硫氨酸-酪氨酸酶的一个氧原子不容易被去除，因而酪氨酸酶处于失活状态。像这样处于失活状态的甲硫氨酸-酪氨酸酶的一个氧原子借助其他还原剂或电化学还原力还原，从而有可能作为水分子被去除，酪氨酸酶重新转换为可接收氧(O2)分子的脱氧形态。作为这种还原剂，如图2的还原剂列表中明确示出，除了儿茶酸型物质之外，有轻胺(NH2OH，hydroxyIamine)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)、抗坏血酸(ascorbic acid)等。
[0066]如图1的反应4所示，轻胺(hydroxylamine)使残留在活性部位内的铜之间的氧原子还原来生成水，并使无法作为基质接收单酚型物质的酪氨酸酶转换为脱氧形态(JACS，2003，vol.125，43，13034-13035)。脱氧-酪氨酸酶与一个氧分子重新形成铜-氧复合体(μ-n2:n2peroxo binuclear copper complex)来成为氧-酪氨酸酶。图1的反应4不仅借助轻胺来实现，而且还可借助可靠近活性部位的还原剂，即，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)、抗坏血酸、其他j L茶酚型物质等来实现。
[0067]另一方面，在本发明中使用的术语为在本技术领域中通常使用的术语，只要是本发明所属技术领域的普通技术人员，就都可以理解其含义，但在本说明书中，进行简单的说明如下。
[0068](I)酪氨酸酶作为包含铜的蛋白质，是指催化黑色素的生产的酶。
[0069](2)单酚型结构物质是指具有与图1的a相同的结构的物质。上述单酚型结构物质有酪氨酸氨基酸(tyrosin)、酪醇(tyrosol)、白藜芦醇(resveratrol)等的I，2_二苯乙稀(stiIbene)系列、大豆式元(daidzein)、染料木素(genistein)、序菜素(apigenine)、根皮素(ph1retin)等的黄酮(f Iavonone)/异黄酮(isof Iavone)系列，除此之外，还有苯酸(phenol)、对香豆酸(para-coumaric acid)、对硝基苯?Kpara_nitrophenol)、对甲酸(para-cresol)、对乙稀基苯?Kpara_vinylphenol)及邻氨基苯UKortho-aminophenol)。优选地，可使用白藜芦醇、对香豆酸、大豆甙元、染料木素、对硝基苯酚、对甲酚、对乙烯基苯酚、芹菜素或根皮素等。
[0070]并且，单酚型结构物质可以为高分子物质上的酪氨酸残基，上述高分子物质可以为蛋白质(多肽)。
[0071](3)儿茶酚型结构物质是指具有与图1的b相同的结构的物质。上述儿茶酚型结构物质作为对单酚型结构酪氨酸物质特异性地进行邻羟基化的物质，有木犀草素(Iuteolin)、3-轻基根皮素(3_hydroxyphloretin，3’-ODI)、二轻四氢黄酮(orobol)等的轻基黄酮(fIavonone)/异黄酮(isofIavone)系列、白皮杉醇(piceatannol)等的轻基I，2-二苯乙稀(sti lbene)系列、轻基酪醇(hydroxy I tyro so I)、多巴(dopa)、咖啡酸(caffeic已(^(1)、3，4-二轻基硝基苯(3，4-(1;[117(11'0叉711；[1:1'0匕61126116)、3，4-二轻基甲苯(3，4-dihydroxy toluene)、3，4_ 二轻基苯乙稀(3，4_dihydroxystyrene)等。优选地，以上罗列的优选的多个单酚型结构物质作为特异性地进行邻羟基化的形态，依次有白皮杉醇、咖啡酸、3，-邻轻基大豆式元、二轻四氢黄酮、3，4-二轻基硝基苯(3，4-dihydroxynitrobenzene)、3，4-二轻基甲苯(3，4-dihydroxytoluene)、3，4_二轻基苯乙稀(3，4_dihydroxystyrene)、木犀草素、3-轻基根皮素(3-hydroxyphloret in)等。
[0072](4)醌型结构物质是指具有与图1的c