胺或抗坏血酸进行激活。此时，相对于基质，添加的羟胺或抗坏血酸的浓度为I至100倍，更优选为3倍至50倍，尤其优选为10倍至20倍。通过这种组成，根据反应法I，使ImM的大豆甙元进行反应，并按时间利用4倍的乙酸乙酯(ethy Iacetate，EA)或非极性溶剂来提取10uL的反应物之后，利用高性能-液相层析进行定量分析。根据定量分析结果，在反应6小时时，以100 %收率生产了 ImM的3 ’ -邻羟基大豆甙元，并将其示于图7a中。
[0?05]以相同的方法，诱导了染料木素(genistein)及白藜芦醇(resveratrol)的位置特异性羟基化反应，如上所述的单酚型物质可通过酪氨酸酶的第一次羟基化反应生物转化为功能性儿茶酚型结构物质。染料木素在反应I小时时，生物转化为95%的二羟四氢黄酮(orobol)，白藜芦醇在反应I小时时，生物转化为100%的白皮杉醇(piceatannol)。将其示于图8及图9中。
[0106]实施例5
[0107]生成的儿茶酚型结构物质的分离纯化法
[0108]为了分离在实施例4中生成的儿茶酚型结构物质，利用生成物和反应物的溶解度。在碱性缓冲液中，进行反应而生成的儿茶酚型物质形成配位键，从而提高亲水性(图10的I部分)。不形成配位键体的单酸型结构物质在反应体积4倍数的乙酸乙酯(ethyIacetate，EA)中被提取，如图10的2部分所示，有机溶剂和水层因比重差异而区分层。利用滴定管对上述有机溶剂和水层进行分离，来分离图10的3-1(水层)和3-2(有机层)，并使分离的有机层蒸发，来使残留在其内的单酚型结构物质可重新使用于反应中。水层利用IM的HCl来降低pH，并利用4倍数的乙酸乙酯(ethylacetate，EA)来重新提取了儿茶酸型结构物质(图10的4部分)。提取之后，利用滴定管分离了酸性反应液层。就乙酸乙酯(ethylacetate，EA)层而言，利用真空蒸发器(vacuum evaporator)去除乙酸乙酯(ethylacetate，EA)，且可取得纯化的粉形态的儿茶酚型结构物质。
[0109]实施例6
[0110]利用酪氨酸酶的羟基化反应生成物的质量分析
[0111]利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对在实施例5中生成的多个功能性儿茶酚型结构物质进行定性分析，其结果明确示于图11中。
[0112]具体地，图1la表示利用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)分析从大豆甙元(daidzein)生成的3’-邻轻基大豆式元(3’-ODI)的结果，由I表示的保留时间(retent1ntime )18.18分为通过气相色谱法(GC)分离的3’-邻轻基大豆式元，由a表示的486.48、m/z为分子量(TMS)的m/z，由b表示的471.50、m/z为分子量(TMS)_15的m/z，由c表示的383.39、m/z为分子量(TMS)_103的m/z，上述结果可参照现有论文(Hydroxylat1n of daidzein byCYP107Hlfrom Bacillus subtiIisl68,Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,Vol 59,issue 4,August 2009,Pages 248-253)确认为3’-邻轻基大豆式元。
[0113]图1Ib表示利用气相色谱-质谱联用仪分析从白藜芦醇(trans-resveratrol)生成的白皮杉醇(piceatannol)的结果，由I表示的保留时间(retent1n time) 14.82分为通过气相色谱法分离的白皮杉醇，由a表示的532.53、m/z为分子量(TMS)的m/z，由b表示的517.45、m/z为分子量(TMS)_15的m/z，上述结果可参照现有论文(The cancerpreventative agent resveratrol is converted to the anticancer agentpiceatannol by the cytochrome P450enzyme CYPlBl,British Journal of Cancer(2002) 86，774-778)确认为白皮杉醇。
[0114]实施例7
[0115]高分子上单酚型物质向JL茶酚型结构物质的生物转化:向贻贝蛋白质的摹仿
[0116]为了将高分子上的酪氨酸残基有效地生物转化为多巴残基，利用除虫链霉菌酪氨酸酶。具有(VPGYG)12(VPGVG)24的共180个氨基酸序列的弹性蛋白样多肽(ELP，elastinlike-polypeptide)将以下弹性蛋白样多肽Y以0.5重量百分比在300uL的pH9的50mM的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中溶解之后，放入2mM的FeCl3和抗坏血酸、500nM的除虫链霉菌酪氨酸酶，并反应两小时之后，利用IM的NaOH和IM的HCl来改变pH。在pH5中溶解的弹性蛋白样多肽_￥在?!17中，以粉的形式沉淀。确认到在将pH调节为11的情况下，弹性蛋白样多肽_￥进行凝胶化(gelat1n)。确认到在重新降低pH的情况下，形成的水凝胶(hydrogel)溶解，从而是具有可逆性的反应。这是与摹仿贻贝蛋白质的功能的以前的论文相一致的结果(ProcNatl Acad Sci USA.2011 15,108(7),2651-2655)0
[0117]产业上的可利用性
[0118]本发明可利用酶反应来实现功能性儿茶酚型结构物质的批量生产，且可适用于新材料/功能性原料及医疗用产品的生产。具体地，本发明根据酪氨酸酶基质特异性，概括从多种单酚型结构物质向功能性儿茶酚型物质的羟基化反应，可实现现有的难以提取或难以进行有机化学合成的儿茶酚型结构物质的生产，从而可贡献于其生理学功效实验。
【主权项】
1.一种利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)至步骤(C)中的一个步骤， 步骤(a)，导入还原力来使通过酪氨酸酶的过氧化反应生成的醌型结构物质还原为儿茶酚型结构物质； 步骤(b)，利用过渡金属离子或硼离子使生成的儿茶酚型结构物质形成配位键； 步骤(C)，导入还原力来使甲硫氨酸-酪氨酸酶激活。2.根据权利要求1所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法，其特征在于，在步骤(a)或步骤(C)中使用的还原力从选自由电化学、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、抗坏血酸、半胱氨酸、对香豆酸、羟胺、儿茶酚、邻苯三酚及咖啡酸组成的组中的物质提供。3.根据权利要求1所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法，其特征在于，单酚型结构物质选自由酪氨酸氨基酸、酪醇、白藜芦醇、大豆甙元、染料木素、芹菜素、根皮素、苯酚、对香豆酸、对硝基苯酚、对甲酚、对乙烯基苯酚及邻氨基苯酚组成的组中。4.根据权利要求1所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法，其特征在于，儿茶酚型结构物质选自由木犀草素、3-羟基根皮素、3’-邻羟基大豆甙元、二羟四氢黄酮、白皮杉醇、羟基酪醇、多巴、咖啡酸、3，4-二羟基硝基苯、3，4-二羟基甲苯及3，4_ 二羟基苯乙烯组成的组中。5.根据权利要求1所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法，其特征在于，还包括分离纯化儿茶酚型结构物质的步骤(d)，在上述步骤(d)中，在有机溶剂中溶解包含儿茶酚型结构物质的生成物来取得水层，降低取得的水层的PH之后，还在有机溶剂中溶解来取得有机层，并使有机层蒸发来取得j L茶酚型结构物质。6.根据权利要求1所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法，其特征在于，单酚型结构物质为高分子上的酪氨酸残基。7.—种高分子交联反应方法，其特征在于，利用通过权利要求6所述的利用酪氨酸酶从单酚型结构物质制备儿茶酚型结构物质的方法来制备的儿茶酚型结构物质。
【专利摘要】本发明为与利用酪氨酸酶的儿茶酚型结构物质的生物合成反应相关的技术，是有效地抑制酪氨酸酶的第二次氧化反应来选择性地仅将单酚型结构物质的第一次羟基化反应进行催化的技术。本发明提供以高的生产率和收率生产利用酪氨酸酶的多种功能性儿茶酚型物质的技术。
【IPC分类】A61P35/00, C12P7/22, A61K31/353, C07D311/32
【公开号】CN105555776
【申请号】CN201380077815
【发明人】金秉祺, 李相赫, 白基宪
【申请人】首尔大学校产学协力团
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2013年12月17日
【公告号】WO2014208847A1