包含GFP。
[0114] 本文中还提供通过本文所述方法鉴定的染色质结合模块抑制化合物。在一些实施 方案中，所述染色质结合模块抑制化合物是小分子抑制剂。在一些实施方案中，所述染色质 结合模块抑制化合物是布罗莫结构域模块抑制化合物。
[0115] 染色质结合模块和染色质结合多肤的多肤变体
[0116] 染色质结合模块和染色质结合多肤的变体用于本文所述方法和用于本文所述融 合蛋白。多肤的保守取代优选的取代"的标题示于表3中。如果此类取代导致生物活性的 变化，则可引入在表3中命名为"示例性取代"或如在下文中参考氨基酸种类进一步描述的 更加显著的变化，并筛选产物。
[0117] 表3 [011引
[0119] 通过选择取代来实现多肤的生物性质的显著修改，所述取代在它们对维持如下方 面的作用上显著不同：（a)取代的区域例如，如折叠片或螺旋构象中的多肤主链的结构，（b) 分子在祀位点上的电荷或疏水性或(C)侧链的体积。非保守取代将使运些种类之一的成员 必须与另一个种类交换。可按照共同的侧链性质将氨基酸分类：
[0120] (1)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、I le;
[0121] (2)中性亲水性：〔73、56'、1'虹、4311、61111;
[0122] (3)酸性:43口、6111;
[0123] (4)碱性:His、Lys、Arg;
[0124] (5)影响链取向的残基:Gly、Pro;
[012 引（6)芳香族:T;rp、Ty;r、Phe;
[0126] (7)大的疏水性：正亮氨酸、Met、化l、Leu、Ile。
[0127] 在其它实施方案中，本发明的多肤可包含一个或多个非天然存在或经修饰的氨基 酸。"非天然存在的氨基酸残基"是指除上文所列的那些天然存在的氨基酸残基外的残基， 其能够共价结合多肤链中的相邻氨基酸残基。非天然氨基酸包括，但不限于高赖氨酸、高精 氨酸，高丝氨酸，铃兰氨酸，2-氨基己二酸，3-氨基己二酸，β-丙氨酸，氨基丙酸，2-氨基下 酸，4-氨基下酸，6-氨基己酸，2-氨基庚酸，2氨基异下酸，3-氨基异下酸，2-氨基庚二酸，叔 下基甘氨酸，2，4-二氨基异下酸，锁链素，2，2 二氨基庚二酸，2，3-二氨基丙酸，Ν-乙基甘 氨酸，Ν-乙基天冬酷胺、高脯氨酸，径基赖氨酸，别-?基赖氨酸，3-径基脯氨酸，4-径基脯氨 酸，异锁链素，别-异亮氨酸，N-甲基丙氨酸，N-甲基甘氨酸，N-甲基异亮氨酸，N-甲基戊基甘 氨酸，N-甲基鄉氨酸，糞胺，正鄉氨酸，正亮氨酸，鸟氨酸，瓜氨酸，戊基甘氨酸，赃晚酸和硫 代脯氨酸。经修饰的氨基酸包括天然和非天然氨基酸，其可被可逆或不可逆地化学阻断，或 在它们的N-末端氨基或它们的侧链基团上被修饰，如例如，N-甲基化D和L氨基酸，被化学修 饰成另一种官能团的侧链官能团。例如，经修饰的氨基酸包括甲硫氨酸亚讽；甲硫氨酸讽； 天冬氨酸-(0-甲基醋）、天冬氨酸的经修饰的氨基酸;N-乙甘氨酸、甘氨酸的经修饰的氨基 酸;或丙氨酸甲酯胺和丙氨酸的经修饰的氨基酸。另外的非天然和经修饰的氨基酸W及将 它们渗入蛋白质和肤的方法在本领域中是已知的（见，例如，Sandberg等，（1998 ) J.Med.Qiem.41:2481-91;Xie和Schultz(2005) Qirr.Opin.Qiem.Biol.9:548-554;Hodgson 和Sanderson(2004) Qiem.Soc.Rev.33:422-430)。
[0128] 包含染色质结合模块的多肤的变体还可基于本领域已知的信息来制备，而不显著 影响染色质结合模块的活性。例如，包含染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块变体 可使包含染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块中的至少一个氨基酸残基被不同残 基替代。
[0129] 产生此类取代变体的方便方法包括隧菌体展示。随后筛选隧菌体展示的变体的如 本文中公开的它们的生物活性(例如，结合亲和力）。为了鉴定用于修饰的包含染色质结合 模块的多肤和/或染色质结合模块的候选区域，可进行丙氨酸扫描诱变来鉴定显著有助于 染色质结合的高变区残基。一旦产生此类变体，就将使变体的小组经历如本文所述的筛选， 并且在一个或多个相关测定中具有优良性质的抗体可被选择用于其它开发。
[0130 ]本文所述方法中使用的核酸、表达盒、载体和细胞
[0131] 本文提供编码本文所述融合蛋白的核酸和包含含有本文中所述融合蛋白的核酸 的表达盒、载体。本文提供分离的和/或大体上纯化的融合蛋白和编码本文所述的融合蛋白 的核酸(例如，DNA或RNA)。还提供了包含编码本文所述融合蛋白的核酸的载体和表达盒。
[0132] 编码包含本文所述染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块的多核巧酸序列 可使用标准合成和/或重组技术来获得。可从适当的来源细胞分离所需的多核巧酸序列，并 对其进行测序。包含染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块的来源细胞可包括包含 染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块生成细胞诸如杂交瘤细胞。或者，多核巧酸可 使用核巧酸合成仪或PCR技术来合成。一旦获得，就可将编码包含布罗莫结构域和/或布罗 莫结构域的多肤的序列插入能够在宿主细胞中复制和表达异源多核巧酸的重组载体。在本 领域中可获得和已知的许多载体可用于本发明的目的。适当的载体的选择将主要取决于待 插入载体中的核酸的大小和待用所述载体转化的具体宿主细胞。每一个载体含有不同的组 分，运取决于其功能(异源多核巧酸的扩增或表达，或运两方面及其与其所存在的特定 宿主细胞的相容性。载体组分通常包括，但不限于:复制起始点（特别地当将载体插入原核 细胞时）、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物和转录 终止序列。
[0133] 编码包含染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块的氨基酸序列变体的核酸 分子通过本领域中已知的多种方法来制备。运些方法包括，但不限于，从天然来源的分离 (在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或通过包含染色质结合模块的多肤和/或染色质 结合模块的较早制备的变体或非变体形式的寡核巧酸介导的（或定点）诱变、PCR诱变W及 表达盒诱变进行的制备。
[0134] 在某些实施方案中，本发明提供含有包含可操作地连接于祀序列的启动子的表达 盒的载体。如本文中所用，"表达盒"意指能够指导特定核巧酸序列在适当的宿主细胞中的 表达的核酸序列，其包括可操作地连接于目标核巧酸序列(所述目标核巧酸序列可操作地 连接于终止信号）的启动子。编码区通常编码目标功能性RNA，例如RNAi分子。包括目标核巧 酸序列的表达盒可W是嵌合的。可使用标准技术，诸如Samb;rook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring 化rbor，NY( 2001)中描述的那些技术将核酸工程化至载体中。
[0135] -般地，将含有来源于与宿主细胞相容的种类的复制子和控制序列的质粒载体与 运些宿主结合使用。所述载体通常具有复制位点，并且制备能够提供转化细胞的表型选择 的标记序列。另外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的隧菌体载体可用作与运 些宿主结合的转化载体。
[0136] 根据具体情况的需要可将组成型或诱导型启动子用于本发明，运可由本领域普通 技术人员来确定。众多由多种潜在宿主细胞识别的启动子是公知的。可通过从来源DNA经由 限制性内切酶消化除去启动子和将分离的启动子序列插入选定的载体来将选定的启动子 可操作地连接于编码本文所述多肤的顺反子DNA。天然启动子序列和许多异源启动子可用 于指导本文所述融合蛋白的扩增和/或表达。然而，异源启动子是优选的，因为它们相较于 天然祀多肤启动子通常允许表达的祀基因的更大转录和更高产率。
[0137] 在一些实施方案中，重组载体内的每一个顺反子包含分泌信号序列组分和/或指 导表达的多肤穿过膜的转运的核定位信号。一般地，所述信号序列可W是载体的组分，或其 可W是被插入载体的祀多肤DNA的部分。被选择用于本发明的目的信号序列应当是被宿主 细胞识别和加工(即被信号肤酶切割）的信号序列。
[0138] 本文还提供包含含有包含本文所述融合蛋白的核酸的表达盒和/或载体的细胞。 本文提供包含本文所述融合蛋白的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞。在一些 实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞是CH0-KUC0S-7、 皿K293、皿K293T、皿K293FT、胎La、MDCK和/或U20S细胞。在某些实施方案中，所述细胞是 C0S-7、HeLa 和/或 U20S细胞。
[0139] 用上述表达载体转化或转染或通过用上述表达载体包装的病毒转导宿主细胞，并 将所述宿主细胞在经改良适合用于诱导启动子的常规营养培养基中培养，随后选择转化 体，或扩增编码所需序列的基因。转染是指表达载体被宿主细胞吸收而无论任何编码序列 是否实际上被表达。当该载体的操作的任何指征在细胞内产生时，成功的转染通常被识别。
[0140] 如果将诱导型启动子用于表达载体，则在适合于启动子激活的条件下诱导蛋白质 表达。可根据所使用的的载体构建体使用多种其它诱导物，运在本领域中是已知的。还可W W适当的浓度包含除了碳、氮和无机憐酸盐来源W外的任何必需补充剂，所述补充剂单独 地或作为与另一种补充剂或介质诸如复合氮源的混合物引入。任选地所述培养基可含有选 自由W下组成的组的一种或多种还原剂:谷脫巧肤、半脫氨酸、脫胺、硫胶质、二硫下四醇和 二硫苏糖醇。
[0141] 可从培养物除去细胞，随后过滤并浓缩培养上清液W进一步纯化产生的蛋白质。 可使用公知的方法诸如如下方法进一步分离和鉴定表达的多肤:在免疫亲和柱或离子交换 柱上的分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC;在娃±上或在阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析； 聚焦层析;SDS-PAGE;硫酸锭沉淀;使用例如S邱hadex G-75的凝胶过滤;疏水亲和树脂、使 用固定在基质上的适当的抗原的配体亲和力W及蛋白质印迹测定。
[0142] 治疗性/预防性方法和/或用途
[0143] 通过本文所述任何方法鉴定的染色质结合模块抑制化合物可用于治疗性方法。
[0144] 在一个方面，提供了用作药剂的染色质结合模块抑制化合物。在其它方面，提供了 用于治疗癌症的方法的染色质结合模块抑制化合物。在某些实施方案中，本发明提供了用 于治疗个体的方法的染色质结合模块抑制化合物，所述方法包括向所述个体施用有效的染 色质结合模块抑制化合物W治疗癌症。在某些实施方案中，提供了用于治疗方法的染色质 结合模块抑制化合物。在某些实施方案中，提供了用于治疗患有癌症的个体的方法的染色 质结合模块抑制化合物，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述染色质结合模块抑制 化合物。在一个此类实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外 的治疗剂，例如，如下文中描述的。在其它实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症的染色 质结合模块抑制化合物。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗个体的癌症的方法的 染色质结合模块抑制化合物，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述染色质结合模块 抑制化合物来治疗癌症。在其它实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症的染色质结合模 块抑制化合物。在某些实施方案中，本发明提供了用于抑制个体的细胞增殖的方法的染色 质结合模块抑制化合物，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述染色质结合模块抑制 化合物W抑制细胞增殖。在一些实施方案中，染色质结合模块抑制化合物是布罗莫结构域 模块抑制化合物。根据任何上述实施方案的"个体"优选是人。
[0145] 在其它方面，本文中提供了例如用于任何上述治疗性方法的包含任何染色质结合 模块抑制化合物的药物制剂。在一个实施方案中，药物制剂包含任何染色质结合模块抑制 化合物和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体在所使用的剂量和浓度下对受者通常 是无毒的，并且包括，但不限于:缓冲剂诸如憐酸盐、巧樣酸盐和其它有机酸;抗氧化剂，包 括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化锭;氯化六甲双胺;苯扎氯 锭;节索氯锭;苯酪、下基或节醇;对径苯甲酸烷基醋诸如对径基苯甲酸甲醋或对径基苯甲 酸丙醋;儿茶酪；间苯二酪;环己醇;3-戊醇;和间甲酪）；低分子量(小于约10个残基）多肤； 蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙締化咯烧酬;氨基酸 诸如甘氨酸、谷氨酷胺、天冬酷胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物， 包括葡萄糖、甘露糖或糊精;馨合剂，诸如抓TA;糖，诸如薦糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;形 成盐的抗衡离子诸如钢;金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物）；和/或非离子表面活性剂诸 如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质药物分散剂，诸如可 溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白（sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如 rHuPH20(UYLENEX?,Baxter International, Inc.)。某些示例性sHA沈GP和使用方法， 包括riluPH20，描述于美国专利公布第2005/0260186和2006/0104968号中。在一个方面，将 sHASEGP与一种或多种另外的葡糖氨基聚糖酶类诸如软骨素酶组合。
[0146] 在一些实施方案中，药物制剂包含染色质结合模块抑制化合物和至少一种另外的 治疗剂，例如，如下文中所述的。
[0147] 所述染色质结合模块抑制化合物可单独地用于疗法或与其它试剂组合地用于疗 法。例如，可将染色质结合模块抑制化合物与至少一种另外的治疗剂共施用。
[0148] 上述此类联合治疗包括组合施用（其中将两种或更多种治疗剂包含在相同或单独 的制剂中），和分开施用，在该情况下，本文所述染色质结合模块抑制化合物的施用可在另 外的治疗剂施用之前，与之同时和/或之后进行。
[0149] 本文所述染色质结合模块抑制化合物(和任何另外的治疗剂)可通过任何合适的 方法，包括胃肠外、肺内和鼻内施用，并且，如果希望用于局部治疗，可通过病灶内施用、局 部施用或眼内施用化合物。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药 可W通过任何合适的途径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，运部分取决于所述施用 是短暂的还是慢性的。本文涵盖各种给药方案，包括但不限于在不同时间点上的单一或多 次施用、推注施用和脉冲输注。
[0150] 布罗莫结构域介导的病症的实例包括癌症，包括但不限于，听神经瘤、急性白血 病、急性淋己细胞白血病、急性髓细胞白血病(单核细胞、成髓细胞、腺癌、血管肉瘤、星形细 胞瘤、粒单核细胞和早幼粒细胞瘤）、急性T细胞白血病、基底细胞癌、胆管癌、膀脫癌、脑癌、 乳腺癌、支气管癌、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、慢性白血病、慢性淋己细胞白血 病、慢性髓细胞(粒细胞）白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、结直肠癌、烦咽管瘤、囊腺 癌、弥漫性大B细胞淋己瘤、异型增生变化(发育异常和化生）、胚胎癌、子宫内膜癌、内皮肉 瘤、室管膜瘤、上皮癌、红白血病、食道癌、雌激素受体阳性乳腺癌、原发性血小板增多症、尤 因氏瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋己瘤、生殖细胞睾丸癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质 肉瘤、重链病、成血管细胞瘤、肝癌、肝细胞癌、激素不敏感性前列腺癌、平滑肌肉瘤、白血 病、脂肪肉瘤、肺癌、淋己管内皮肉瘤、淋己管肉瘤、成淋己细胞性白血病、淋己瘤(何杰金氏 和非何杰金氏）、膀脫、乳腺、结肠、肺、卵巢、膜腺、前列腺、皮肤和子宫的恶性肿瘤和过度增 生性病症、T细胞或B细胞起源的淋己样细胞恶性肿瘤、白血病、淋己瘤、髓样癌、髓母细胞 瘤、黑素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、粘液肉瘤、神经母细胞 瘤、NUT中线癌(NMC)、非小细胞肺癌、少突神经胶质瘤、口腔癌、成骨性肉瘤、卵巢癌、膜腺 癌、乳头状腺癌、乳头状癌、松果体瘤、真性红细胞增多症、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视 网膜母细胞瘤、横纹肌肉