一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及分析化学、纳米材料等领域，具体涉及一种新型的活细胞中microRNA 分子的检测方法，具体包括活细胞内microRNA分子催化金纳米粒子与量子点之间的去组装 反应，改变GNP与QD之间的荧光共振能量转移效应，对QD的荧光信号进行放大，从而实现对 活细胞中靶标microRNA分子高特异性和高灵敏度的检测方法，并以此实现对肿瘤细胞和正 常细胞的准确区分。
【背景技术】
[0002] 量子点（quantum dots，英文简称QDs)是一种尺度小于或者近似激子波尔粒径的 半导体纳米晶体。相比于传统的有机分子染料，其具有独特且优异的光学性质，比如激发谱 宽且连续分布，发射波长可调，荧光量子产率高，荧光寿命长，抗光漂白性强等，因而在生物 标记成像、光电子器件，光伏太阳能材料等领域具有广泛的应用前景。QDs独特的荧光性质 使得其能够作为荧光共振能量转移效应的理想供体；同时由于高效的表面等离子共振效应 和对可见波段光谱的强烈吸收性能，金纳米粒子(英文简称GNP)能够作为荧光共振能量转 移效应的理想受体。
[0003] DNA分子是遗传信息的载体，其由于Watson-Crick碱基互补配对原则而具有可编 程性；以toe-hold(中文名叫立足点，它是DNA链取代反应中需要的条件)介导的DNA链取代 反应，可以实现DNA双链与单链之间有序的取代反应。以含有PS段（即磷硫键，P-S)和P0段 (即磷氧键，P-0 )的DNA作为模板分子来合成量子点的方法，不仅能够简单而直接地对QD表 面进行DNA共价偶联修饰，还能够通过调节PS段的长度以及量子点的粒径大小来精确控制 量子点表面的DNA分子的数量；同时外部的P0段仍处于自由伸展状态，保持着DNA的可编程 性。同样，由于巯基(-SH)与Au原子之间强烈的共价键结合能力，修饰了-SH的DNA分子能够 轻易地被修饰到GNP的表面，所修饰的DNA分子同样保持着可编程性。因此，上述方法所获得 的DNA修饰的QD和GNP，可以通过DNA分子实现程序化地可控地自组装并形成具有高效荧光 共振能量转移效应的GNP-QD纳米组装体。
[0004] MicroRNA是一类关键的非编码性微小RNA分子，其对于细胞中基因表达有着重要 的调控作用。MicroRNA的非正常表达往往跟多种疾病，特别是肿瘤的发生发展有着密切的 关联。因此对microRNA的特异性和高灵敏度的检测将具有十分重要的意义。现有的 microRNA分子的检测方法，主要集中于体外检测，包括聚合酶链式反应(即PCR)和分子信标 (即Molecular Beacon)的方法。体外检测首先要求将microRNA分子从细胞中提取出来。然 而提取过程不仅耗时耗力，也往往会对原有的microRNA分子产生污染，如提取过程的效率 问题往往导致获得的microRNA分子的浓度少于细胞中的实际值;或者因为核酸酶的影响， 使得microRNA分子在提取过程中被部分降解等。因此发展一种在活细胞中直接的、特异性 和高灵敏度的microRNA分子的检测方法将会具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，解决了目前 microRNA分子的检测方法提取过程效率低、灵敏度不够高的问题。
[0006] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种新型的活细胞中microRNA分子 的检测方法，包括以下步骤： 第一步，通过DNA3将修饰有DNA1的GNP和修饰有DNA2的QD通过DNA碱基互补配对规则进 行程序化地组装，获得GNP-QD纳米组装体，所述DNA1和DNA2均能够与DNA3进行碱基互补配 对，所述DNA1含有至少一个巯基，所述DNA2含有磷硫键;在组装体中，由于QD与GNP之间的高 效荧光共振能量转移效应，QD本身的荧光性能被暂时淬灭；其中，所述GNP的粒径范围为5 nm~100 nm;所述QD的发射波长范围从450 nm~750 nm; 第二步，用脂质体将所述GNP-QD纳米组装体和DNA4-起转染到活细胞中共培养，DNA4 能够与DNA3进行碱基互补配对;之后，在活细胞中表达的靶标microRNA分子的催化作用下， 所述GNP-QD纳米组装体发生催化去组装，使GNP与QD相分离，此时由于QD与GNP之间的荧光 共振能量转移效应消失，QD本身的荧光信号获得恢复，细胞能够发出荧光；所述靶标 mi croRNA分子为活细胞中任意高表达的mi croRNA分子； 第三步，通过细胞的荧光成像，实现对靶标microRNA分子的特异性和高灵敏的定性检 测。
[0007] 上述技术方案中的有关内容解释如下： 1、上述方案中，较佳的方案是所述QD的成分选自CdTe、CdSe、CdS二元量子点中的任意 一种，或选自2]1取56、0(1取56、2111115、211(](156合金量子点中的任意一种，或选自0(156/2115、 ZnSe/ZnS、CdTe/ZnS核壳型量子点中的任意一种，在或者选自单质量子点Si、P、C中的任意 一种。
[0008] 2、上述方案中，所述DNA1和DNA2都是单链DNA，并且均能与DNA3进行碱基互补配 对，以此，DNA3将修饰有DNA1的GNP和修饰有DNA2的QD组装起来。
[0009] 3、上述方案中，由于活细胞中microRNA分子数量很少，而进入到活细胞中的GNP-QD纳米组装体数量较多，因此mi croRNA只能进行有限次的反应，mi croRNA只能与GNP-QD纳 米组装体按照摩尔比为1:1进行反应，加入了DNA4就可以使microRNA进行循环放大反应，也 就是说重复利用单个microRNA分子将多个QD与GNP进行解离，使预先被猝灭的QD荧光信号 恢复并被多级放大。
[0010] 4、上述方案中，所述脂质体的作用是主要是用来转染DNA4-1。脂质体是一个比较 成熟的商品化试剂，用来向活细胞中转染外界物质，常常用作基因转染。在上述方案中，主 要借助它来转染DNA4,因为单独的DNA4是不能进入到细胞的。当然脂质体也可以将GNP-QD 转入细胞，所以GNP-QD的转染不仅能依靠自身具有的转染特性，还能借助脂质体的转染作 用，结果是GNP-QD的转染效率会大大增加。
[0011 ] 5、上述方案中，当GNP-QD组装体进入到不表达革巴标mi croRNA分子的正常细胞中 时，GNP-QD的去组装反应不会被诱发，QD不会从组装体上游离出来，其荧光不会恢复，细胞 也不会发出荧光。
[0012]本发明设计原理以及有益效果是： 本发明在上述已有的技术基础上，提出了一种基于纳米组装体的催化放大去组装和QD 荧光成像方法，实现在活细胞中直接的、特异性和高灵敏度的mi croRNA分子检测的方法。首 先将修饰有DNA的GNP和QD通过DNA碱基互补配对规则进行程序化地组装，获得GNP-QD纳米 组装体。在组装体中，由于QD与GNP之间的高效荧光共振能量转移效应，QD本身的荧光被暂 时淬灭。当GNP-QD组装体进入到肿瘤细胞后，在其表达的祀标microRNA分子的作用下，通过 miRNA与DNA分子之间的程序化反应对GNP-QD组装体进行催化去组装，使组装体中的QD游离 出来并恢复其荧光信号，从而实现对靶标microRNA分子的检测。总之，通过细胞的荧光成 像，能够实现对靶标microRNA分子的特异性和高灵敏检测，并可以用做区分肿瘤细胞和正 常细胞的依据。这种活细胞中microRNA检测的方法依据的核心原理是GNP与QD之间因为DNA 介导的程序化组装和催化去组装，使得相互之间的距离发生变化从而导致的荧光共振能量 转移效应的发生和消失。
【附图说明】
[0013] 附图1为本发明实施例一的由DNA1和DNA2-1分别修饰的粒径为13 nm的GNP和发射 波长为630 nm CdTe量子点，通过DNA3-1组装成GNP-QD组装体的电镜图； 附图2为本发明实施例一的在存在DNA4-1的前提下，GNP-QD组装体在细胞外与靶标 microRNA-21分子作用6小时后，在365nm紫外灯下获得的荧光照片;microRNA-21与DNA3-1 的摩尔比例从左至右依次是0，1·0,0·1，0·02,0·01，0·004,0·002,0·001，0·0005 ; 附图3为本发明实施例一的在不存在DNA4-1的前提下，图1中GNP-QD组装体在细胞外与 靶标microRNA-21分子作用6小时后，在365nm紫外灯下获得的荧光照片;microRNA-21与 DNA3-1 的摩尔比例从左至右依次是1，0·1，0·02,0·01，0·004,0·002,0·001; 附图4为附图2和附图3中不同摩尔比例的mi croRNA-21与DNA3-1，所对应的荧光光谱强 度变化曲线； 附图5为细胞外，将提取的不同细胞的microRNA与附图1中GNP-QD组装体分别进行作 用，在DNA4-