1参与或者不参与的情况下，在365nm紫外灯下分别获得的荧光照片； 附图6为在活的HeLa细胞中，对由DNA1和DNA2-1分别修饰的GNP和QD并由DNA3-1组装的 GNP-QD组装体和DNA4-1，使用脂质体进行转染，并与HeLa细胞共培养6小时后，在荧光显微 镜下获得的成像图（左图是荧光图，右图是细胞明场图）； 附图7为在活的MCF-7细胞中，对由DNA1和DNA2-2分别修饰的GNP和QD并由DNA3-2组装 的GNP-QD组装体和DNA4-2,使用脂质体进行转染，并与MCF-7细胞共培养6小时后，在荧光显 微镜下获得的成像图（左图是荧光图，右图是细胞明场图）； 附图8为在活的MDA-MB-231细胞中，对由DNA1和DNA2-3分别修饰的GNP和QD并由DNA3-3 组装的GNP-QD组装体和DNA4-3,使用脂质体进行转染，并与MDA-MB-231细胞共培养6小时 后，在荧光显微镜下获得的成像图（左图是荧光图，右图是细胞明场图）； 附图9为在活的HEK-293细胞中，对由DNA1和DNA2-1分别修饰的GNP和QD并由DNA3-1组 装的GNP-QD组装体和DNA4-1，使用脂质体进行转染，并与HEK-293细胞共培养6小时后，在荧 光显微镜下获得的成像图（左图是荧光图，右图是细胞明场图）。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述： 实施例一:一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法 第一步，通过DNA3-1将修饰有DNA1的5 nm金纳米粒子(GNP)和修饰有DNA2-1的发射波 长为450 nm锌镉硒量子点（ZnCdSe)按照碱基互补配对规则进行程序化地组装，获得GNP-QD 纳米组装体;所DNA1和DNA2-1均能够与DNA3-1进行碱基互补配对； 第二步，使用脂质体将GNP-QD组装体和DNA4-1-起转染到子宫颈癌细胞(HeLa)中，共 培养6小时； 第三步，将HeLa细胞在荧光显微镜下进行荧光成像，以检测其中是否含有靶标 microRNA-21〇
[0015] 实施例二:一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法 第一步，通过DNA3-2将修饰有DNA1的13 nm金纳米粒子(GNP)和修饰有DNA2-2的发射波 长为550 nm CdTe量子点（CdTe)，按照碱基互补配对规则进行程序化地组装，获得GNP-QD纳 米组装体，所DNA1和DNA2-2均能够与DNA3-2进行碱基互补配对； 第二步，使用脂质体将将GNP-QD组装体和DNA4-2-起转染到人乳腺癌细胞(MCF-7)中， 共培养6小时； 第三步，将MCF-7细胞在荧光显微镜下进行荧光成像，以检测其中是否含有靶标 microRNA-203。
[0016] 实施例三:一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法 第一步，通过DNA3-3将修饰有DNA1的30 nm金纳米粒子(GNP)和修饰有DNA2-3的发射波 长为750 nm的锌汞硒量子点（ZnHgSe)，按照碱基互补配对规则进行程序化地组装，获得 GNP-QD纳米组装体;所DNA1和DNA2-3均能够与DNA3-3进行碱基互补配对； 第二步，使用脂质体将将GNP-QD组装体和DNA4-3-起转染到人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)中，共培养6小时； 第三步，将MDA-MB-231细胞在荧光显微镜下进行荧光成像，以检测其中是否含有靶标 microRNA-141〇
[0017] 实施例四：一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法 第一步，通过DNA3-1将修饰有DNA1的100 nm金纳米粒子(GNP)和修饰有DNA2-1的发射 波长为600 nm的硒化镉/硫化锌核壳型量子点（CdSe/ZnS)，按照碱基互补配对规则进行程 序化地组装，获得GNP-QD纳米组装体;所DNA1和DNA2-1均能够与DNA3-1进行碱基互补配对； 第二步，使用脂质体将将GNP-QD组装体和DNA4-1 -起转染到人胚肾细胞(HEK-293)中， 共培养6小时； 第三步，将HEK-293细胞在荧光显微镜下进行荧光成像，以检测其中是否含有靶标 microRNA-21〇
[0018] 有关实施例一~实施例四的解释说明： 1、对肿瘤细胞和正常细胞的区分的标准:肿瘤细胞中有高表达的microRNA分子，那么 GNP-QD组装体进入后，QD就会被解离下来，发出荧光，细胞在荧光显微镜下观察就是亮的。 也就是说一旦细胞亮了，那么该细胞里面就有高表达的microRNA，也因此该细胞是肿瘤细 胞;反之，细胞在荧光显微镜下不亮，那么该细胞中就不表达这种microRNA，细胞也就是正 常的细胞。
[0019] 2、对附图1至附图9的说明：附图1说明GNP-QD纳米组装体的成功构建； 附图2说明在DNA4-1的参与下，mi croRNA-21可以催化QD从组装体中去组装，并放大性 地恢复QD原有的荧光； 附图3说明在没有DNA4-1的参与下，mi croRNA-21不能单独催化QD从组装体中去组装， QD原有的荧光不能被恢复； 附图4说明在DNA4-1的参与下，microRNA-21可以催化GNP-QD组装体的去组装反应过 程，实现QD荧光信号的放大性恢复，反之，则不会发生荧光放大性恢复； 附图5说明在HeLa、MCF-7和MDA-MB-231等肿瘤细胞中存在着高表达的mi croRNA-21;而 在HEK-293正常细胞中则没有可以被检测到的microRNA-21 (1、3、5、7有DNA4-1参与；2、4、6、 8没有DNA4-1参与）； 附图6说明He la细胞中存在着高表达的靶标mi croRNA-21分子； 附图7说明MCF-7细胞中存在着高表达的靶标microRNA-203分子； 附图8说明MDA-MB-231细胞中存在着高表达的靶标mi croRNA-141分子； 附图9说明HEK-293细胞中不存在可被检测到的靶标microRNA-21分子。
[0020] 3、下表为实施例一~实施例四中涉及到的DNA和microRNA序列：
表格中DNA2-l、DNA2-2、DNA2-3序列中打星号的碱基为PS段，不打星号的那一部分为 P0段。
[0021] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人 士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明 精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，其特征在于:所述检测方法包括以 下步骤： 第一步，通过DNA3将修饰有DNA1的GNP和修饰有DNA2的QD通过DNA碱基互补配对规则进 行程序化地组装，获得GNP-QD纳米组装体，所述DNA1和DNA2均能够与DNA3进行碱基互补配 对，所述DNA1含有至少一个巯基，所述DNA2含有磷硫键;在组装体中，由于QD与GNP之间的高 效荧光共振能量转移效应，QD本身的荧光性能被暂时淬灭；其中，所述GNP的粒径范围为5 nm~100 nm;所述QD的发射波长范围从450 nm~750 nm; 第二步，用脂质体将所述GNP-QD纳米组装体和DNA4-起转染到活细胞中共培养，DNA4 能够与DNA3进行碱基互补配对;之后，在活细胞中表达的靶标microRNA分子的催化作用下， 所述GNP-QD纳米组装体发生催化去组装，使GNP与QD相分离，此时由于QD与GNP之间的荧光 共振能量转移效应消失，QD本身的荧光信号获得恢复，细胞能够发出荧光；所述靶标 mi croRNA分子为活细胞中任意高表达的mi croRNA分子； 第三步，通过细胞的荧光成像，实现对靶标microRNA分子的特异性和高灵敏的定性检 测。2. 根据权利要求1所述的一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，其特征在于： 所述QD的成分选自CdTe、CdSe、CdS二元量子点中的任意一种，或选自ZnHgSe、CdHgSe、 ZnInS、ZnCdSe合金量子点中的任意一种，或选自CdSe/ZnS、ZnSe/ZnS、CdTe/ZnS核壳型量子 点中的任意一种，在或者选自单质量子点Si、P、C中的任意一种。
【专利摘要】一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，其特征是利用细胞内特异表达的靶标microRNA分子作为催化剂，催化金纳米粒子-量子点组装体的去组装反应，重复利用单个microRNA分子将多个QD与GNP进行解离，使预先被猝灭的QD荧光信号恢复并被多级放大，从而实现对活细胞内靶标microRNA分子的高灵敏度检测与成像，并以此作为区分肿瘤细胞和正常细胞的依据。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105567807
【申请号】CN201510943412
【发明人】马楠, 何学文
【申请人】苏州大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月16日