7.38(dd，J = 2.76,8.78Hz，lH)、6.88(d，J = 8.78Hz，lH)、4.12 (q，J = 7.03Hz，lH)、3.80(s，3H)、3.76(q，J = 6.00Hz，lH)、3.02(t，J = 6.53Hz，2H)、2.71(s， 6H)〇
[0151 ]实施例4.(方案2中的化合物)10的制备
[0152] 在（方案2中的化合物）8(2.93111111〇1，1等份）和（方案2中的化合物）9(3.28111111 〇1， 1.12等份)溶解于1，2-二氯乙烷的溶液中添加乙酸(3.28mmo 1，1.12等份）。在室温下搅拌混 合物1小时，然后逐步添加溶于甲醇(30mL)的NaCNBH3(3.9mmo 1，1.3等份）。该混合物在室温 下搅拌过夜。添加水(2mL)以终止反应。去除溶剂，并且(化合物）10的粗产品使用柱色谱通 过DCM/Me0H(90/10)进行纯化。（化合物）10的化学结构通过NMR确定，其纯度通过HPLC和LC-MS确定。
[0153] 实施例5.(方案3中的化合物)13的制备
[0154] 将浓缩硫酸（7mL)逐滴添加到乙酸酐（80mL)和乙酸(40mL)的混合物中。使用冰浴 冷却混合物。添加4-甲苯磺酰胺ll(12g，70mm 〇l)并将反应温度维持在低于5°C。分批次添加 氧化铬（8g，80mmol)。然后将反应混合物在5-10°C下搅拌4小时，然后将溶液倒在冰水中 (500mL)。使用DCM(3 X 100mL)萃取水溶液。使用卤水冲洗组合有机相，通过无水硫酸钠干燥 该组合有机相并将其浓缩从而获得作为黄色油的(4-氨磺酰苯基)亚甲基二醋酸酯12。
[0155] 将在最后步骤中获得的所述黄色油溶于乙醇（lOmL)中。添加水（lOmL)和浓缩的硫 酸(2mL)。将反应混合物加热至回流并搅拌2小时。浓缩溶剂并用水(50mL)稀释残留物。使用 乙酸乙酯(2 X 20mL)萃取水溶液。通过硫酸钠干燥该组合有机相并将其浓缩。通过硅胶柱纯 化残留物(洗脱液：己烷/EA 3:1至1:1)以获得作为白色固体的（化合物）13 (1.5g，12 %收 率）：1H NMR(400MHz，DMSO)Sl〇.〇9(s，1H)、8.10((1, J = 8.3Hz，2H)、8.03((1, J = 8.3Hz，2H)、 7.59(s，2H)〇
[0156] 实施例6.(方案3中的化合物)16的制备
[0157] 在溶解于乙醇（15mL)的5-氯-2-甲氧基苯甲酸14(500mg，2.68mmol)的溶液中添加 浓缩的硫酸(O.lmL)。在回流下加热混合物8小时。在真空下浓缩溶剂。使用乙酸乙酯稀释残 留物，以及使用饱和NaHC0 3溶液和卤水冲洗溶液。通过硫酸钠干燥有机相，并将其浓缩从而 获得作为无色油的乙基5-氯-2-甲氧基苯甲酸盐15。
[0158] 使用乙醇（1〇111〇稀释上述无色油。添加无水肼（25811^，8.041]11]1〇1)。在回流下加热 反应混合物整夜，然后允许其冷却至室温。形成白色针状晶体，并通过过滤对其进行收集。 使用乙醇对晶体进行洗涤，并干燥以提供期望的产品16 ( 3 3 0 m g，61 %收率）：1Η N M R (400MHz，DMS0)S9.30(s，lH)、7.61(d，J = 2.8Hz，lH)、7.49(dd，J = 8.9,2.8Hz，lH)、7.15(d， J = 8.9Hz，lH)、4.54(s，2H)，3.86(s，3H)。
[0159]实施例7.(方案3中的化合物)17的制备
[0160]在(方案 3 中的化合物）13(2001^，1111111〇1)和(方案3中的化合物）16(21711^，1111111 〇1) 溶解于乙醇(5mL)的悬浮液中添加一滴乙酸。在回流下加热该混合物过夜。通过过滤收集沉 淀物，并用乙醇(2X5mL)冲洗所述沉淀物。干燥所述白色固体以获得期望的产品17(353mg， 96%收率）：? NMR(400MHz，DMS0)Sll.72(s，lH)、8.38(s，lH)、7.92-7.86(m，4H)、7.60((1,J = 3.1Hz，lH)、7.56(dd，J = 8.9,2.8Hz，lH)、7.43(s，2H)、7.21(d，J = 8.9Hz，lH)、3.87(s， 3H)〇
[0161] 实施例8.(方案3中的化合物)18的制备
[0162] 将(方案3 中的化合物）17 (200mg，0 · 54mmo 1)和NaBH3CN( 5 lmg，0 · 82mmo 1)溶于丁册-MeOH (v/v 1:1，6mL)的悬浮液在室温下搅拌24小时。使用浓缩的盐酸（lmL)终止反应。然后， 使用饱和的NaHC03溶液使混合物碱化。形成白色沉淀物并通过过滤收集所述白色沉淀物。 使用水冲洗白色固体，并对其进行干燥以提供期望的产品18(178mg，89 %收率）：咕匪R (400MHz，丙酮）δ9.26((1, J = 5.6Hz，1H)、7.95((1, J = 2.8Hz，lH)、7.89((1, J = 8.4Hz，2H)、 7.62(d，J = 8.4Hz，2H)、7.49(dd，J = 8.9,2.8Hz，lH)、7.18(d，J = 8.9Hz，lH)、6.56(s，2H)、 5.54(d，J = 6.0Hz，lH)、4.17(d，J = 4.5Hz，2H)、3.92(s，3H)。
[0163] 实施例9.对NLRP3炎性小体的抑制可以限制缺血-再灌注之后的心肌损伤
[0164] 简介
[0165] 在急性心肌梗塞(AMI)期间会发生强烈的炎症反应，该反应的强度可以预测不利 的结果。缺血性坏死期间胞内物的分泌会导致在白血球和驻留细胞(resident ce 11 s)包括 心肌细胞（图1)中形成大分子结构和炎性小体。在损伤期间炎性小体的活化会通过促进白 介素 lf3(IL-lf3)的分泌和细胞死亡而极大地放大炎症反应。NLRP3(NALP3或cryopyrin)是细 胞内感受器的一种，Nod样受体(NLR)家族的一部分，会引起炎性小体的形成和半胱天冬酶-1的活化。在细胞死亡期间，细胞外ATP导致K+从细胞中流出，以及随后NLRP3的活化。小鼠中 NLRP3的沉默或基因删除限制了试验中AMI的梗塞面积，表明NLRP3炎性小体可以作为药物 抑制的可用(viable)标革巴。
[0166] NLRP3在炎症疾病中的中心作用在Cryopyrin相关的周期综合征(CAPS)中非常显 著，所述CAPS是这类病症:其中组成性激活型（constitutively active)NLRP3由于点突变 而导致炎性小体不能控制的活化，从而导致严重的、经常致命的炎症疾病。然而，临床上可 购的NLRP3抑制剂是短缺的。格列本脲，作为一种广泛使用的抗糖尿病药物(磺酰脲类），具 有体外NLRP3抑制性活性，但是格列本脲作为体内抑制剂的应用需要非常高的剂量，例如比 在糖尿病中的使用高数百倍，其不可避免地与致命的低血糖相关。
[0167] 格列本脲分子中的环己基脲部分通过抑制KATP通道从而涉及胰腺细胞中胰岛素 的分泌，然而其对于NLRP3抑制效应并不是必须的。该实施例描述了 16673-34-0对NLRP3炎 性小体活性的抑制效应，16673-34-0为合成格列本脲的中间物质，它不包含涉及胰岛素分 泌的环己基脲部分。16673-34-0在此处也被称为式III的化合物，其是上述方案I中的化合 物5 〇
[0168] 方法
[0169]设计并合成格列本脲类似物。已经证实最近报道的一种包含磺酰氯基团的类似物 (化合物1，图2)保留了格列本脲的一部分抗炎症活性，并且对胰岛素没有作用（Lamkanfi 等，J Cell Biol 2009;18761-18770)。然而，化合物1包含具有化学反应性的磺酰氯部分， 其可能使得化合物1成为非选择性的cryopyrin炎性小体抑制剂。因此，设计了化学性质稳 定的类似物2和3以评估磺胺剂和磺酸部分能否保留其对cryopyrin炎性小体的抑制活性。 [0170]化合物2和3的合成按照方案1(图3)中所示进行。简而言之，4(5-氯-2-甲氧基苯甲 酸)和5(2-苯乙胺）（两种物质可以在市场上获得)在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二 亚胺(EDCI)存在下的偶联反应，提供(化合物)6(酰胺中间产物，5-氯-2-甲氧基-N-(2-苯乙 基)-苯甲酰胺）。通过先向（化合物)5中添加氯磺酸，然后在85°C下加热，实现(化合物)6的 磺化以形成(化合物）1。通过使(化合物）1与ΝΗ 40Η进行反应来制备磺胺类似物2(5-氯-2-甲 氧基-N-[ 2-(4-磺酰胺基苯基)-乙基]-苯甲酰胺（16673-34-0))。（化合物）1在H20回流条件 下的水解以较好的收率获得磺酸3。
[0171 ]体外炎性小体形成的测定
[0172] J774A.1细胞，小鼠巨噬细胞株，通过添加了 10%胎牛血清(FBS)(Sigma_Aldrich， 圣路易斯市，密苏里州）的RPMI(洛斯维帕克纪念研究所)培养基(aiBCO?,中央格兰德岛， 纽约）以5 X104细胞/孔的密度在培96多孔板中培养接种24小时。使用大肠杆菌0111 :B4月旨 多糖(LPS) (25]^/1]11^;3丨81]^-41(11'；[(311)(]^8/1111)启动(口1'；[1116)细胞4小时，然后使用41?(51111) 处理30分钟以诱导NLRP3炎性小体的形成。收集上清液，使用小鼠 IL-lffiLI SA试剂盒(赛默 飞世尔科技，普林斯顿，新泽西州）测量IL-β的水平。为了测试16673-34-0对NLRP3炎性小体 活化的抑制效应，使用16673-34-0(400μΜ)或格列本脲(400μΜ)在ATP处理30分钟时共同处 理细胞，并读取IL-Ιβ水平。
[0173] 在独立的实验中，使用永生化成年鼠心肌细胞(HL-1)。使用建议的Claycomb培养 基（西格玛奥德里奇公司）培养细胞(Claycomb等，n Proc Natl Acad Sci USA 1998;95: 2979-2984)，然后如前所述使用LPS(25ng/mL)引发细胞2小时，接着用ATP(5mM)处理1小时， 用于诱导NLRP3炎性小体的形成（Mezzaroma等，Proc Natl Acad Sci USA 2011;108: 19725-19730)。然后使用16673-34-0(400μΜ)或格列本脲(400μΜ)在LPS引发阶段处理HL-1 细胞，然后用ATP处理。使用前述ASC聚集(免疫组织化学）、半胱天冬酶-1活性(酶活性)和细 胞死亡（台盼蓝染色排除法)测定和定量HL-1细胞中NLRP3炎性小体的形成。简而言之，在实 验之前，针对免疫组织化学，在35-mm培养皿中将2.5 X 105个HL-1细胞接种于24 X 24mm涂覆 有明胶/纤维连接蛋白（0.02-0.5%)的盖玻片上。ASC表达以外接细胞质核周聚集被检测， 以及表示为每个视野中全部细胞中的ASC-+细胞，通过两组不同的研究人员对ASC聚集进行 盲定量。关于NLRP3炎性小体活化的读取，评估半胱天冬酶-1的酶活性和细胞死亡。简而言 之，HL-1细胞(2X10 6个细胞)接种于90-mm培养皿中，如上所述诱导NLRP3炎性小体的形成。 在处理之后，为测量半胱天冬酶-1的活性，冲洗、回收和冷冻细胞。使用包含蛋白酶抑制剂 (西格玛奥德里奇公司）的混合物的RIPA缓冲液(西格玛奥德里奇公司）重悬细胞球粒，然后 在16,200 Xg下离心20分钟。收集上清液，使用Bradford法对蛋白质含量进行定量。通过测 量由于荧光底物的裂解而产生的荧光来测定半胱天冬酶-1的活性。荧光被报道为lyg样品 每分钟产生的任意荧光单元(荧光/yg/min)。使用台盼蓝染色排除法测定HL-1心肌细胞的 细胞死亡。简而言之，对HL-1细胞进行上述处理，收集并重悬于lml的Claycomb培养基中，接 着用100yL0.4%的台盼蓝温育染色，在室温下温育5分钟。台盼蓝阳性细胞被认为是不能存 活的，细胞死亡的比例测定为每个视野(field)中台盼蓝阳性细胞占所有细胞数的比例。我 们也使用20μΜ尼日利亚菌素 (Enzo Life Sciences Inc，法明代尔，纽约），其为一种成孔毒 素，使得K+以与ATP结合P2X7受体相似的方式从细胞中流出。为了测定NLRP3炎性小体的特 异性以及排除其他炎性小体的效果，将HL-1细胞（IX 106)接种于35mm培养皿中，并用鞭毛 蛋白或聚-脱氧腺苷-脱氧胸苷酸钠盐(聚(dA:dT))处理以分别诱导不参与NLRP3感受器活 化的NLRC4和AM2炎性小体。将0.7ug/ml的从鼠伤寒沙门氏菌14028中分离的鞭毛蛋白（恩 佐生命科学，法明代尔，纽约）添加到Claycomb培养基中（不含胎牛血清(FBS))。为了诱导 NLR(34炎性小体，先通过Ρο 1 yp 1 u s转染试剂盒（P U LSin S'.,纽约