1.0%，PBS配制)和草酸(1.0%，PBS配制)的混合溶液处理切片直到棕色褪去(大致1-6分钟，待切片的棕色褪去再处理30秒即可)，PBS2分钟3次。[0081 ] 3.组化笔画圈，将血管肽2与FITC形成的缀合物对应的切片和Th1flavinS对应的切片分别进行染色，步骤分别如下:
[0082]血管肽2与FITC形成缀合物的染色:(上接第3步)
[0083]4.血管肽2与FITC形成缀合物的溶液(0.1mM) 300ul滴染，37度湿盒中lh。
[0084]5.PBS 洗 10 分钟 2 次。
[0085]6.70%甘油封片，4°C保存。
[0086]Th1flavin S染色的步骤:(上接第3步)
[0087]7.Th1flavinS (0.5g%溶解于 PBS 中)，染色 20 分钟(滴染)。
[0088]8.70%乙醇分化10分钟，PBS5分钟。
[0089]9.80%甘油封片。
[0090]结果如图9所示，A图为血管肽2与FITC形成的缀合物染色图，B图为正对照Th1flavin S染色图。白色箭头所示为淀粉样蛋白沉积。该图说明血管肽2与FITC形成的缀合物能够与AD病人脑切片中的淀粉样蛋白沉积相结合。
[0091]实施例4:血管肽2与FITC形成的缀合物标记APP转基因小鼠脑切片的荧光染色方法
[0092]使用连续的APP转基因小鼠脑切片进行对比染色，步骤如下:
[0093]1.PBS (Ph7.4)洗 5 分钟 2 次。
[0094]2.高锰酸钾(0.25%, PBS配制)溶液处理20分钟(待切片出现棕色)，PBS2分钟3次；偏重亚硫酸钾(1.0%，PBS配制)和草酸(1.0%，PBS配制)的混合溶液处理切片直到棕色褪去(大致1-6分钟，待切片的棕色褪去再处理30秒即可)，PBS2分钟3次。
[0095]3.组化笔画圈，将血管肽2与FITC形成缀合物对应的切片和Th1flavinS对应的切片分别进行染色，步骤分别如下:
[0096]血管肽2与FITC形成缀合物的染色:(上接第3步)
[0097]4.血管肽2与FITC形成缀合物的溶液(0.1mM) 300ul滴染，37°C湿盒中lh。
[0098]5.PBS 洗 10 分钟 2 次。
[0099]6.70%甘油封片，4°C保存。
[0100]Th1flavin S染色的步骤:(上接第3步)
[0101]7.Th1fIavinS(0.5g%溶解于 PBS 中)，染色 20 分钟(滴染)。
[0102]8.70%乙醇分化10分钟，PBS5分钟。
[0103]9.80%甘油封片。
[0104]结果如图10所示，A图为血管肽2与FITC形成的缀合物染色图，B图为正对照Th1flavin S染色图。白色箭头所示为淀粉样蛋白沉积。该图说明血管肽2与FITC形成的缀合物能够与APP转基因小鼠脑切片中的淀粉样蛋白沉积相结合。
[0105]实施例5:血管肽2与FITC形成缀合物和A β 1-42相互作用的实验方法
[0106]1.取 Αβ 1-42 固体，溶解于 PBS(PH7.4)中，浓度为 0.25mg/ml，即 55.38uM。37°C水浴摇床孵育42小时。
[0107]2.配制溶液(含10% DMF)，分别含有血管肽2与FITC形成的缀合物(1uM)以及Αβ 1-42聚集物(0，5，1uM)或者BSA(45ug/mL)，将混合溶液置于37°C孵育30分钟。
[0108]3.配置溶液(含10% DMF)，分别含有血管肽2与FITC形成的缀合物(0_3.75uM)以及Αβ 1-42聚集物(2.2uM)或者BSA(lOuM)，将混合溶液置于37°C孵育30分钟。
[0109]4.将上步中的各种混合溶液分别用荧光分光光度计检测其发射光谱，发射波长为333nm，最大发射波长为531nm，范围500_600nm。
[0110]5.用 GraphPad Prism5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)绘制曲线，计算其平衡解离常数。
[0111]结果如图11所示，血管肽2与FITC形成的缀合物与A β 1-42呈饱和曲线式相互作用，经计算其平衡解离常数为676.3ηΜ。说明其能够与Αβ 1_42相互作用并呈饱和曲线式结合方式。
[0112]实施例6:血管肽2与FITC形成缀合物给予APP转基因小鼠静脉注射后脑切片的荧光显微观察实验方法
[0113]APP转基因小鼠用戊巴比妥钠(80mg/kg)的麻醉剂麻醉，尾静脉注射血管肽2与FITC形成缀合物23mg/kg。30分钟后，小鼠被处死，大脑被小心地剥离出来用液氮冷冻。而主要的脏器包括心、肝、脾、肺、肾和肌肉则分别取出进行荧光扫描(caliper Iifesciences公司的活体光学成像系统，IVIS imaging system)。其大脑用冰冻组织切片机(LeciaCM1950)切成约厚25m的切片，置于荧光显微镜(1X8，OLYMPUS)观察拍照。
[0114]结果如图12所示，图中白色箭头所示为淀粉样蛋白沉积。该图说明了血管肽2与FITC形成的缀合物能够与在体结合并标记APP转基因小鼠脑切片中的淀粉样蛋白沉积。
[0115]实施例7:血管肽2与Cy5.5形成缀合物给予APP转基因小鼠静脉注射后在体近红外成像实验方法
[0116]光学在体显像研究在caliper Iifesciences公司的活体光学成像系统(IVISimaging system)上进行,设置感光滤光片为Cy5.5,而发射谱带通滤色片为640nm。成像前，小鼠用异氟烷与氧气混合气体麻醉，并且脸朝下放置在成像板上。白光摄影(曝光时间
0.2秒)和近红外荧光显像(曝光时间5秒)分别在一样的大小的视野(FOV)下摄取(F0V=12.5cm, f/stop = I, Bin = I),时间点包括注射前和静脉注射药物后的几个选定的时间点，每只小鼠注射量为13mg/kg。白光成像和近红外荧光成像叠加起来确定位于颅内部分的大小。最后，成像图像使用 living image software (caliper lifesciences)处理。
[0117]结果如图13所示，显示血管肽2与Cy5.5形成缀合物在APP小鼠脑中聚集并于20小时后清除。该图说明了血管肽2与FITC形成的缀合物能够穿过血脑屏障并在体聚集于APP转基因小鼠脑中。
[0118]实施例8:血管肽2与Cy5.5形成缀合物给予APP转基因小鼠静脉注射后脑切片的荧光显微观察实验方法
[0119]静脉给药(13mg/kg)30分钟后，小鼠被处死，大脑被小心地剥离出来用液氮冷冻。而主要的脏器包括心、肝、脾、肺、肾和肌肉则分别取出进行荧光扫描。其大脑用冰冻组织切片机(CM1950，Lecia)切成约厚25m的切片，置于荧光显微镜(1X8，OLYMPUS)观察拍照。
[0120]结果如图14所示，图中白色箭头所示为淀粉样蛋白沉积。该图说明了血管肽2与Cy5.5形成的缀合物能够与在体结合并标记APP转基因小鼠脑切片中的淀粉样蛋白沉积。
【主权项】
1.一种式R-L-M的缀合物，其中R是血管肽2，L是接头或者化学键，M是光学显像基团、放射性同位素或者适用于MRI，CT检测的显像基团。2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述血管肽2的序列为TFFYGGCRGKRNNFKTEEY。3.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述光学显像基团为FITC、Cy5.5、荧光蛋白。4.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述放射性同位素为99mTc、1231、1251、1311、nC、13N、15O、18F、22Na、52Fe、64Cu、68Ga、76Br、82Rb。5.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述MRI检测的显像基团为19F、13C、15N、Mn'Gd' Dy' Fe' Fe3+元素或者纳米铁、Gd-DTPA, Gd-DOPA, Mn-DI3DP、氧化铁颗粒、转铁蛋白、卟啉化合物或金属螯合物。6.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述CT检测的显像基团为碘原子，纳米金颗粒。7.一种药物或显像剂，所述药物或显像剂包含权利要求1-6任一项所述的缀合物，或者其药学可接受的盐。8.—种靶向淀粉样蛋白沉积的方法，其中使用权利要求1-6任一项所述的缀合物或血管肽2作为靶向剂。9.权利要求1-6任一项所述的缀合物用于制备显像与诊断淀粉样蛋白相关疾病、监控所述疾病发生发展过程、观测靶向于淀粉样蛋白沉积的药物治疗效果，淀粉样蛋白疾病动物模型的诊断、病程监测和疗效评估的药物或试剂盒的用途。10.根据权利要求9所述的用途，其中所述淀粉样蛋白相关疾病包括阿尔兹海默病、II型糖尿病、血管淀粉样蛋白沉积、具有淀粉样变的遗传性脑出血。
【专利摘要】本发明涉及淀粉样蛋白的分子标记和在体显像领域。具体而言，本发明涉及一种基于多肽的靶向淀粉样蛋白的方法和载体。该方法和载体用于运送化合物或药物穿过个体的血脑屏障并与脑内淀粉样蛋白相结合。特别的，本发明涉及的载体将与之相连接的成像基团运送穿过血脑屏障，该载体能够与脑中的淀粉样蛋白相互结合，从而达到淀粉样蛋白沉积标记与显像的功能。该载体作为用于检测体内或组织淀粉样蛋白沉积物的显像剂时，使用合适的光学显像基团、放射性同位素或者适用于MRI,CT检测的显像基团对其进行标记。该方法和载体尤其适用于在体无创性诊断包括阿尔茨海默病在内的患有淀粉样蛋白沉积的相关疾病，亦可用于观测靶向于淀粉样蛋白沉积的药物治疗效果。
【IPC分类】A61K51/08, A61K49/14, A61K49/00, C07K7/08, A61K49/04
【公开号】CN105585614
【申请号】CN201410576806
【发明人】周江宁, 汪琛玮, 南豆豆, 王昕萌
【申请人】中国科学技术大学
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2014年10月24日