一种可实现三维支架循环灌流的循环灌流生物反应器装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明属于临床医学、组织工程与再生医学领域，具体地说，是一种可实现组织工程三维支架内种子细胞氧分及营养物质持续供给的新装置。
【背景技术】
[0002]组织工程是结合工程学和生命科学的原理和方法，对正常和病理两种状态下的哺乳类动物组织结构和功能的关系进行最基本的研究，并且开发具有生物学性能的替代品用于修复、维持或改善受损组织或器官功能的学科。其基本原理为:将正常组织细胞吸附于生物相容性良好的生物材料上形成复合物，经过一段时间的培养，细胞扩增同时生物材料逐渐降解吸收，从而形成具有特定形态、结构和功能的相应组织、器官，达到促进组织再生、修复创伤和重建功能的目的。组织工程的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体。作为组织工程的载体，支架是组织工程研究的一个重点内容，不仅提供细胞生长的三维环境和新陈代谢的场所，也决定新生组织器官的形状和大小。其中，脱细胞支架因其保留完整的血管网络结构以及细胞外基质成分而使之成为组织工程领域的研究热点。目前，随着组织工程技术和材料学的发展，一些结构简单的组织器官，如皮肤、血管、骨、软骨等已可被人工构建，为器官移植患者的治疗带来了曙光。但对于结构及功能相对复杂的器官组织，仍面临着巨大的挑战。其中，大块三维支架内细胞氧分及营养物质的持续、有效供应是一大难题。如何实现细胞在三维支架内长期培养与功能维持是我们重点考虑问题。组织工程生物反应器的出现为组织工程器官的构建提供了技术支持。
[0003]在组织工程生物反应器发展过程中，先后出现了平板型生物反应器、旋转瓶型生物反应器、中空纤维型生物反应器、灌流床支架型生物反应器、种子细胞包裹/悬浮型生物反应器等。但上述反应器无法解决大块三维组织模块内部细胞的氧气及营养物质的供应问题，其适用性较为局限，主要为细胞、微囊、微小的组织模块等。为此，在构建适用于大块三维支架的生物反应器时需要考虑到:I)灌流液可以影响到三维支架内部深处的种子细胞；2)提供模拟体内生理条件的持续灌流;3)提供模拟体内生理环境下的生物、力学环境和充足的营养交换。通过调控灌流速度，以及压力负反馈调节系统的支持下实现支架内灌流液的持续循环灌注。
[0004]本发明基于已有循环灌流生物反应器基础上加以改进，为体外培养组织工程器官提供一种简便循环灌流装置，为三维条件下干细胞分化和细胞生长的研究提供技术支持。
【发明内容】
[0005]本发明针对目前组织工程三维支架内细胞因氧气及营养物质的供养不足而不能长期存活、活率低等问题而提出，公开了一种循环灌流生物反应器装置，为三维支架内细胞提供持续的营养物质供应，为三维条件下干细胞分化和细胞生长的研究提供技术支持，克服现有静态培养的缺陷，构建有功能活性的组织工程器官。从而实现细胞在三维支架内的长期培养和功能维持，实现组织工程器官的构建，并在保证细胞活性的情况下实现再细胞化支架在体外的长期培养。
[0006]本发明是通过以下技术方案来实现的:
[0007]本发明公开了一种循环灌流生物反应器装置，装置包括生物反应器和灌流装置、灌流装置包括蠕动栗和设置于蠕动栗上的管道系统，生物反应器包括无菌培养室和密闭吻合盖。生物反应器内可连接三维支架，可满足其内三维支架所需培养空间，避免培养液的大量浪费，方便对无菌室内三维支架进行操作，无菌培养室储存培养液及放置三维支架，蠕动栗可通过设置灌流模式、灌流速度、灌流量等来调节控制，适应不同的研究需求与组织构建需求。
[0008]作为进一步地改进，本发明所述的生物反应器的侧壁上开设有反应器上液体输入端，密闭吻合盖上开设有反应器上液体输入端和气体进口，反应器上液体输出端置于无菌培养室内的液平面以下。
[0009]作为进一步地改进，本发明所述的管道系统为硅胶管样结构，包括硅胶流入段和硅胶流出段，硅胶流入段上的管道系统入口端与反应器上液体输出端相连，硅胶流出段上的管道系统出口端与反应器上液体输入端相连。从而使之形成一个密闭的循环灌流生物反应器装置；
[0010]作为进一步地改进，本发明所述的气体进口上连接有气体过滤器。气体过滤器可以保证反应器外进入无菌培养室内的氧气、二氧化碳等气体无菌，以保证无菌培养室内的无菌状态，同时满足培养液充足气体供养。
[0011]作为进一步地改进，本发明所述的反应器上液体输入端与反应器上液体输出端为可拆卸置换的独立管状样结构。该设计可避免密闭吻合盖过于繁重，同时其与生物反应器的吻合性好，可保证整个反应器系统的密闭性。
[0012]作为进一步地改进，本发明所述的密闭吻合盖与无菌培养室体部吻合处设置为磨砂。保证反应器装置的密闭性。
[0013]作为进一步地改进，本发明所述的反应器上液体输入端两端细小，分别与硅胶管及套管针相连，中间直径增大，呈现滴壶样结构，所述的反应器上液体输入端与反应器侧壁呈70-80°夹角。而非垂直进入，一方面该设计可使硅胶管道系统内产生的气体位于输入端管内液平面以上，从而有效避免硅胶管道系统内气泡进入支架内。另一方面，可使三维支架的流入口与侧壁上的液体输入端顺势相连，而不引起支架的扯拉变形。
[0014]作为进一步地改进，本发明所述的生物反应器由透明样材料或者一次性无菌材料制成。所述的透明样材料耐热、耐高温，可耐受120-200度的高压蒸汽灭菌，实现反应器装置的反复多次使用，且容器的透明设计可更方便进行观察。所述的一次性无菌材料为透明、无毒、性能稳定的一次性材料，其使用方便、高效、避免交叉污染，在细胞培养环境下不会释放毒性物质影响细胞生长，容器的透明样设计同样可方便观察。
[0015]作为进一步地改进，本发明所述的透明样材料为透明样硼娃玻璃或石英玻璃。
[0016]作为进一步地改进，本发明所述的管道系统为可耐受120-200度的高压蒸汽灭菌的娃胶管。娃胶管耐高温、性能稳定。
[0017]本发明与已存在的肝组织工程生物反应器相比具有以下几个优点:
[0018]第一，生物反应器无菌培养室内培养液经反应器的液体输出端进入密闭管道系统，在蠕动栗的控制下，经反应器液体输入端，再次流进三维支架内，从而实现培养液在整个三维支架内的完全循环，为支架内细胞提供有效的营养供给、气体交换，提高支架内部细胞的存活率，以及三维支架再细胞化效率，另外，蠕动栗的脉动刺激，模拟体内血流。
[0019]第二，反应器上设有气体进口，其上置有气体过滤器，可以保证反应器外进入无菌培养室内的氧气、二氧化碳等气体无菌，以满足培养液充足气体供养。
[0020]第三，反应器上液体输入端借鉴一次性输液管“莫非氏滴管”的设计原理，设计成两端细小，分别与硅胶管及套管针相连，中间直径增大，呈现滴壶样结构。所述液体输入端与反应器侧壁呈一70-80°夹角，而非垂直进入，该设计一方面可使硅胶管道系统内产生的气体位于输入端管内液平面以上，从而有效避免硅胶管道系统内气泡进入支架内。另一方面，该设计可使三维支架与与侧壁上的液体输入端顺势相连，而不引起支架的扯拉变形。
[0021]第四，整个灌流系统简单，操作方便，通过调节、设置蠕动栗上的灌流模式、灌流速度、灌流压力等即可控制支架内的培养液灌流。
【附图说明】
[0022]图1为体外循环灌流生物反应器装置的原理结构简图；
[0023]图中，I为生物反应器，2为灌流装置，3为无菌培养室，4为管道系统，5为反应器上液体输入端，6为反应器上液体输出端，7为气体进口，8管道系统入口端，9为管道系统出口端，1为气体过滤器，11为密闭吻合盖。
【具体实施方式】
[0024]图1为体外循环灌流生物反应器装置的原理结构简图；本发明公开了一种循环灌流生物反应器装置，装置包括生物反应器I和灌流装置2，灌流装置2包括蠕动栗和设置于蠕动栗上的管道系统4，生物反应器I包括无菌培养室3和密闭吻合盖U。生物反应器I的侧壁上开设有反应器上液体输入端5，密闭吻合盖11上开设有反应器上液体输入端5和气体进口
7。管道系统4为硅胶管样结构，包括硅胶流入段和硅胶流出段，硅胶流入段上的管道系统入口端8与反应器上液体输出端6相连，硅胶流出段上的管道系统出口端9与反应器上液体输入端5相连，气体进口 7上连接有气体过滤器10，反应器上液体输入端5与反应器上液体输出端6为可拆卸置换的独立管状样结构，密闭吻合盖11与无菌培养室3体部吻合处设置为磨砂，反应器上液体输入端5两端细小，分别与硅胶管及套管针相连，中间直径增大，呈现滴壶样结构，所述的反应器上液体输入端5与反应器侧壁呈70-80°夹角，生物反应器I由透明样材料或者一次性无菌材料制成，透明样材料为透明样硼硅玻璃或石英玻璃，管道系统4为可耐受120-200度的高压蒸汽灭菌的硅胶管，一次性无菌材料透明、无毒、性能稳定，在细胞培养环境性不会释放毒性物质。
[0025]本发明公开的循环灌流生物反应器I系统模拟体内血流情