遗传修饰动物细胞的改进方法
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年9月23日提交的标题为"IMPROVED METHODS OF CELL TRANSDUCT ION"的美国临时申请No. 61 /881，259的权益，其整体通过引用并入本文。
[0003] 本申请中引用的每个申请、专利和论文，W及每个申请、专利和论文中引用的每个 文献或参考(包括每个授权专利公诉期间；"申请引用文献"），未决美国专利申请10/961， 814(下文中Wilson'814)、未决美国专利申请13/475,700(下文中Vera'700)、未决美国专利 申请13/493,768(下文中Vera'768)、未决美国专利申请11/952,848(下文中Wilson'848)、 未决美国专利申请14/313,702(下文中Welch'702)，W及对应于和/或要求运些申请和专利 中任意的优先权的每一个PCT和外国申请或专利，W及每个申请引用文献中引用或参考的 每个文献，均明确地通过引用并入本文。
技术领域
[0004] 本发明设及通过降低细胞和遗传修饰剂(genetic modification agent)之间的 距离W提高遗传修饰的效率和/或减少遗传修饰剂的使用来遗传修饰动物细胞的改进方 法。
【背景技术】
[0005] 遗传修饰的细胞通常是指经历了通常被称为转导的过程之后的经转导细胞。可W 利用多种技术进行转导，W允许基因修饰剂进入细胞。运样的遗传修饰剂包括使用病毒载 体、电穿孔或提高细胞渗透性的化学试剂。转染和转化是将遗传物质插入细胞的常见方式。
[0006] 在病毒载体的情况下，有多种使用的类型，并且运样的类型可W包括慢病毒、逆转 录病毒、腺病毒或者甚至纳米工程物质。在电穿孔的情况下，使细胞暴露于电压，其允许基 因修饰剂(如质粒)进入细胞。主要的挑战是提高细胞转导的效率。效率提高可W包括增加 给定细胞群中经转导细胞的数目或者减少在遗传上改变给定群中给定数目的细胞所需的 遗传修饰剂的量。
[0007] 慢病毒提供了与细胞转导相关的优势和问题的很好的实例。慢病毒主要是用于向 体外系统中引入基因产物的研究工具。使用高通量形式的RNA干扰技术，进行了大规模协作 努力来使用慢病毒阻断特定基因的表达。短发夹RNA(shRNA)的表达降低了特定基因的表 达，因此使得研究者能够检查模型系统中给定基因的必要性和作用。运些研究可W是开发 旨在阻断基因产物W治疗疾病的新药的前驱。
[000引在T细胞疗法领域，新兴的应用是在体外从遗传上改变T细胞W产生嵌合抗原受体 (CAR),其赋予转导T细胞对祀抗原的特异性，通常是对于祀抗原之单克隆抗体的特异性。W 运种方式，可产生大量CAR T细胞W用于T细胞疗法。CAR T细胞的转导还可赋予细胞增强的 活化信号、扩增、细胞因子的产生W及效应子功能。运种方法有很大的潜力来W意义深远的 方式改善患者特异性癌症疗法。在采集患者的T细胞后，对细胞进行遗传工程W表达特异性 针对患者肿瘤细胞上之抗原的CAR,然后输注回患者，CAR T细胞在患者中识别并杀伤呈递 祀抗原的癌细胞。
[0009] 本发明的目的是改进转导过程，其通过增加所述过程完成后被转导的任何给定群 大小的细胞的量，减少用于所述过程中的基因修饰剂的量，和/或降低所述过程的成本和复 杂性来实现，特别地，其设及转导T细胞。
[0010] T细胞培养和/或T细胞转导过程中一个常见步骤是使用抗体染色的磁珠从较大的 混合群中选择目标细胞亚群。例如，可W从白细胞群中选择细胞亚群（如干T细胞（stem T cell))。一旦识别抗体的细胞亚群与珠结合，将整个群从装置中移出并且使其流经磁场，由 此通过磁场捕获珠，从而从主群中分离附着至珠的细胞亚群。如果可W消除对使用流动系 统分离亚群的需求W有利于在不需要液体流动的静态装置中进行所述过程，则将发生显著 的工艺简化。
【发明内容】
[0011] 公开了本发明的某些实施方案，其改进了分离细胞亚群和/或转导动物细胞的过 程。
[0012] 在本发明的一个实施方案中，公开了用于减少转导细胞所需之遗传修饰剂的量的 方法，其通过将动物细胞和培养基放置在包含由可透气、不可透液体材料构成的细胞生长 表面的装置中的过程来实现，其中所述动物细胞W超过最大细胞浓度(细胞/毫升）的浓度 驻留(reside)在培养基中，可W通过使用静态细胞培养方法在培养基高度为0.3cm的常规 组织培养瓶中培养动物细胞获得所述最大细胞浓度，从而减小了任何给定细胞和任何给定 遗传修饰剂之间的距离。
[0013] 在另一个实施方案中，公开了用于减少转导细胞所需的遗传修饰剂的量的方法， 其通过将动物细胞和培养基放置在包含由可透气、不可透液体材料构成的细胞生长表面的 装置中的过程来实现，其中所述动物细胞W超过最大细胞浓度的浓度驻留在培养基中，可 W通过使用静态细胞培养方法在培养基高度为0.3cm的常规组织培养瓶中培养动物细胞获 得所述最大细胞浓度。在运种升高的浓度下，W细胞的初始生存力为参考点，将遗传修饰剂 添加到装置中，允许遗传修饰剂转导细胞一段时间，在此期间，细胞生存力不降低到低于初 始生存力的给定百分比。
[0014] 在本发明的另一个实施方案中，公开了用于减少转导动物细胞之遗传修饰剂的使 用的方法，其通过将培养基和动物细胞放置在包含由可透气材料构成的细胞生长表面的装 置中来实现，其中培养基中动物细胞的浓度超过最大细胞浓度，可W通过使用静态细胞培 养方法在培养基高度为0.3cm的瓶中培养所述细胞获得所述最大细胞浓度。在运种升高的 浓度下，W培养基的初始葡萄糖浓度为参考点，将遗传修饰剂添加到装置中并且允许遗传 修饰剂转导细胞一段时间，在此期间，培养基的葡萄糖浓度不降低到低于初始葡萄糖浓度 的特定百分比或最小葡萄糖浓度。
[0015] 在本发明的另一个实施方案中，公开了用于转导细胞的方法，其通过将培养基、动 物细胞和遗传修饰剂添加到包含由可透气、不可透液体材料构成的生长表面的装置中来实 现，其中细胞浓度为3百万至2千万个细胞/毫升培养基，并且其中培养基与可透气、不可透 液体材料接触，然后允许经过一段时间，在此期间，遗传修饰剂起作用W转导至少一部分细 胞。
[0016] 在本发明的另一个实施方案中，公开了用于转导细胞的方法，其通过提高可透气 细胞培养装置中每毫升培养基中的细胞浓度来实现，所述装置包含第一细胞浓度的细胞， 培养基处于第一培养基高度，并且培养基处于第一培养基体积，所述第一细胞浓度为细胞 量除W第一培养基体积，所述第一培养基高度由当细胞生长表面处于水平位置时培养基的 最上面位置与培养基的最下面位置之间的距离定义；从装置中移出一部分第一培养基体 积，在装置中留下第二培养基体积，由此在移出一部分第一培养基体积之后，细胞处于第二 细胞浓度，所述第二细胞浓度大于所述第一细胞浓度，培养基为第二培养基高度，所述第二 培养基高度由当细胞生长表面处于水平位置时所述培养基的最上面位置与所述培养基的 最下面位置之间的距离定义；W及将遗传修饰剂添加到装置中，允许经过一段时间，由此遗 传修饰剂起作用W转导至少一部分细胞。可W进行后续步骤W扩增转导细胞群的大小，其 通过向装置中添加一定体积的培养基，并且当所述装置定向成使得至少一部分细胞驻留在 细胞生长表面上，并且细胞生长表面W水平位置定向，且适合细胞培养的环境气体与可透 气、不可透液体材料接触时，允许用培养基培养细胞一段时间。
[0017] 在本发明的另一个实施方案中，公开了从较大群中分离细胞亚群的方法，其中将 细胞群、培养基和包被(coat)的磁珠添加到包含可透气、不可透液体材料的装置中，允许细 胞亚群附着至磁珠一段时间，使装置内的珠暴露于磁场，移出培养基和细胞群，而磁珠由于 磁场驻留在装置中，从而从较大的细胞群中分离细胞亚群。
[0018] 在本发明的另一个实施方案中，公开了从较大群中分离细胞亚群的方法，其中将 细胞群、培养基和包被的磁珠添加到包含可透气、不可透液体材料的装置中，允许细胞亚群 附着至磁珠一段时间，使装置内的珠暴露于磁场，移出培养基和细胞群，而磁珠由于磁场驻 留在装置中，从而从较大的细胞群中分离细胞亚群。然后使用本文所述的任何方法转导装 置中的细胞。
[0019] 附图简述
[0020] 图1示出了包含细胞和培养基之非可透气的细胞培养装置的截面。
[0021] 图1A示出了包含细胞、培养基和遗传修饰剂之非可透气的细胞培养装置的截面。
[0022] 图2示出了包含细胞和培养基之可透气的细胞培养装置的截面。
[0023] 图2A示出了包含细胞和培养基之可透气的细胞培养装置的截面。
[0024] 图2B示出了包含细胞、培养基和遗传修饰剂之可透气的细胞培养装置的截面。
[0025] 图2C示出了包含细胞、培养基和遗传修饰剂之可透气的细胞培养装置