的化学再生方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种氧化型辅酶NAD(P)+的化学再生方法，属于辅酶再生技术领域。
【背景技术】
[0002] 氧化还原酶是继水解酶之后应用最广泛的一类酶，其催化的氧化还原反应大多数 都需要NAD(P)H/NAD(P)+提供还原氢或接受氢，而NAD(P)H/NAD(P) +昂贵价格限制了氧化还 原酶在工业生产中的应用，需要进行辅酶原位再生以降低成本。目前辅酶再生包括全细胞 法、酶法、电化学法、光学化学法和化学法五种方法。全细胞法成本较低，但产物分离比较复 杂，方法相对较原始。酶法包括底物偶联法和酶偶联法两种方法，其中底物偶联法是同一种 酶同时催化两种不同的底物向相反的方向进行，同时实现主底物与辅底物的转化，构成辅 酶再生循环，辅底物与主底物竞争酶的活性中心，酶的一部分活性用于再生辅酶，使用于催 化主底物的酶活性降低;酶偶联法是氧化反应酶系统与还原反应酶系统在一个体系中平行 进行，生产酶催化底物转化消耗辅酶，再生酶则催化辅酶进行再生，此法要求两个酶系统中 的底物必须相对独立，以免互相竞争同一个酶的活性中心，而且两种酶的最适反应条件往 往不一致。电化学法中电的成本较低，没有化学计量的再生试剂存在，但效率较低，常需要 介质的参与，且此法与很多生物化学催化系统不相容，选择性很差。化学法利用特殊的催化 剂将氧化还原剂的氧化还原当量传递给氧化还原辅因子NAD(P)H/NAD(P)+从而形成辅因子 再生循环，常用的化学催化剂为有机贵金属配合物(Rh/Ru/Ir)，价格昂贵而且中心金属会 脱落，中心金属常会与酶的氨基酸残基进行配位，使金属催化剂与酶都失去活性。光化学再 生法常受限于缺乏高效的光敏剂，一般效率较低。
[0003] 目前用于再生氧化型辅因子NAD(P) +的化学法常用核黄素单核苷酸（FMN) [J. Am. Chem.Soc. 1982，104,4659-4665]和铁（ΙΠ )卟啉[Angew.Chem.Int .Ed.2011，50， 2397-2400]两种再生催化剂。用FMN再生时，要用过量剂量[J. Am. Chem.Soc. 1982,104， 4659-4665]或特殊光源照射下[ChemCatChem 2011,3,338-342]进行催化再生。铁卟啉属于 金属有机配合物，再生效率不高，且易与酶进行配位造成失活现象。
【发明内容】
[0004] 针对上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用桥联型黄素再生 NAD(P)+的新的化学方法，以克服其他再生方法的缺陷。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0006] 本发明要保护的第一技术方案是一种氧化型辅酶NAD(P)+的化学再生方法。
[0007] -种氧化型辅酶NAD(P) +的化学再生方法，在氧气或空气气氛条件下，加入催化量 的桥联黄素，氧化NAD (P) Η得到NAD (P) +。
[0008] 本发明所述的NAD(P)+为NAD+或者NADP+。
[0009] 本发明所述的NAD (P) Η为NADH或者NADPH。
[0010] 其中，氧化NADH得到NAD+，氧化NADPH得到NADP+。
[0011 ]本发明所述的桥联黄素(英文名称#，1'|1()41：11716116-131^(^6(1；^3￥；[118)，其结构通 式如下：
[0012]
u
[0013]其中，RdPR2相互独立地选自：氢、甲基、三氟甲基、甲氧基、齒原子、硝基、氨基;R 3 选自：氢、Cl~C5的烷基、苯基、苄基;χ-选自：卤离子，硝酸根，三氟甲磺酸根。
[0014] 优选的是，心包括但不限于氢、甲基、齒原子;办包括但不限于氢、甲基、齒原子、三 氟甲基;R3包括但不限于氢、甲基f为卤离子。
[0015] 最优选的是，所述的桥联黄素包括但不限于7-三氟甲基-1，10-乙撑基异咯嗪氯化 盐(化合物I)、8_氯-1，10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物II)、或1，10-乙撑基异咯嗪氯化盐 (化合物ττη
[0016]
[0017]本发明所述的桥联黄素可以参考现有公开的文献自行合成文献，例如文献 [Tetrahedron，2001，57，4507-4522 ];或者直接从市场上购买。
[0018]其中，所述的催化量为桥联黄素占 NAD(P)H的摩尔百分比为0.1-5%，优选0.25-2%，最优选2%。
[0019] 其中，氧化NAD(P)H得到NAD(P)+的条件为pH 4-10,温度30-70°C;优选氧化NAD(P) Η得到NAD(P)+的条件为pH 6-8,温度30-40°C;最优选氧化NAD(P)H得到NAD(P)+的条件为pH 7，温度30°(：。
[0020] 其中，氧化NAD(P)H得到NAD(P)+的反应时间一般以反应完全为准或者以大部分反 应完全为准，本领域技术人员可以采用紫外分光光度法检测，因为NAD(P)H在340nm处有紫 外吸收，而NAD(P)+在340nm处没有吸收，所以可以采用紫外分光光度法检测反应进程，当减 去桥联黄素空白吸光度后样品吸光度降为〇时，视为反应完全，当吸光度接近〇时，视为大部 分反应完全，当然本领域技术人员也可以采用现有的其他检测方法监控反应过程使得反应 完全。
[0021] 其中，桥联黄素作为NAD(P)+再生催化剂，可以与依赖NAD(P)+的氧化还原酶催化的 氧化反应偶联，构成辅酶NAD(P)+的再生循环体系。
[0022] 其中，所述的依赖NAD(P) +的氧化还原酶包括但不限于EC1.1.1 .X、EC1.2.1 .X、 EC1·3·1.X、EC1·4·1.X、EC1·5·1.X、EC1·6·1.X、EC1·7·1.X、EC1·8·1.X、EC1·10.1.X、 EC1.12.1.X、EC1.13.1.X、EC1.16.1.X、EC1.17.1.X、EC1.18.1.X、EC1.20.1.X、EC1.22.1.X 的所有酶。优选的是，所述的依赖NAD(P) +的氧化还原酶包括但不限于马肝醇脱氢酶、葡萄 糖脱氢酶或甘油脱氢酶。
[0023]当桥联黄素作为NAD(P)+再生催化剂，与依赖NAD(P)+的氧化还原酶催化的氧化反 应偶联时，桥联黄素的使用量为依赖NAD(P) +的氧化还原酶所催化底物摩尔量的0.1-5%， 优选0.25-2%，最优选2 %。
[0024]本发明要保护的第二技术方案是一种氧化反应。
[0025] -种氧化反应，其以依赖NAD(P)+的氧化还原酶为催化剂，以桥联黄素作为NAD(P) + 再生催化剂，在氧气或空气气氛条件下，氧化NAD(P)H得到NAD(P) +，形成辅酶NAD(P)+的再生 循环体系。
[0026] 本发明所述的NAD(P)+为NAD+或者NADP+。
[0027] 本发明所述的NAD (P) Η为NADH或者NADPH。
[0028] 其中，氧化NADH得到NAD+，氧化NADPH得到NADP+。
[0029]本发明所述的桥联黄素(英文名称#，1'|1()41：11716116-131^(^6(1；^3￥；[118)，其结构通 式如下：
[0030]
[0031]其中，RjPR2相互独立地选自：氢、甲基、三氟甲基、甲氧基、齒原子、硝基、氨基;R3 选自：氢、Cl~C5的烷基、苯基、苄基;χ-选自：卤离子，硝酸根，三氟甲磺酸根。
[0032] 优选的是，心包括但不限于氢、甲基、齒原子;办包括但不限于氢、甲基、齒原子、三 氟甲基;R3包括但不限于氢、甲基f为卤离子。
[0033] 最优选的是，所述的桥联黄素包括但不限于7-三氟甲基-1，10-乙撑基异咯嗪氯化 盐(化合物I)、8_氯-1，10-乙撑基异咯嗪氯化盐(化合物II)、或1，10-乙撑基异咯嗪氯化盐 (化合物III)。
[0034]
[0035] 本发明所述的桥联黄素可以参考现有公开的文献自行合成文献，例如文献 [Tetrahedron，2001，57，4507-4522 ];或者直接从市场上购买。
[0036] 其中，桥联黄素的催化摩尔量占依赖NAD(P) +的氧化还原酶所催化底物摩尔量的 0· 1 -5%，优选0·25-2%，最优选2%。
[0037] 其中，氧化NAD(P)H得到NAD(P)+的条件为pH 3-12,温度30-70°C ;优选氧化NAD(P) Η得到NAD(P)+的条件为pH 6-8,温度30-40°C;最优选氧化NAD(P)H得到NAD(P)+的条件为pH 7，温度30°(：。
[0038] 其中，所述的依赖NAD(P) +的氧化还原酶包括但不限于EC1.1.1 .X、