B，显色10分钟后用2M的硫酸终止。测定波长450nm处的OD值。结果如图4所示，重组Fn3-epitope蛋白具有良好的与鼠源抗NT-proBNPl 3-20氨基酸残基的单克隆抗体13G12结合能力。
[0028]实施例二
[0029]1、本实施例采用人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因(EMBL登入号码AJ320527) ο在基因的5'末端引入编码6个组氨酸残基，在FG loop区引入NT-proBNP编码表位的短肽序列(CTGGAAACCTCGGGCCTGCAGGAACAACGT，编码 NT-proBNP 的 12-21 氨基酸残基LETSGLQEQR)，融合基因结构见图1。
[0030]将序列表[001]所示的人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)与NT-proBNP融合基因表达框序列合成后(南京金斯瑞生物科技有限公司)，用Nco I和Hind III构建到大肠杆菌表达载体pET28a (+)上，得到重组载体pET28-Fn3_ep i tope，载体结构见图2。
[0031]2、将构建的表达载体电击转化BL21(DE3)大肠杆菌菌株，然后将转化子接种到10毫升含有Kan(浓度为每毫升LB培养基含50微克卡那霉素)的LB培养基中，过夜培养。次日，以1:100接种到500毫升含有Kan(浓度为每毫升LB培养基含50微克卡那霉素)LB培养基的2升三角瓶中，200rpm、37°C培养，直至OD6qq达到0.6。然后，在30°(:、200印111条件下添加1毫摩尔的的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达3小时，在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白IB培养基的配方如下:胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl) I Og/L。
[0032]3、通过常规方法制备可溶蛋白，用镍柱纯化His-Tag的重组蛋白，纯化的重组蛋白Fn3_epitope 如图 3所示。
[0033]4、将步骤3获得的重组蛋白Fn3-epit0pe通过ELISA方法测定免疫血清的效价。重组Fn3_epi tope蛋白经逐级稀释后包被96孔酶标板，经过封闭液后封闭后，加入HyTest公司生产的鼠源抗NT-proBNP13-20氨基酸残基的单克隆抗体13G12(1:2500稀释)，用血清白蛋白作空白对照。二抗为辣根过氧化酶标记羊抗小鼠IgG抗体(I: 4000)，底物为TMB，显色10分钟后用2M的硫酸终止。测定波长450nm处的OD值。结果如图4所示，重组Fn3-epitope蛋白具有良好的与鼠源抗NT-proBNPl 3-20氨基酸残基的单克隆抗体13G12结合能力。
[0034]实施例三
[0035]1、本实施例采用人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因(EMBL登入号码AJ320527) ο在基因的5'末端引入编码6个组氨酸残基，在FG loop区引入NT-proBNP编码表位的短肽序列(CTGGAAACCTCGGGCCTGCAGGAACAACGT，编码 NT-proBNP 的 12-21 氨基酸残基LETSGLQEQR)，融合基因结构见图1。
[0036]将序列表[001]所示的人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)与NT-proBNP融合基因表达框序列合成后(南京金斯瑞生物科技有限公司)，用Nco I和Hind III构建到大肠杆菌表达载体pET28a (+)上，得到重组载体pET28-Fn3_ep i tope，载体结构见图2。
[0037]2、将构建的表达载体电击转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，然后将转化子接种到10毫升含有Kan(浓度为每毫升LB培养基含50微克卡那霉素)的LB培养基中，过夜培养。次日，以1: 100接种到500毫升含有Kan (100微克每毫升)LB培养基的2升三角瓶中，200rpm、37 °C培养，直至OD6qq达到0.6。然后，在35°C、200rpm条件下添加I毫摩尔的的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达3小时，在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白。LB培养基的配方如下:胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl) 10g/L。
[0038]3、通过常规方法制备可溶蛋白，用镍柱纯化His-Tag的重组蛋白，纯化的重组蛋白Fn3_epitope 如图 3所示。
[0039]4、将步骤3获得的重组蛋白Fn3-epit0pe通过ELISA方法测定免疫血清的效价。重组Fn3_epi tope蛋白经逐级稀释后包被96孔酶标板，经过封闭液后封闭后，加入HyTest公司生产的鼠源抗NT-proBNP13-20氨基酸残基的单克隆抗体13G12(1:2500稀释)，用血清白蛋白作空白对照。二抗为辣根过氧化酶标记羊抗小鼠IgG抗体(I: 4000)，底物为TMB，显色10分钟后用2M的硫酸终止。测定波长450nm处的OD值。结果如图4所示，重组Fn3-epitope蛋白具有良好的与鼠源抗NT-proBNPl 3-20氨基酸残基的单克隆抗体13G12结合能力。
[0040]本发明实施方式不限此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和通用方法，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可以有其它的实施方式。如可以用其它的大肠杆菌胞内表达载体等表达该类型的重组蛋白。因此，本发明还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利保护范围之内。
[0041]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种基于人源骨架蛋白Fn3制备脑钠肽前体抗原替代物方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)、骨架蛋白Fn3展示NT-proBNP线性表位重组蛋白表达载体构建: (1)根据Fn3骨架蛋白晶体结构，设计展示表位位置，根据模建结果，将NT-proBNP线性表位设计在Fn3骨架蛋白的FG区，将能与抗脑钠肽前体抗体结合的抗原表位核苷酸序列置换骨架蛋白Fn3的编码FG区的核苷酸序列，构成骨架蛋白Fn3与NT-proBNP线性表位融合基因，合成Fn3展示NT-proBNP线性表位的基因片段，在融合基因下游融合编码6个组氨酸的分离纯化标签(His-tag)，便于分离纯化:采用人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因，在基因的5'末端引入编码6个组氨酸残基，在FG loop区引入NT-proBNP编码表位的短肽序列CTGGAAACCTCGGGCCTGCAGGAACAACGT，以上设计合成的基因编码Fn3展示NT-proBNP线性表位重组蛋白，命名为Fn3-epitope; (2)将以上融合基因构建到大肠杆菌胞内表达载体上，融合的重组蛋白将在大肠杆菌胞内表达:将上述设计合成的基因，用Nco I和Hind III构建到大肠杆菌表达载体pET28a(+)上，得到重组载体 pET28_Fn3_ep i tope; 2)、将构建的重组蛋白基因质胞内表达载体转化到大肠杆菌工程菌株，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白就展示有线性抗原表位，将鉴定过的阳性转化子进行自诱导表达，诱导表达3-6小时，培养基中添加与表达载体所带抗性基因相应的抗生素； 将构建的表达载体电击转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，然后将转化子接种到10毫升含有Kan的LB培养基中，过夜培养，次日，以1:100接种到500毫升含有Kan的LB培养基的2升三角瓶中，200rpm、37 °C培养，直至OD6qq达到0.6，然后，在25-35 °C、200rpm条件下添加I毫摩尔的的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达3小时，在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白； 其中，Kan的浓度为每毫升LB培养基中含50微克卡那霉素;LB培养基的配方为:胰蛋白胨Tryptone 10g/L，酵母提取物Yeast extract 5g/L，氯化钠NaCl 10g/L； 3)、收集菌体，提取可溶蛋白，用亲和层析方法，分离纯化重组蛋白，该蛋白即为包含有线性抗原表位的融合蛋白:用镍柱纯化His-Tag的重组蛋白，纯化的重组蛋白Fn3-epitope。2.根据权利要求1所述的一种基于人源骨架蛋白Fn3制备脑钠肽前体抗原替代物方法，其特征在于，所述的纯化的重组蛋白Fn3-epitope可展示脑钠肽前体抗原表位，可用于相应抗原的替代物。
【专利摘要】本发明公开一种应用人源骨架蛋白Fn3(人纤维连接蛋白fibronectin？3)展示抗原表位用于制备脑钠肽前体N端(NT-proBNP)线性表位的方法。该方法通过基因重组，将能与抗脑钠肽前体抗体结合的抗原表位核苷酸序列置换骨架蛋白Fn3的编码FG区的核苷酸序列，构成骨架蛋白Fn3与NT-proBNP线性表位融合基因，利用大肠杆菌表达系统高效表达、制备骨架蛋白Fn3融合NT-proBNP线性表位的融合蛋白。本发明的有益效果是可以简单、快速、高效制备具有和脑钠肽前体的抗原性相当的融合蛋白，为高效低成本制备具有脑钠肽前体抗原性的标准品奠定基础。
【IPC分类】C12N15/70, C12N15/62, C07K19/00
【公开号】CN105671068
【申请号】CN201610154753
【发明人】胡学军, 李梦阳, 丁宁, 杨春光, 孙慎侠, 马君燕, 曲鹏
【申请人】大连大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月15日