the Interaction between the Chromosome and a Virulence Plasmid, Journal of Rroteome Research, 2010, 9 (2) :843-854"中公开过，公众 可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得，该质粒为溫度敏感型质粒，氨 节青霉素抗性。
[0116] PMD18-T 购自 TaKaRa 公司，货号为 D101A。
[0117] pET-22b质粒购自Novagen公司，产品目录号为69744。
[0118] 地OBEG 质粒在文献"A rapid method for efficient gene r巧Iacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans[J]. Nucleic Acids Res. 2000 NovlS ； 28 (22) :E97"中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得，该 质粒为溫度敏感型质粒，氯霉素抗性。
[0119] pCP20 质粒在文献"Datsenko, K. A. and B. L. Wanner. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products[J]. Proc. natl. Acad. Sci. U. S. A, 2000, 97(12) :6640-6645"中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学 科学院生物工程研究所获得，氯霉素抗性。
[0120] pET28a (+)购自 Novagen。 阳 12U PMMB66邸购自 ATCC，编号为 ATCC 37620。
[0122] P邸3 在文献"Datsenko, K. A. and B. L. Wanner, One-St巧 inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(12) :p. 6640-5。"中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院 生物工程研究所获得。
[0123] P邸46 质粒在文献"Datsenko, K. A. and B. L. Wanner, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(12) :p. 6640-5。"中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院 生物工程研究所获得。PKD46的复制子对溫度敏感，37°C培养时丢失，此质粒含有编码Red 重组的=个重组酶，由阿拉伯糖启动子控制。 阳124] PACYC184在文献"于梅，周建光，陈伟，等.一种可转移的重组工程系统pYM-Red 的建立[J].生物化学与生物物理进展，2005, 32(4) :359-364."中公开过，公众可从中国人 民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。
[01巧]Anti-His tag鼠单克隆抗体购自Sigma,货号为A7058。 阳126] anti-EPA抗体购自Sigma,货号为P2318。
[0127] 兔源Anti-OPSsfWi抗血清（福氏志贺菌2a型抗血清）购自日本生研株式会化编 号为 210227。
[0128] 兔源抗大肠杆菌0157抗血清购日本生研株式会社，编号为210753。 阳129] HRP-羊抗兔IgG购自TransGen公司，编号为服-101-01。 阳130] C肥LATING SEPH 6 FF亲和层析柱购自GE Healthcare,产品目录号为 17-5203-06。 阳131] G25层析填料购自GE Healthcare。
[0132] Protein化k DEAE細R阳离子交换层析柱购自Waters。
[0133] Superdex 75 FPLC 层析柱购自 GE Healthcare,产品目录号为 17-1047-01。 阳134] 雌性Ba化/c小鼠购自军事医学科学院实验动物中屯、。
[0135]福氏志贺氏菌 2a 301 野生株仅 fIexneri 2a 301)在文献"Genome sequence of Shigella flexneri 2a:insights into pathogenicity through comparison with genomes of Escherichia coli K12 and 0157，Nucl. Acids Res2002, 30(20):4432-4441" 中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。
[0136] 甲型副伤寒沙口氏菌50973株（S. paratyphi CMCC50973)购自中国医学细菌保藏 管理中屯、。 阳137] E. COli W3110在文献"于梅，李山虎，陈伟，等.用Red介导的同源重组结合酶 切改构质粒DNA[J].军事医学科学院院刊，2005, 29 (3) : 241-243."中公开过，公众可从中 国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。
[0138] 氨氧化侣佐剂Rehy化agel LV购自General Qiemical公司。
[0139] 实施例1、一步生物交联法制备福氏志贺氏菌0-糖基化修饰的重组融合蛋白及其 疫苗
[0140] 志贺氏菌（Shigella SPP.)俗称频疾杆菌，作为一种具有高度传染性的革兰氏 阴性肠道致病菌，主要通过侵入人结肠上皮细胞最终定位于大肠，而引起典型细菌性频疾 (发热、腹痛、里急后重、大便脈血），而毒力大质粒则是其致病性的最主要的因素，毒力大 质粒包含有大概32个与毒力有关的基因，主要包括与III型分泌系统有关的mxi-spa基 因、与细菌侵入上皮细胞密切相关的ipaBCD W及ipgC等毒力基因。为了将其开发为安全 的宿主菌，必须先将其编码毒力因子的大质粒pCP去除，在此基础上再将0抗原连接酶基因 waal缺陷，从而开发成适于本发明的宿主菌。 阳141] 一、宿主菌的改造 阳142]( -）毒力大质粒缺失株S.fIexneri 2a 301 ApCP的构建
[0143] 1、福氏志贺氏菌2a 301野生株感受态的制备
[0144] 1)将福氏志贺氏菌2a 301野生株（S. fIexneri 2a 301)接种于LB液体培养基 中，30°C过夜培养后，将Iml培养液转接到100血低盐LB液体培养基中，30°C培养至ODe。。达 到 0. 6。
[0145] 2)离屯、收集菌体，用灭菌的体积百分含量为10%甘油的水溶液洗涂四次，最后 用400UL灭菌的体积百分含量为10%甘油的水溶液重悬细菌，即可获得电击转化用的 S.fIexneri 2a 301感受态细胞，分装待用。 阳146] 2、毒力大质粒的缺失 阳147] 1) inc是志贺氏菌毒力大质粒pCP上与其复制相关的一段序列片段，将带有inc片 段的地Dinc重组质粒电转导入步骤1制备的S. fIexneri 2a 301感受态细胞中，得到中间 重组菌，将其命名为S. flexneri 2a 301/p邸inc。
[0148] 2)将S. flexneri 2a 301/p邸inc在含有浓度为50 y g/血的氨节青霉素的LB液 体培养基中连续传代3次W上，W保证毒力大质粒的丢失，之后将培养的菌液涂布在氨节 青霉素抗性的LB固体培养基上，待长出单菌落之后，提取单菌落的基因组DNA，W其为模 板，分别W ipaA、ip浊、mxiD、VirG的引物为引物，进行PCR扩增，通过验证毒力基因ipaA、 ip浊、mxiD、virG检测毒力大质粒pCP是否丢失，同时Ws. flexneri 2a 301的基因组DNA 为对照，进行上述PCR扩增。 阳149] ipaA的引物如下： 阳 1 加 ]ipaApl:5, -AAGATTCTGCCTTTGGACC-3'（沈Q ID No. 1) 阳15U ipaAp2:5,-GTGGTTGAAGAGTTCTGTATG-3'（沈Q ID No. 2) 阳152] ip浊的引物如下： 阳 15引 ip浊 1U:5'-TGCTTTGACGGTATACAGC-3'(沈Q ID No. 3) 阳 154] ip浊 1L:5'-ACTTCCACAGGTTGAATTCG-3'（沈Q ID No. 4) 阳155] mxiD的引物如下： 阳K6] mxiDU:5>-AAGCAGGTTTCTTCTATTGG-3'（沈Q ID No. 5) 阳 157] mxiDL:5,-GAACACATTACCGATTACAGG-3'（沈Q ID No. 6) 阳158] VirG的引物如下： 阳 159] VirGpl:5,-CATCAATCCGTTACTCACT-3'（沈Q ID No. 7)
[0160] VirGp2:5,-ACTACCAGCAACAATACG-3,（SEQ ID No. 8) 阳161] 结果如图IA所示。
[0162] 图IA中，301代表福氏志贺氏菌2a 301野生株S. f Iexneri 2a 301 ;301 ApCP代 表步骤2)筛选的单菌落。 阳16引 图IA表明，在福氏志贺氏菌2a 301野生株中，ipaA、ip浊、mxiD、virG基因都出现 了目的扩增片段，分别为888bp的ipaA目的片段、595bp的ip浊目的片段、986bp的mxiD 目的片段、777bp的VirG目的片段。而在氨节青霉素抗性筛选后的单菌落中，ipaA、ip浊、 mxiD、virG基因均无扩增片段，说明毒力大质粒成功丢失，将该步骤2)筛选的单菌落（利用 质粒不相容原理将毒力大质粒驱除而只保留有pKDinc质粒的重组菌）命名为S. flexneri 2a 301 ApCP/p邸inc。
[0164] 3)再利用地Dine质粒的溫度敏感特性，将S. flexneri 2a 301 ApCP/p邸inc在 无抗生素的液体LB培养基中42°C连续培养2代，将在无抗生素的LB固体培养基上可W生 长，但在含有氨节青霉素抗性的LB固体培养基上不长的菌株命名为菌株S. f Iexneri 2a 301 ApCPo 阳1化]提取S. f Iexneri 2a 301 A pCP的基因组DNA，按照步骤2)的方法检测毒力基因 ipaA、ip浊、mxiD、virG，同时W福氏志贺氏菌2a 301野生株S. flexneri 2a 301的基因组 DNA为对照，进行上述PCR扩增，结果与图IA的结果一致，在福氏志贺氏菌2a 301野生株 S.f Iexneri 2a 301 中，ipaA、ip浊、mxiD、VirG 基因都出现了 目的扩增片段，而 S.f Iexneri 2a 301 ApCP中，ipaA、ip浊、mxiD、VirG基因均无扩增片段，说明毒力大质粒不存在。
[0166] 提取S.fIexneri 2a 301 ApCP的基因组DNA，Winc的引物为引物进行PCR扩 增，通过验证地Dinc质粒上的inc片段检测地Dinc质粒是否成功丢失，同时W福氏志贺 氏菌2a 301野生株S. flexneri 2a 301的基因组DNA为对照，进行上述PCR扩增。
[0167] inc的引物如下：
[0168] incF:5,-TGCGAGAGAGAGGGGATAAC-3,（沈Q ID No. 9)
[0169] incR:5' -CGCCTTTTCCATCAGTTTC-3'（沈Q ID No. 10) 阳170] 结果如图IB所示。 阳171] 图IB中，301代表福氏志贺氏菌2a 301野生株S. f Iexneri 2a 301 ;301 ApCP代 表 S. flexneri 2a 301 ApCP。 阳172] 图IB表明，在福氏志贺氏菌2a 301野生株S.f Iexneri 2a 301中，具有488bp的 inc基因目的片段，而S.flexneri 2a 301 ApCP中无目的扩增片段，说明地Dinc质粒成功 丢失。
[0173] 上述结果表明，S. flexneri 2a 301 ApCP已经丢失了毒力大质粒pCP，同时也丢 失了外源的地Dinc质粒，毒力大质粒缺失株S.flexneri 2a 301 ApCP构建成功。
[0174] (二）0-抗原连接酶基因 waal缺陷的无毒福氏志贺氏菌S. flexneri 2a 301 ApCPAwaaI的制备 阳17引 1、线性打祀DNA片段的制备 阳176] 1)PCR引物的设计和合成 阳177] 在福氏志贺氏菌2a SOlwaaI基因的上游巧'端）和下游（3'端）各设计一对引物， 即 301waalu5/301waalu3 和 301waald5/301waald3。其中 301waalu5 具有限制性酶切位点 BamH I，301waalu3具有限制性酶切位点Sal I，301waald5具有限制性酶切位点HindIII, 301waald3具有限制性酶切位点化O I。
[0178] 同时，为了验证突变体是否够构建成功，设计了基因组上waal基因上下游同源臂 W外的一对引物（301waalw5/301waalw3)，内部检测引物（301waaln5/301waaln3)，kan 基 因引物化an5/Kan3)及kan基因内部引物化an巧/Kan巧），进行PCR验证，同时进行测序验 证。
[0179] 上述引物如表1所示。 阳180] 表1引物列表1
[0181]
[0
阳183] 表1中的下划线所示的序列为酶切识别位点。 阳184] 2)线性打祀DNA片段的构建 阳 185] (1) W S. f Iexneri 2a 301 A pCP 基因组 DNA 为模板，用 301waalu5/301waalu3 和 301waald5/301waald3分别扩增出waal的上、下游同源臂up和down。 阳 186] ?0?程序如下：94。(：1〇111111;94^3〇3,56^3〇3,72。(：1111111，30个循环；72。(：1〇111111。 阳187] PCR扩增得到的UP片段的核巧酸序列如SEQ ID No. 23中自5'末端起第7-634位 核巧酸所示，down片段的核巧酸序列如SEQ ID No. 23中自5'末端起第2143-2822位核巧 酸所示。 阳18引 （2)祀TKan的构建
[0189] W SEQ ID No. 23中自5'末端起第641-2136位核巧酸所示的DNA分子为模板，W 5 >-GCGTCGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3 ' (SEQ ID No. 24) M 5^-CCAAGCTTATGGGAATTAGCCAT GGTCC-3' (SEQ ID No. 25)为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物； 阳190] Sal I和化nd III双酶切PCR扩增产物，得到基因片段；Sal I和化nd III双酶切 pET-2化质粒，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名 为祀TKan,将祀TKan送测序，结果正确。
[0191] (3)BamH I和Sal I双酶切up片段，得到基因片段l;BamH I和Sal I双酶切 质粒祀TKan,得到载体大片段1 ;将基因片段1与载体大片段1连接，得到中间载体1 ; 阳1巧化nd m和化O I双酶切down片段，得到基因片段2化nd m和化O I双酶切中 间载体1，得到载体大片段2 ;将基因片段2与载体大片段2连接，得到中间载体2。
[0193] (4) BamH I和化〇 I双酶切中间载体2,得到目的打祀片段，如SEQ ID No. 23所 示。该打祀片段两侧为同源臂，中间含kan基因。SEQ ID No. 23中自5'末端起第7-634位 核巧酸为UP片段，第641-2136位核巧酸为kan基因，自5'末端第2143-2822位核巧酸为 down片段。
[0194] 2、S. flexneri 2a 301 ApCP/pKOBEG 的构建 阳1巧]由于地OBEG质粒含有编码A -Red重组系统所需各种酶，将地OBEG质粒电击转化 至S. flexneri 2a 301 A pCP中，涂于含有浓度为50ug/mL的氯霉素的LB平板上，30°C培 养过夜，得到的阳性克隆，将其命名为S. flexneri 2a 301 ApCP/pKOBEG菌株。
[0196] 3、线性打祀 DNA 片段电击转化 S. flexneri 2a 301 ApCP/pKOBEG
[0197] I)将S. flexneri 2a 301 ApCP/pKOBEG接种于含终浓度为30 y g/mL氯霉素低盐 LB液体培养基3(TC培养过夜，并按照体积比1:100将其传代于低盐LB液体培养基，进行培 养。 阳19引 2)在步骤1)的培养液ODe。。值达到0. 2时，加入终浓度为1mmol/L的k阿拉伯糖 诱导Red重组系统的表达。 阳199] 3)待步骤2)的培养液ODe。。值为0. 6时，取步骤1制备的浓度为30化g/ y L的打 祀片段电转S. flexneri 2a 301 ApCP/pKOBEG，得到转化后的细胞。
[0200] 4)在转化后的细胞中快速加入提前预冷的ImL低盐LB液体培养基，30°C复苏 2.化左右，然后涂布于含有50ug/mL浓度的卡那霉素的LB平板，放于30°C培养箱培养过 夜，筛选出阳性克隆。 阳201] 5)将阳性克隆接种于含有50 y g/血的卡那霉素的LB液体培养基中，42°C培养传 代两次（每次培养1化时间），即可除去地OBEG质粒，最终获得含卡那霉素抗性、waal缺失 突变株，将其命名为 S.fIexneri 2a 301 ApCP waal::kanl。 阳202] 4、将编码FRT位点特异性重组酶的质粒pCP20电击转入S. flexneri 2a 301 ApCP waal: :kan中，在含50ug/mL浓度的氯霉素及不含卡那霉素的LB平板上30°C培养， 筛选CmrKms (氯霉素抗性、卡那霉素敏感）的阳性克隆。 阳20引 5、将步骤4筛选到的阳性克隆，转入液体LB中42 °C培养12小时，即可获得0-抗 原连接酶基因waal缺陷的无毒福氏志贺氏菌2a 301，将其命名为S. flexneri 2a 301 A pCP A waal。 阳204] (pCP20的复制子对溫度敏感，42°C培养时丢失，此质粒含有编码FLP重组酶的 DNA，由溫敏启动子控制，42°C培养时诱导FLP重组酶表达，同时该质粒丢失。） 阳205] ( S ) S. f Iexneri 2a 301 A pCP A waal 的分子鉴定 阳2〇6] W S. fIexneri 2a 301 ApCPAwaaI的基因组DNA为模板，分别用一对waal内 部引物（301waaln5/301