至69位氨基酸，第37至第38位为柔性linker， 第39至第648位为巧PA氨基酸序列，第649至第662位为柔性linker和his标签，第1 位至第19位为化bA信号肤序列。 阳巧0] 巧PA5566N的编码基因序列如SEQ ID No. 51所示，其中自5'末端起第70至105位 为Pi化的第55至66位氨基酸编码序列，第112位至第1941位为巧PA编码序列，第7位 至第63位为化bA信号肤编码序列。巧PA5566N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 52所示， 自N端起第22至第33位为Pi化的第55至66位氨基酸，第34至第35位为柔性linker， 第36至第645位为巧PA氨基酸序列，第646至第659位为柔性linker和his标签，第1 位至第19位为化bA信号肤序列。 阳巧U 巧PA5866N的编码基因序列如沈Q ID No. 53,其中自5'末端起第70至96位为 Pi化的第58至66位氨基酸编码序列，第103位至第1932位为巧PA编码序列，第7位至 第63位为化bA信号肤编码序列。巧PA5866N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 54所示，自 N端起第22至第30位为Pi化的第58至66位氨基酸，第31至第32位为柔性linker,第 33至第642位为巧PA氨基酸序列，第643至第656位为柔性linker和his标签，第1位至 第19位为化bA信号肤序列。 阳巧引 用EcoR I和Hind III分别双酶切沈Q ID No. 45、沈Q ID No. 47、沈Q ID No. 49、 沈Q ID No. 51、沈Q ID No. 53所示的DNA分子，得到各基因片段；用EcoR I和Hind III 双酶切PMMB66EH，得到载体大片段；将各基因片段分别与载体大片段连接，得到重组 质粒，分别命名为 pMMB66EH-rEPA4573、pMMB66EH-rEPA5573N、pMMB66EH-rEPA5569N、 pMMB66EH-rEPA5566w、pMMB66EH-rEPA5866w,将重组质粒送测序，结果均正确。 阳巧3] 2、糖基工程福氏志贺氏菌的制备
[0254]将步骤 1 制备的表达载体 pMMB66EH-rEPA4573、pMMB66EH-rEPA5573N、 pMMB66EH-rEPA5569N、pMMB66EH-rEPA5566N、pMMB66EH-rEPA5866N分别电转上述步骤（二） 制备的 S. f Iexneri 2a 301 A pCP A waaI/pETtac28-pglL 菌株，涂布含有终浓度为 50 y g/ 血卡那霉素和100 y g/mL氨节青霉素的LB双抗固体培养基，阳性克隆即糖基工程福氏志贺 氏菌 S.f Iexneri 2a 301 ApCP A waaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA4573、S.f Iexneri 2a 301 ApCPAwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66EH-rEPA5573NN S.flexneri 2a 301 ApCP AwaaI/pETtac28-pglL/pMMB66 邸-rEPA5569N、S.flexne;ri 2a 301 ApCPAwaaI/ 祀Ttac28-pglL/pMMB66EH-rEPA5566N、S.flexne;ri 2a 301 ApCPAwaaI/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rEPA5866N、。 阳巧5] 3、重组EPA融合蛋白的糖基化修饰与检测 阳巧6]挑取糖基工程菌 S. flexneri 2a 301 ApCPAwaaI/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rEPA4573、S. flexneri 2a 301 A pCP A waaI/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rEPA5573N、 S. flexneri 2a 301 ApCPAwaaI/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rEPA5569w、S. fIexneri 2a 301 A pCP A waaI/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rEPA5566N、 S. flexneri 2a 301 ApCPAwaaI/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rEPA5866w单克隆，接种于含有终浓度为100 y g/mL氨节青霉素和50 y g/mL卡那 霉素的LB培养基，37°C培养至ODe。。约为0. 6时，加入终浓度为ImM的IPTG，并降溫至16°C 诱导20h。 阳巧7] 次日取上述16°C诱导20h的菌液1血，离屯、取菌体，用IX还原样缓悬起，沸水浴 lOmin，用8%的SDS-PAGE电泳，电泳完毕后用Bio-L油半干转转印仪将蛋白转至PVDF膜 上，20V恒压转印比，用anti-EPA抗体检测，结果如图6所示。 阳巧8] 图6表明，截取的Pi化蛋白G55~K73、G55~S69、G55~V66的肤段融合到EPA 蛋白N端依然成功使重组融合EPA蛋白0糖基化修饰，但随着所截取肤段的缩短，重组融合 EPA蛋白的糖基化效率明显逐渐减弱。 阳巧9] W上结果表明，能使重组融合蛋白被0糖基化修饰的核屯、肤段为Pi化的G55~ V66,但从实际应用角度出发，本发明采用Pla的氨基酸序列（即Pi化的S45~K73) (PHE 的Genbank号为NC_003112. 2)融合至不同载体蛋白的适当位置进行相关研究。
[0260]=、一步生物交联法制备福氏志贺氏菌0抗原多糖-重组CTB融合蛋白结合物 阳26U ( -）挑取糖基工程菌 S. flexneri 2日 301 ApCPAwaaI/pETtac28_pglL/ pMMB66EH-rCTB4573单克隆，接种于含100 y g/mL氨节青霉素和50 y g/mL卡那霉素双抗LB 培养基，37°C培养至ODe。。约为0. 6时，加入终浓度为ImM的IPTG，并降溫至16°C诱导20h。 阳262](二）0多糖-重组CTB融合蛋白结合物rCTB4573-〇PSsf3〇i的纯化 阳％3] 1、样品预处理
[0264] 取上述步骤（一）16°C诱导20h的菌体lOg，加入100血纯水，超声破菌（超声3s 暂停5s，累计超声时间30min)，12000g离屯、，收集上清，向上清中加入上样缓冲液（20mM pH7. 5 Tris-HCl、0. 2M化(：1、101111咪挫），充分揽拌，再次12000旨离屯、，收集上清，此上清为 含有0多糖-重组CTB融合蛋白结合物rCTB4573-0PSsf3Di的粗提液。 阳2化]2、用化elating亲和层析柱纯化样品
[0266] 用Oielating亲和层析柱（巫1. 6cm*15cm)初步纯化样品。 阳％7] 首先用0. 5M的化OH的水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡 至抑中性，然后用0. 5M的NiS〇4的水溶液平衡至少3个柱床体积，再用Bl液（20mM抑7. 5 Tris-肥1,0. 5M化Cl, 500ml咪挫）平衡至少一个柱床体积，最后用Al液（20mM pH7. 5 Tris-肥I，0. 5M化Cl, IOmM咪挫）平衡至少3个柱床体积，W上流速均为4mL/min。从A管 道将步骤1得到的rCTB4573-0PSsf3M的粗提液上样，再用Al液（20mM pH7. 5 Tris-肥1,0. 5M 化Cl ,IOmM咪挫）洗去未结合蛋白，冲洗至紫外吸收（280nM)接近于0 mAU，最后用100% Bl (20mM pH7. 5 Tris-肥1，0. 5M化Cl, 500ml咪挫）洗脱，收集洗脱液30血，得到初步纯化 的样品。
[0268] 3、样品除盐
[0269] 用G25 fine层析柱（〇 1. 6cm*30cm)将步骤2的初步纯化的样品除盐，流动相为 A2 液（20mM P册.4 HAc-NaAc)。
[0270] 首先用0. 5M的化OH的水溶液冲洗至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至抑 中性，最后用A2液平衡至少3个柱床体积，从A管道上样步骤2得到的初步纯化的样品，流 动相为A2液（20mM P册.4 HAc-NaAc)并收集样品60血，W上流速均为4血/min。，得到除盐 后的样品。 阳27U 4、用ProteinPak SP8皿阳离子交换层析柱进一步纯化rCTB4573-0PSsf3M 阳27引将步骤3除盐后的样品用ProteinPak SP8皿阳离子交换层析柱进一步纯化。 阳273] 首先用0. 5M的化OH的水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水 平衡至抑中性，然后用A2液（20mM P册.4 HAc-NaAc)平衡至少3个柱床体积，将样品 从A管道上样，用A2液洗去未结合糖蛋白，然后0~50 %的B2液（A管道进A2液，B 管道进B2液，纯化仪自动混合）30min内线性洗脱，并收集洗脱液，W上流速均为ImL/ min。糖蛋白rCTB4573-〇PSsf3〇i的出峰位置在电导为约35~45mS/cm处，即为目的蛋白 rCTB4573-〇PSsf3Di。 阳274] 将样品用12% SDS-PAGE和western blot分析，结果如图7所示。 阳八引图7的各泳道中，M为蛋白marker ;破菌上清代表步骤1得到的rCTB4573-0PSsf3M 的粗提液；Ni代表步骤2得到的初步纯化的样品；SP8皿代表ProteinPak SP8皿阳离子交 换层析柱进一步纯化的目的蛋白rCTB4573-0PSsf3M;anti-His代表用Anti-His tag鼠单克 隆抗体的WB图；anti-0PSsf3Di代表用兔源Anti-OPS SfSDi抗血清的肥图。 阳276] 四、一步生物交联法制备福氏志贺氏菌0多糖-重组EPA融合蛋白结合物 阳277]( 一）挑取糖基工程菌 S. f Iexneri 2a 301 A pCP A waaI/pETtac28-pglL/ pMMB66EH-rEPA4573单克隆，接种于含100 y g/mL氨节青霉素和50 y g/mL卡那霉素双抗LB 培养基，37°C培养至ODe。。约为0. 6时，加入终浓度为ImM的IPTG，并降溫至16°C诱导20h。
[0278](二）0多糖-重组EPA融合蛋白结合物巧PA4573-0PSsf3Di的纯化 阳279] 1、样品预处理 阳280] 取上述步骤（一）16°C诱导2化的菌体lOg，加入100血纯水，超声破菌（超声3s暂 停5s，累计超声时间30min)，12000g离屯、，收集上清，向上清中加入加入上样缓冲液（20mM pH7. 5 Tris-HCl、0. 2M化(：1、101111咪挫），充分揽拌，再次12000旨离屯、，收集上清，此上清为 含有0抗原多糖-重组EPA融合蛋白结合物巧PA4573-0PSsf3Di的粗提液。 阳2W] 2、用化elating亲和层析柱纯化样品 阳28引用化elating亲和层析柱（巫1. 6cm*15cm)初步纯化样品。 阳283] 首先用0. 5M的化OH的水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡 至抑中性，然后用0. 5M的NiS〇4的水溶液平衡至少3个柱床体积，再用Bl液（20mM抑7. 5 Tris-肥1,0. 5M化Cl, 500ml咪挫）平衡至少一个柱床体积，最后用Al液（20mM pH7. 5 Tris-肥I，0. 5M化Cl, IOmM咪挫）平衡至少3个柱床体积，W上流速均为4mL/min。从A管 道将步骤1得到的rEPA4573-0PSsf3M的粗提液上样，再用Al液（20mM pH7. 5 Tris-肥1,0. 5M 化Cl，10mM咪挫）洗去未结合蛋白，最后用100%Bl(20mMpH7.5Tris-肥l，0.5M化Cl， SOOmM咪挫）洗脱，收集洗脱液30mU得到初步纯化的样品。 阳284] 3、样品除盐 阳285] 用G25 fine层析柱（巫1. 6cm*30cm)将化elating亲和层析柱初步纯化样品除盐， 流动相为 A3 液（20mM pH7. 5 his-肥 1)。 阳286] 首先用0. 5M的化OH的水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡 至抑中性，最后用A3液平衡至少3个柱床体积，从A管道上样步骤2得到的初步纯化的样 品，并收集样品6〇111以流动相为A3液（20mM pH7. 5化is-肥1)，W上流速均为4mL/min，得到 除盐后的样品。 阳287] 4、用ProteinPak DEAE8皿阴离子交换层析柱进一步纯化巧PA4573-〇PSsf3〇i
[02蝴将步骤3除盐后的样品用ProteinPak DEAE8皿阴离子交换层析柱（waters)进一 步纯化。 阳289] 首先用0. 5M的化OH的水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡 至抑中性，然后用A3液（20mM pH7. 5 Tris-WU平衡至少3个柱床体积，将样品从A管 道上样，用A3液洗去未结合糖蛋白，然后0~50 %的B3液（A管道进A3液，B管道进B3 液，纯化仪自动混合）30min内线性洗脱，并收集洗脱液，W上流速均为ImL/min。糖蛋白 巧PA4573-0PSsf3Di的出峰位置在电导为约8~18mS/cm处，得到蛋白巧PA4573-〇PSsf30i粗提 液。 阳29〇] 5、用 Superdex 75 层析柱精纯化巧PA4573-〇PSsf3〇i 阳291] 将ProteinPak DEAE8皿阴离子交换层析柱纯化的样品用Superdex 75 FPLC(〇lcm*30cm，GE公司）进一步精纯化。 阳292] 首先用0. 5M的化OH的水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡 至抑中性，然后用A4液（20mM抑7. 5 PB、0. 9g/100ml化a)平衡至少3个柱床体积，通过 上样环上样蛋白巧PA4573-0PSsf3Ml血粗提液，收集8~11血流出的样品，此样品即精纯化 的巧PA4573-〇PSsf3〇i，即目的蛋白巧PA4573-〇PSsf3〇i。 阳293] 将样品用8% SDS-PAGE和western blot分析，同时W不转祀Ttac28-pglL只转 pMMB66EH-rEPA4573 得到的 S. flexneri 2a 301 ApCPAwaaI/pMMB66EH-rEPA4573 做对 照。 阳294] 结果如图8所示。
[0295] 图8中，从左至右第1泳道代表对照蛋白；第2泳道代表步骤1得到 的巧PA4573-0PSsfwi的粗提液；纯化样品代表步骤5精纯化得到的目的蛋白 巧PA4573-0PSsf3Di;考染代表纯化样品的考马斯亮蓝染色结果；Anti-his代表用Anti-His tag鼠单克隆抗体的WB图；Anti-OPS SfSDi代表用兔源Anti-OPS SfSDi抗血清的肥图。
[0296] 五、rCTB4573-〇PSsf3〇i和巧PA4573-0PS sf3〇i多糖蛋白结合疫苗的的制备及动物实 验评价
[0297] (一）rCTB4573-OPSsf3〇i和巧PAA5T 3-OPS sf3〇i多糖蛋白结合疫苗的的制备
[0298] 将步骤S纯化的rCTB4573-0PSsf3Di和步骤四纯化的巧PA4573-0PS SfSDi过滤除菌， 与氨氧化侣佐剂按照体积比9:1的比例混合，得到rCTB4573-0PSsf3。郝巧PA4573-0PS SfWi腹 腔注射样品。
[0299] (二）rCTB4573-0PSsf3M和巧PAA5T3-OPS邏1的动物免疫及效果评价
[0300] 1、〇 抗原（〇PSsf3〇i)的制备 阳301] 先用热酪水法提取LPS(参考文献"孙洋，冯书章，祝令伟，等.肠 出血性大肠杆菌0157 LPS单克隆抗体的制备与鉴定[J].中国人兽共患病学 报，2007, 23(10) :971-973.")，冻干保存，用1%冰醋酸W lOmg/ml的浓度溶解，沸水浴90 分钟后冷却至室溫，调节pH至7. 0。经64000X g离屯、5小时后收集上清，用去离子水彻底 透析后冻干保存。 阳302] 2、小鼠实验 阳30引取40只6周龄大的雌性Ba化/c小鼠，随机分为W下4组：氨氧化侣组、OPSsfWi组、 rCTB4573-0PSsf3M组和巧PA4573-0PS SfSDi组，其中氨氧化侣组为阴性对照，其余S组W多糖 含量计量注射2. 5 y g的多糖；各组均分别在第1、14、28天免疫，最后一次免疫后10天后摘 眼球取血。
[0304] 用间接ELISA法测各组小鼠血清中抗福氏志贺氏菌2a型0抗原多糖的抗体滴度。 用提取的福氏志贺氏菌2a 301株LI^包被酶联板，每孔包被10 y g的LPS，其他操作步骤参 见精编分子生物学实验指南[M].科学出版社，2008.。 阳3〇引结果如图9所示。
[0306] 图9中，Al组为氨氧化侣组；OPS组代表OPSsfSDi组；rCTB-OPS组代表 rCTB4573-0PSsf3Di组；rEPA4573-(PS 组代表巧PA4573-0PS SfSDi组。 阳307] 图9表明，与OPSsfwi相比，步骤S纯化的rCTB4573-0PS sf3。郝步骤四纯化的 巧PA4573-0PSsf3M均能显著诱导小鼠产生抗福氏志贺氏菌2a 301的0PS(0多糖）的特异性 抗体。 阳30引六、通过串联0-糖基化位点提高0多糖-重组融合蛋白中多糖的比例 阳3〇9]( -）含两个Pla序列的重组CTB融合蛋白rCTB4573康达载体的构建
[0310] 为了提高糖蛋白的多糖蛋白比例，将两个Pla (即Pi化的S45~K73)的氨基酸序 列串联融合至CTB的C端，合成rCTB45732。 阳311] rCTB45732的编码基因序列如SEQ ID No. 55,其中自5'末端起第64位至第372 位为CTB编码序列，第388位至第474位、第487位至第573位为Pi化的第45至67位氨 基酸编码序列，第7位至第63位为化bA信号肤编码序列。rCTB45732蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No. 56所示，自N端起第20至第122位CTB氨基酸序列，第123至第127位、第157 至第160位为柔性linker,第128至第156位、第161至第189位为Pi化的第45至73位 氨基酸，第190至第199位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为化bA信号肤序 列。 阳31引 用EcoR I和Hind III双酶切SEQ ID No. 55所示的DNA分子，得到基因片段；用 EcoR I和化nd III双酶切PMMB66EH，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到 重组质粒，命名为pMMB66EH-rCTB45732,将重组质粒pMMB66EH-rCTB45732送测序，结果均正 确。 阳31引（二）含立个Pla序列的重组EPA融合蛋白（rEPA4573NMc)表达载体的构建
[0314] 为了提高糖蛋白中多糖的比例，根据EPA的空间结构，在其分子表面引入S个Pla 序列（即Pi化的S45~K73)，具体做法为：在巧PA的N端、C端、K240与P241之间融合共 3个Pla的多肤，从而构建巧PA4573nmc。
[0315] 巧PA4573wmc的编码基因序列如SEQ ID No. 57,其中自5'末端起第70位至第156 位、第877位至第963位、第2101位至第2187位为Pi化的第45