用于富集具有dha的破囊壶菌属微藻的生物质的方法

用于富集具有dha的破囊壶菌属微藻的生物质的方法
【专利摘要】本发明涉及用于通过氧的控制添加来富集具有二十二碳六烯酸(或DHA)的破囊壶菌属微藻，具体地是裂殖壶菌属或红树林裂殖壶菌的生物质的发酵方法。CNCM I-470220121122
【专利说明】用于富集具有DHA的破囊壶菌属微藻的生物质的方法
[0001]本发明涉及用于富集具有二十二碳六烯酸（DHA)的破囊壶菌属 (Thraustochytrium)，更具体地是裂殖壶菌属（Schizochytrium sp.)或红树林裂殖壶菌 (Schizochytrium mangrovei)的微藻的生物质的新颖发酵方法，并且还涉及从这种微藻生 物质提取的油。
[0002] 脂质与蛋白质和碳水化合物一起构成了大量营养元素的三个主要家族。
[0003] 在脂质中，甘油三酸酯和磷脂尤其突出：
[0004] -甘油三酸脂(也称为三酰甘油酯或三酸甘油酯或TAG)是这样的甘油酯，其中甘油 的三个羟基被脂肪酸酯化。它们是植物油与动物脂肪的主要成分。
[0005] 甘油三酸脂代表了被人类摄取的大约95%的饮食脂肪。在生物体内，它们主要存 在于脂肪组织中并构成能量存储的主要形式。
[0006] -磷脂是两亲的脂质，也就是说，由极性的（亲水的）"头部"和两个脂肪族的（疏水 的）"尾部"组成的脂质。
[0007] 磷脂是结构性脂质，因为它们是细胞膜的成分，它们尤其为细胞膜提供流动性。
[0008] 甘油三酸酯和磷脂主要由脂肪酸组成，这些脂肪酸都是由饮食提供，并且对于它 们中的一些，是由生物合成的。
[0009] 生物化学分类(基于脂肪酸分子中包含的双键数量）区分饱和脂肪酸（SFA)、单不 饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)。
[0010]从生理学角度，区分为以下内容：
[0011]-必需脂肪酸，人体成长和正常运行所必需的，但我们身体不能够产生；
[0012] 条件性"必需脂肪酸，其对于细胞正常生长和生理功能是必要的，但如果通过饮 食提供的话，其可以从它们的前体中产生。因此，如果它们必需的前体不存在，它们是绝对 必需的；
[0013] -非必需脂肪酸。
[0014] 所有必需脂肪酸和"条件性"必需脂肪酸构成了必需脂肪酸。
[0015] 其他脂肪酸称为非必需脂肪酸。
[0016] 非必需脂肪酸尤其包括：
[0017] - ω 3脂肪酸家族的二十碳五烯酸(EPA)，
[0018] -油酸，我们饮食中的主要单不饱和脂肪酸，和棕榈油酸，
[0019] -饱和脂肪酸，例如月桂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸。
[0020] 多不饱和脂肪酸
[0021] 多不饱和脂肪酸是根据第一双键的位置(从最终甲基官能起始)归类的。
[0022] 因此，在命名中对于ω "X"或"ηχ"，"X"对应于第一不饱和的位置。
[0023]将必需脂肪酸分为两个主要家族：ω6脂肪酸（或n-6PUFA)，其前体和主要代表是 亚油酸(LA)，以及ω 3脂肪酸(或n-3PUFA)，其前体是α-亚麻酸(ALA)。
[0024]生物学上感兴趣的大部分多不饱和脂肪酸属于ω 6家族(花生四烯酸或ARA)或ω 3 家族(二十碳五烯酸或EPA，二十二碳六烯酸或DHA)。
[0025] 此外，在命名中，构成链的碳的数目也被定义:从而EPA被描述为C20: 5并且DHA被 描述为C22:6。
[0026] 因此"5"和"6"对应于碳链的不饱和数目，碳链分别由EPA和DHA表示。
[0027] ω 3脂肪酸家族的DHA是生物可以从α-亚麻酸合成的或通过消耗富含油脂的鱼(金 枪鱼、鲑鱼、鲱鱼等)提供的一种脂肪酸。
[0028] DHA在膜的结构中以及在脑和视网膜的发育和功能中发挥重要作用。
[0029] 鱼油主要用作ω 3脂肪酸例如DHA和EPA的来源，但ω 3脂肪酸也发现于微藻油中， 其中它们是作为混合物或分开地进行提取，如在这种情况下，例如这些油来源于某些选择 的株系，例如裂殖壶菌属的那些，其仅包含痕量的ΕΡΑ，但包含高DHA含量。
[0030] 饱和脂肪酸
[0031] 在饱和脂肪酸中，棕榈酸（也称十六烷酸或鲸蜡酸）是在动物和植物中最常见的 C16:0饱和脂肪酸之一。
[0032] 棕榈酸是在脂肪生成过程中产生的第一种脂肪酸;更长的脂肪酸可以从所述棕榈 酸产生。
[0033] 此外，脂肪酸被优先用于合成ATP。其燃烧的能量平衡表示为129个ATP。因此，它构 成了一种优秀的能量食品。
[0034] 在工业上，棕榈酸还被用于人造黄油和硬皂的生产。
[0035] 在涂料领域中，鉴于棕榈酸是饱和的，它不能聚合并且一旦与大气中的氧气接触 它就变得坚硬(不像油酸、亚油酸和亚麻酸）。因此，它仍处于其软固体形式并且(与硬脂酸） 作为聚合油粘合剂的增塑剂。因此，与硬脂酸一起，它针对随时间推移的含油图片材料的完 好保存提供了所需的弹性。
[0036]单不饱和脂肪酸
[0037] 作为单不饱和脂肪酸前体，棕榈酸生成棕榈油酸（16:1，n_7)，棕榈油酸大量天然 存在于沙棘的果实或果肉中。
[0038] 此外，已经描述了在食物中增加提供棕榈油酸会具有降低血液胆固醇和降低血液 甘油三酸脂的作用，降低中风的风险，并且还改善血管平滑肌细胞中的代谢。
[0039] 通过微藻的脂质，尤其是脂肪酸的生产
[0040] 常规地在发酵罐中培养裂殖壶菌属的微藻(异养条件:在黑暗中并且在碳源存在 下)。
[0041]应注意，这些微藻的有益利用一般需要控制发酵条件。
[0042]因此，为了实现这一结果，已经大大发展了用于使得有可能获得高细胞密度(HCD) 的发酵的第一方法，以便获得脂质的最大产量和生产率。
[0043]这些HCD培养的目标是在尽可能最短的时间段内，获得所需脂质的最尚可能浓度。
[0044] 然而，对于本领域专家而言，很快变得清楚的是，例如，当希望使微藻产生大的脂 质储存时，有必要使这些微藻经历限制它们的生长的营养压力。
[0045] 因此，在发酵方法中常规地分开了生长与生产。
[0046] 例如，为了促进多不饱和脂肪酸(在这种情况下是二十二碳六烯酸或DHA)的积累， 专利申请WO 01/54510推荐从多不饱和脂肪酸的生产解离细胞生长。
[0047] 更具体地说，要求了用于生产微生物脂质的方法，该方法包括以下步骤，这些步骤 在于：
[0048] (a)进行培养基的发酵，该培养基包括微生物、碳源和限制性营养源，并且确保足 以维持在所述发酵培养基中至少大约4%的饱和的溶解氧含量的条件，以便增加生物质；
[0049] (b)然后提供足以维持在所述发酵培养基中大约小于或等于1 %的饱和的溶解氧 含量的条件，并且提供足以允许所述微生物产生所述脂质的条件;并且
[0050] (c)收集所述微生物脂质，其中至少15%的所述微生物脂质由多不饱和脂质组成； [0051 ]并且其中在发酵过程中，获得至少大约100g/l的生物质密度。
[0052]在微藻裂殖壶菌属(株系ATCC 20888)中，更具体地说在碳源和氮源存在下，但是 不限制氧的情况下进行第一生长阶段，以便促进获得高细胞密度，然后在第二阶段，停止氮 的供应，并且逐渐减慢氧的供应(溶解氧压力或PO 2的管理从10%至4%，然后至0.5%)，以 便胁迫微藻，减慢其生长并且触发感兴趣的脂肪酸的产生。
[0053] 在微藻寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)中，以低葡萄糖浓度（约5g/l)并且 因此以低生长速率来获得更高DHA含量（江（Jiang)和陈（Chen)，2000,生物化学工艺 (Process Biochem.)，35(10)，1205-1209)〇
[0054] 因此，在产物形成与高细胞生长无关的情形中，教授控制细胞生长速率是明智的。
[0055] 总的来说，本领域技术人员选择通过控制发酵条件(温度、pH)，或通过营养组分至 发酵培养基的调节的进料(半连续条件称为"补料分批"），来控制微藻的生长。
[0056] 如果他们选择在异养条件下通过碳源供应来控制微藻生长，那么本领域技术人员 一般选择根据所产生的代谢物(例如，DHA型的多不饱和脂肪酸)来调整给予微藻(寇氏隐甲 藻、纤细裸藻(Euglena gracilis)等）的碳源(纯葡萄糖、乙酸盐、乙醇等）。
[0057]温度还可以是关键参数。例如，已报道，在一些微藻物种中的多不饱和脂肪酸合 成，例如极微小球藻(Chlorella minutissima)的EPA合成，在低于所述微藻的最佳生长所 需温度的温度下被促进。
[0058]为了优化甘油三酸酯生产，本领域技术人员还通过作用于发酵培养基的营养环境 来优化朝向油产生的碳流。
[0059] 因此，已知当存在碳的充足供应但是在氮缺乏的条件下时，油积累。
[0060] 因此，此处C/N比率是决定因素，并且已接受最佳结果是在葡萄糖含量不是限制因 素时通过直接作用于氮含量来获得。
[0061]因此，为了优化油生产，对于本领域技术人员至关重要的是通过移动它朝向不利 于蛋白质生产的油生产，来控制碳流；当将微藻放置在氮缺乏培养基中时，碳流被再分配并 且积累为脂质储存物质。
[0062] 除了所有这些以外，凭借实施标准发酵条件，富含DHA和棕榈酸的微藻生物质的商 业制剂是可获得的。
[0063] 然而，对于用于生产具有高DHA含量和控制含量的棕榈酸和/或棕榈油酸的品质微 藻生物质的替代方法仍存在未满足的需要。
[0064] 发明概述
[0065]本发明涉及用于生产富含二十二碳六烯酸(DHA)的破囊壶菌属的微藻的生物质的 方法，其特征在于，在异养条件下的培养阶段期间，控制氧的供应，以便仅满足以下需氧量： 1)细胞维持所必需的能量生产，2)基础脂质生产，以及3)除了脂肪酸的生物质的增长。
[0066] 优选地，该方法的特征在于，通过以下等式2计算仅满足要求1)、2)和3)所必需的
氧供应
[0067]
[0068] 其中
[0069] q〇2目标是按克/克的除了脂肪酸的生物质/小时计的氧量；
[0070] qm是被表示为g的葡萄糖/克的除了脂肪酸的生物质/小时的维持系数；
[0071 ] q趣fflgg是被表不为g的基础脂质/g的除了脂肪酸的生物质/小时的基础脂质积累 率；
[0072] /2/職!是被表示为g的氧/g的脂质的相对于脂质形成的氧消耗系数；
[0073] μ是被表示为g的除了脂肪酸形成的生物质/g的除了脂肪酸的生物质/小时或(1Γ1) 的增长速率；
[0074] y132八是被表示为g的氧/g的除了脂肪酸的生物质的相对于除了脂肪酸的生物质形 成的氧消耗系数。
[0075] 任选地，在该发酵方法期间，没有限制营养元素，尤其是碳源或氮源。
[0076]任选地，生长阶段和DHA生产阶段是相伴的。
[0077]优选地，这些微藻属于裂殖壶菌属或是红树林裂殖壶菌。更确切地说，这些微藻可 以是选自株系CNCM 1-4469和CNCM 1-4702的株系，其分别在2011年4月14日和2012年11月 22日存放在巴斯德研究所的法国微生物培养物国家保藏中心(ColIection Nationale de Cultures de Microorganismes)〇
[0078] 任选地，该方法还可以包括收获生物质，任选地从这种生物质制备细胞提取物或 裂解物，然后任选地提取富含DHA的粗制油。
[0079] 根据本发明所述的方法的特征可以在于获得的生物质包括
[0080] -按总脂肪酸的重量计至少40%的DHA;和/或 [0081 ]-按总脂肪酸的重量计至多40%的棕榈酸;和/或 [0082]-按生物质的干重计至少25%的脂肪酸。
[0083]发明详细说明
[0084]在本发明背景下，
【申请人】公司已经选择通过提出本领域技术人员常规设想的那些 方案的替代性方案来探索一条用于优化DHA生产的原路径。
[0085]因此
【申请人】公司已经发现，悖逆本领域的技术先见，有可能通过发酵富含脂质(按 生物质的干重计多于45 % )的微藻生物质进行生产，其主要脂肪酸是二十二碳六烯酸 (DHA)，同时调节或控制棕榈酸和棕榈油酸的量：
[0086]-不需要将微藻生长阶段与脂质生产阶段分开;正相反，脂质生产伴随细胞生长并 且因此是在单阶段中进行的，
[0087]-如现有技术所描述的，诱导氮限制或任何其他营养元素的限制不是必需的，并且 [0088]-通过p〇2控制发酵也不是必需的。
[0089]因此
【申请人】公司已经发现，有可能凭借控制发酵培养基的氧合作用来控制生物质 的脂质组成，并且尤其是DHA以及棕榈酸和棕榈油酸的比例。
[0090]确实，
【申请人】公司已经理解，根据以下优先级，由微藻来使用氧：
[0091] -用于维持的能量生产，
[0092] - 一些称为基础脂质的脂肪酸的生产，其中DHA是主要的，
[0093]-除了脂肪酸的生物质的增长，以及
[0094]-用余量氧生产棕榈酸。
[0095]换言之，根据本发明所述的方法在于满足对应于前三点的需氧量，并且因此提供 最佳氧量，以获得富含DHA的生物质(不论它是由裂殖壶菌属还是红树林裂殖壶菌产生的）。 [0096]接下来，如将在以下实验部分中证明的，可以供应另外的氧，并且导致棕榈酸的快 速过量产生(很好地用红树林裂殖壶菌说明），过量产生或不过量产生棕榈油酸(很好地用 裂殖壶菌属说明）。
[0097]
【申请人】公司基于裂殖壶菌属株系ATCC 20888开始其工作。
[0098]按照现有技术的教授内容，尤其是专利申请WO 01/54510的那些教授内容，
【申请人】 公司首先发现，与披露的内容相反，PO2至0%或多于10%的恒定调节持续发酵的整个持续 时间使得有可能产生脂肪酸中多于35%的PUFA(相对于总脂肪酸多于25%DHA)，正如同用 PO2的级联下降（10 %，然后是4%，然后是0.5 %的饱和)进行的管理操作的情况。
[0099] 从另一方面来说，应用至株系CNCM 1-4702的后一种操作(根据申请WO 01/54510) 最终导致脂肪酸的产生，其中棕榈酸以多于60%高度占优，而DHA并未达到20%;这种操作 给出与通过在10%的恒定PO 2下操作，针对这种株系所获得的那些结果相同的结果。
[0100]此外，从技术观点看，当实验方案从实验室规模按比例扩大至工业规模(换言之， 从2至201发酵罐按比例扩大至1至200m3反应器)时，测量p02造成了大问题。
[0101] 确实，p02是如在饱和时发酵液中溶解的相对氧浓度来限定。例如，如果水在室温 和大气压下在空气中曝气足够长时间，就认为p〇2等于100% (这对应于发酵罐在t = 0时的 氧合作用状态）。事实上，当在发酵罐中，P〇2探头被校准时，溶解氧含量受到残余盐的浓度 的影响并且受发酵温度的影响。
[0102] 此外，常规接受的是，对于实验室发酵罐，P02仅受由发酵液的高度产生的压力的 影响，并且受混合效果的影响。然而，在中等容量(约Im 3)至大容量(约数百m3)的发酵罐上的 工业化期间，正相反，发酵液的高度将：
[0103] -对溶解氧压力有影响;并且
[0104] -在"并未完美搅拌的"发酵罐中引起复杂的现象。
[0105] 从这个意义上来说，在实验室规模上建立的P02值不能因此被外推至工业规模。
[0106] 此外，针对裂殖壶菌属描述的专利WO 01/54510的建议看来似乎是不可推广至破 囊壶菌属的所有株系的。换言之，在本发明中，不存在氧供应方面的减少，以便"胁迫"微藻， 从而使其产生其储存脂质（在这种情况下是DHA)，相反存在至由所述微藻用于调整其脂质 生产方向表示的要求的程度的氧供应控制，而不提及P〇2。
[0107] 此外，通过控制氧供应来操作发酵的选择已经让
【申请人】公司获得非凡的结果，该 选择的任何使用无需限制一些营养物质的供应，或将生长阶段与生产阶段分开：
[0108] -感兴趣的脂质，尤其是DHA的总体含量的增加，以及
[0109] -气味减少(收获的CNCM 1-4469的生物质的特别强烈的气味的减少是明显的）。 [0110] 微生物的选择 待用于本发明的方法的株系属于破囊壶菌属，更具体地说是裂殖壶菌属或红树林 裂殖壶菌。这类株系是本领域技术人员所已知的。例如，可以提及的是裂殖壶菌属株系ATCC 号20888,在申请WO 01/54510中做了描述和研究。
[0112]在其研究过程中，
【申请人】公司已经鉴定了产生DHA的极感兴趣的若干微藻株系。申 请人公司尤其对已经鉴定的两种株系相当特别感兴趣。
[0113] 第一种株系是裂殖壶菌属的株系，在2011年4月14日在法国存放在巴斯德研究所 的法国微生物培养物国家保藏中心(CNCM)中编号I -4469下，并且还在中国存放在中国武汉 (430072)的武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE C0LLECTI0N，CCTCC)中编号M 209118下。这种株系主要产生DHA并且在较低程度上产生棕榈 酸和棕榈油酸。它由编码18S RNA的基因
[0114] 的部分测序来表征（SEQ ID No 1):
[0115] 61 CTCStCaCtli CCTCGfGGAO tCCAC^TTGG GXMTXTACS CGCCfSCTGC CtTCCftCiGA 121 Τζ?ΤΟξ?Τ?δξΧ GTCTCTCftSG CTCCCTCTCC GG^GTCGAGC CCT^CTCCC CGTCACCCOT im. T^mGTCliCC Otasccca^t ^ccctaccgt CO^CA^CTGA 241 TiTCATCGCTC CGAMAGCGa TCTGCTCMT XATCATGACT C^CCM.G^GI< STTGSCTTAC 301 &CCTA?kT^M? IGCSGCCCTC CCCGAAAGTC GGGCCCSTAC ?GCACGTATT AATTCCASM 361 TTiiCTGCAGG IMOCGTAT^ AAGGAACTAC： CG^AGG?ATT ATAACTQMiA TAATG^GCCfi 421 TTOiSCACSTTT CACAfiTATA^ TTCGCTT^TA ΟΤΤ?€Α??Τ(? C^Ti?fiCTTA>3 TCTTIC3?v(m
[0116] 这使得有可能将其鉴定为裂殖壶菌属类型的株系。在本申请中这种株系随后将被 表示为 "CNCM 1-4469"。
[0117] 此外，第二种株系是红树林裂殖壶菌的株系。它产生相对相等比例的DHA和棕榈 酸。它由
【申请人】公司在2012年11月22日在法国存放在巴斯德研究所的法国微生物培养物国 家保藏中心（CNCM)中编号1-4702下。它由编码18S rRNA的基因的测列来表征（SEQ ID No 2)：
[0118] I GOITtT^CAT TGCTCTCATT CCGATaGCA^ AACGCATACA CCCTTCGCAT CGAI^TTTCT 61 CGtCCfACCl COtSsmGTCC AC&iStGG(5tA MtTACSCGC CtiSCXSCf AT CCttOSlvmx 121 GfSTAGCCGTC TCTCAGGCTi： CCTCTCCGGA GTCii^SCCCT A^CTCTCCGT CACC：CSTTAT ISl AfSICACCOTA <?Τ〇〇?ΑΤΑ<? Cl?vCC〇TC$A 〇ΑΑ€1(?&Ι：?β ΟΑ?λΟΟ^ΙΤΟ 241 ATCCiAGCAAi^ A?AC5T CA^TC TfSCTC^ATTA TC.AT0ATTCA CCMKTAAAM: (；Οβ〇Τ?€??Τ 301 ΟΤΛ?ΤΑΑβ?δ 〇a：GCCCCASii CASQGCTCT'I ?Cii(SCIi.'rGT& Tx^TTICCAS X^CIwCIi 36:1 GGTATCCIiTA t^CCGI\?GA^ lstTATmCTG AimtCAG CCiSttCGC^C 421 rCTCiiCAiJm CAAtCOCXTS r&CT：i'^CAC& {Χ：Μ?
[0119] 这使得有可能将其鉴定为红树林裂殖壶菌类型的株系。在本申请中这种株系随后 将被表示为"CNCM 1-4702"。
[0120] 确定并且使用必需的氧量，特别是q02
[0121] 引入培养基中的总体氧流是可调节的并且本质上取决于：
[0122] -引入的空气的流速，
[0123]-促进氧在培养基中溶解的搅拌速率。
[0124] 这种流称为OTR(氧转移率）。
[0125]氧由培养物的消耗称为OUR(摄氧率）。
[0126] 当生物质在发酵罐中增长时，其总体氧消耗增加，直至所有转移的氧被吸收;然后 OUR被认为等于OTR。
[0127] OTR和OUR是针对全部培养基的数据。因此，针对一个培养体积的OUR可以相对于占 有此体积的细胞的量。
[0128] 因此，细胞消耗称为q02并且代表按吸收的克/克的细胞/小时计的O2量。然后针对 细胞照原样的质量，也就是说没有脂肪酸的质量，计算这种消耗，因为脂质储存在氧吸收方 面不具有积极作用。
[0129] 通过至培养基的控制的氧供应，本发明的方法使得有可能影响脂质生产并且根据 微藻生长条件(接种量、藻龄等)将其优化。
[0130] 总体O2消耗对应于细胞的不同氧使用之和。
【申请人】公司区分了氧消耗的四个路 径，它们对应于细胞的基本要求，用氧供应的程度的优先顺序依次满足这些要求。
[0131] 按优先顺序，这些要求如下：
[0132] 1.细胞维持。
[0133] 2.基础脂质生产。
[0134] 3.除了脂肪酸的生物质的形成。
[0135] 4.与代谢过量有关的脂质积累。
[0136]
【申请人】公司发现，因此由以下公式确定q02:
[0137] 等式（1)
[0138]
1234567891011 (1)(2)(3)(4) 2
[0140]等式的项"qm"、"q識鹏f、W臟"、"μ" W/和"q_额"应理解如下。 3
[0141]细胞维持。等式的项(1) 4 独立于任何脂质生产或生物质增长，细胞维持对应于细胞用于其维持所需的能 量。 5 "qm"是用于产生这种能量的碳基底物(一般是葡萄糖）的量;它被表示为g的葡萄 糖/g的除了脂肪酸的生物质/小时。在本领域中此项常规地由"维持能量"或"维持系数"表 不。 6 相关联的需氧量是成比例的。确实，需要6分子的02(摩尔质量:32g)来转化一分子 的葡萄糖(摩尔质量:180g)，因此是等式(1)中的项 7 基础脂质生产。等式的项(2) 8
【申请人】公司已经观察到，脂质积累伴随增长并且不止是当后者停止时才出现的现 象。脂质积累是增长的前兆，尽管只针对细胞膜形成。 9 这些基础脂质的组成随着株系的变化而不同，并且尤其包括作为DHA生物合成前 体的棕榈酸或棕榈油酸，但是DHA总是主要成分，由实例2说明了其量化。 10 这些脂质的积累率对应于等式(1)中的称为的流。 11 对于裂殖壶菌属株系CNCM 1-4469和红树林裂殖壶菌株系CNCMI-4702,由以下实 例说明了这一积累率。
[0150]为了获得相关联的需氧量，这一流或积累率乘以脂质形成的需氧量(也称为相对 于脂质形成的氧消耗系数），由等式(1)中的项?/職f表示。
[0151]因此，其次将氧供应用于基础脂质生产。
[0152]除了脂肪酸的生物质的形成。等式的项(3)
[0153] 总生物质包括脂质储存。
[0154] 通过测定确定后者（由脂肪酸组成)并且将其从总生物质中减去。
[0155] 除了脂肪酸（除了 "F.A"）的生物质的形成对应于富含蛋白质并且因此是真正具活 性的生物质的增长。
[0156] 增长速率用符号表示为等式（1)中的"μ"，它代表按形成的g/g的生物质（除了 F.A)/小时或(1Γ1)计的生物质(除了 F.A)。
[0157] 为了获得相关联的需氧量，这一增长速率(μ)乘以形成除了 F.A的生物质的需氧 量，由等式⑴中的项Wx"表示。
[0158] 因此，再次将氧供应用于除了脂肪酸的生物质的生产。
[0159] 计算除了脂肪酸的生物质的浓度
[0160] 根据本发明的方法，因为不存在营养的限制，所以增长是连续的。然而，观察到增 长速率的减慢，这是独立于培养基的耗尽的。
[0161] 除了 F.A的生物质的浓度根据初始生物质浓度而变化，并且根据其增长速率而增 加。
[0162] 为了在每个瞬间使用计算预测生物质浓度并且为了估计生长速率值，
【申请人】公司 建议使用以下等式(3)。
[0163] 等式(3)
[0164]
[0165] 这一等式说明了观察到的并且未解释的增长速率下降。
[0166] V代表增长速率(以h-Ι表示），并且)(代表除了 F.A的细胞浓度（以g/Ι表示）。
[0167] 针对这两种优选株系，这些参数不同，并且在表1中重现。
[0168] 表1
[0170]这一现象还减少了q02,因为增长速率(μ)有助于氧消耗(等式1)。
[0171]从引入并且已知的生物质（接种物）的量和发生变化的其增长速率来计算生物质 浓度。
[0172]与代谢过量有关的脂质积累。等式的项(4)
[0173]
【申请人】公司已经确定，一旦已经满足上述要求并且供应必需的氧，则仅存在后一 种流。
[0174]在等式（1)中由项"q_gg"x W職f表示的这一氧供应引起葡萄糖消耗速率的增 加，葡萄糖将转化为脂肪酸流。可以调节这一另外的氧供应，以便控制过量脂质的产生。
[0175] 如在实例1中说明的，脂肪酸产生的这种加速引起代谢过量并且导致棕榈酸的积 累（针对破囊壶菌属），以及棕榈酸和棕榈油酸的积累（针对裂殖壶菌属）。不受这一理论约 束，
【申请人】公司认为这种过量与以下事实相关:在代谢途径下游的酶继续以相同速率起作 用，而在代谢途径开始处的酶加速了其活性。
[0176] 用来形成F. A和除了 F. A的生物质的需〇2量的计算
[0177] O2转化产率使得有可能获知随除了F. A的生物质或脂质的产生变化的O2消耗。
[0178] 转化产率是本领域技术人员熟知的参数，这些技术人员因此可以通过常规试验确 定它们。
[0179] 在表1I中给出这些值并且它们特异性针对这两种优选株系。
[0180] 表Π
[0182]获得富含DHA的生物质-计算目标q02
[0183] 为了增加 DHA含量，
【申请人】公司确立，控制氧供应至仅满足前三个氧用途(维持、基 础脂质生产和除了 F.A的生物质的增长)是适合的。可以通过确定对应于按克/克的细胞/小 时计必需的〇2量的目标q〇2来限定这一供应。
[0184] 因此由等式(2)限定目标q02,该等式仅包括等式(1)的前三个分量。
[0185] 等式 2:
[0186]
[0187] 接下来，通过使其乘以除了F. A的生物质的浓度(可以通过针对每一瞬间的计算来 测量或预测该浓度)来将O2的细胞消耗的这一速率针对发酵罐按比例扩大。这一速率对应 于 OUR 〇
[0188] 鉴于条件是使得OTR对应于0UR，因此它将是在发酵方法期间，针对每一瞬间将施 加的这一 OTR。
[0189]
【申请人】公司已经发现，通过考虑目标氧合作用的这种控制，获得了富含DHA的生物 质。大于该目标的氧合作用导致更多棕榈酸和/或棕榈油酸的产生，并且因此导致DHA的稀 释。小于目标氧合作用水平的氧合作用限制了产生的生物质的量。
[0190]因为目标q02随着培养的进展变化，所以在以下实例中参考观察到的最大0UR。实 例1和2说明了控制氧合作用对裂殖壶菌属株系CNCM 1-4469和对红树林裂殖壶菌株系CNCM 1-4702的作用，以及用于获得比生产速率的方法。针对红树林裂殖壶菌株系CNCM 1-4702， 实例3说明了以下操作的作用，其中氧合作用的变化使得有可能改变生物质的棕榈酸和DHA 的比例。
[0191]在一个替代性实施例中，还可以凭经验确定满足前三个要求，即要求（1)、（2)和 (3)必需的氧供应。如实例3中所说明的，本领域技术人员可以进行不同发酵方法，其中使用 一系列的0TR，并且测量脂质和生物质的量。在这些结果的基础上，本领域技术人员可以限 定目标OTR，该OTR使得有可能满足前三个要求。
[0192] 根据本发明所述的发酵方法使得有可能获得富含脂肪酸的生物质。具体地，该生 物质包括按生物质的干重计至少25%的脂肪酸，优选是至少30%。针对株系1-4702,脂肪酸 含量可以取决于使用的株系并且可以达到按生物质的干重计40%的最大值。
[0193] 此外，并且相当有趣的是，这种富含脂质的生物质具有高DHA含量。具体地，根据本 发明所述的发酵方法使得有可能获得包含相对于总脂肪酸按重量计至少40%的DHA的生物 质。
[0194] 最终，根据本发明所述的发酵方法使得有可能获得具有减少的棕榈酸含量的生物 质。因此，该生物质包括相对于总脂肪酸按重量计至多40%的DHA。棕榈酸含量可以取决于 使用的株系，并且针对株系1-4469,棕榈酸含量可以达到相对于总脂肪酸按重量计10%的 最大值。
[0195] 此外，本发明还考虑了以下发酵方法，其中氧供应大于满足前三个要求，即要求 (1)、（2)和(3)必需的氧供应。具体地，将控制这种供应，以便获得DHA和棕榈酸和/或棕榈油 酸的希望的相对比例，同时优化产生的生物质的量。
[0196] 此外，在异养培养条件下进行根据本发明所述的发酵方法。适用于考虑的微藻而 且也适用于培养基的这些条件是本领域技术人员熟知的。微藻生长必需的碳源优选是葡萄 糖。氮源可以是酵母提取物、尿素、谷氨酸钠、硫酸铵、经PH调节的氨水，分开地或组合地使 用。总的来讲，培养步骤包括预培养步骤(为了使株系复苏），然后是适当的培养或发酵步 骤。后一步骤对应于感兴趣的脂质，特别是DHA的产生步骤。
[0197] 除了生物质，本发明还涉及制备自这种生物质的细胞提取物或裂解物。特别地，这 种提取物或裂解物是从发酵后回收的生物质制备的。这种提取物或裂解物富含DHA并且任 选地富含棕榈酸和/或棕榈油酸。可以通过不同路径(包括机械的、化学的和酶的路径)将细 胞破裂，以提取脂质内容物。
[0198] 随后，可以从细胞裂解物提取油，例如在若干连续提取中借助己烷/乙醇。随后将 己烷部分分离，并且然后将己烷蒸发以分离粗制油。
[0199] 因此，用于生产感兴趣的脂质（优选是DHA，以及任选地棕榈酸和/或棕榈油酸）的 方法包括根据本发明所述的发酵方法，收获生物质，制备细胞提取物或裂解物，并且提取粗 制油，该粗制油包括感兴趣的脂质，优选是DHA以及任选地棕榈酸和/或棕榈油酸。
[0200] 实例
[0201] 实例1:用于培养株系CNCM 1-4469和CNCM 1-4702以及确定氧合作用过量时的比 生产速率的条件 [0202] 培养条件
[0203]实验方案包括在用于发酵罐的接种的锥形瓶中，以针对株系CNCM 1-4469的0.1 g 的生物质/L，以及针对株系CNCM 1-4702的至少5g的生物质/L，进行预培养。
[0204]预培养
[0205]在28°C的温度下，在500ml带挡板的锥形瓶中，预培养(100ml的培养基)持续24h。
[0206] 通过过滤将培养基的所有组分在一起灭菌，并且在添加一滴Clearol FBA 3107消 泡剂后，将其引入在高压釜中预先灭菌的锥形瓶中。
[0207] 表1II
[0209] 培养
[0210] 分三份将培养基灭菌。
[0211] 刚好在To之前，将葡萄糖与KH2PO4-起在用于添加的锥形瓶中灭菌。
[0212] 在发酵罐中，将剩余的盐与0.05ml/l的Clearol FBA 3107-起灭菌。通过过滤将 微量元素和维生素灭菌。
[0213] To时的体积代表75%的最终体积。在To时使用氨水调节pH，然后仍用氨水调节为6。
[0214]表1V
[0216]在To时以恒定速率(待根据计算调整)开始连续供应葡萄糖(浓度:500g/l的补料） 的分批补料，以便浓度不低于20g/l，并且在结束时浓度不低于5g/l。
[0217]在28°C的温度下进行培养，持续从65至85小时的持续时间。
[0218]将玉米浸液(CSL)或酵母提取物(YE)用作氮源是可能的，使得有可能获得略微更 高的DHA结果。
[0219] 母液 [0220]表 V L0224J 确定比生产速率
[0225] 为了评估比生产速率，在10 %的p02下进行第一培养，这意味着在培养基中总存在 溶解的氧。在不限制营养源的情况下进行这一培养。
[0226] 这种方法使得有可能证明在氧过量下，待测试的株系的特征（图1)。
[0227] 在表VII中，给出的结果是在两种株系CNCM 1-4469和CNCMI-4702的生物质的培养 的T65时获得的那些结果。
[0228] 表VII:生物质和脂肪酸组成 123 F .A =脂肪酸
2 除了 DHA和棕榈酸(尤其是棕榈油酸）的不同脂肪酸被归在标题"其他脂肪酸"下， 3 以便证明对DHA和棕榈酸的作用，但是在目标q02的计算中，它们与DHA-起被包括在基础脂 质中。
[0232] 全局地进行平均速率的计算。
[0233] 通过气相色谱法(GC)来分析最终生物质。然后获知总生物质浓度，每种脂肪酸的 含量和脂肪酸的总体含量。
[0234] 除了脂肪酸的生物质（也称为活性生物质）是通过从总生物质减去这些脂肪酸计 算的。
[0235] 然后用产生的每种脂肪酸的量除以存在的除了 F.A的生物质的平均值并且除以时 间。获得的结果是每单位时间每g的除了 F.A的生物质的总体比生产速率。
[0236] 在下表VIII中给出了这些速率。
[0237] 表VIII:速率的计算
L〇239」 买例2:用控制的氧供应培弄株糸CNCM 1-4469和CNCM 1-4702 [0240]使用相同的培养条件，但是控制氧供应。
[0241 ]该方法在于在10 %下的培养期间，使用一半的观察到的转移值（OUR)(在此： 50mmol/l/h，参见图 1，即25mml/l/h)(图2)。
[0242] 此外，对于201发酵罐，不管氧合作用要求为了考虑发酵罐的适当操作，在to时固 定约150rpm的最小搅拌，持续培养的前10至15小时。
[0243] 在表1X中，给出的结果是在两种株系CNCM 1-4469和CNCMI-4702在控制的O2供应 条件下的生物质的培养的T65时获得的那些结果。
[0244] 表1X:生物质和脂肪酸组成
[0246] 如实例1中所示的，全局地计算平均速率。在表X中给出结果。 1 表X:速率的计算
[0249] 比较在氧过量条件下(来自表VIII的值)和在控制的氧条件下的全局比生产速率， 观察到：
[0250] -氧供应使得有可能降低棕榈酸的生产速率，
[0251] -对于株系CNCM 1-4469,棕榈酸的生产速率已经降低了9倍，并且对于株系CNCM 1-4702,降低了 3倍。
[0252] 即使生物质或DHA生产速率保持不变，仍获得了这种结果。
[0253] 因此，防止了在代谢过量的背景下的脂质生产。
[0254] 用这种方法评估的速率用作用于计算目标q02的基础。
[0255] 用等式1和2计算q02
[0256] 表X中的脂质生产速率在此代表DHA是主要成分但是还包含少量的棕榈酸的基础 脂质（等式1和2中的q基的恒流。
[0257] 针对代谢过量的流对应于另外的流，在来自表VIII的速率和表X的那些速率之间。 [0258]在非胁迫培养条件下，qm是可忽略的;保持0.006g/g/h的值。
[0259]增长速率随着生物质浓度增加而下降；最大增长速率可以维持在4g的除了脂质的 生物质/K针对按5g/l接种的CNCM 1-4702)以及7g/l (针对按5g/l接种的CNCM 1-4469)。 [0260]通过将生物质浓度考虑在内，q02(在细胞水平下的消耗）可以按比例扩大至OTR (对应于在发酵罐水平下的供应）。
[0261] 对于株系CNCM I-4469,在
[0262] EQ 2：
[0263] q〇2_=〇.〇〇6x 1·07+(0·011+0·001+0·009)χ 0·17+0·08χ 0.8 = 0.106g/g/h
[0264] 它对应于：
[0265] 〇TR_=〇.l〇6x 7 = 0.74g的02/1 的培养物/小时
[0266] 或者
[0267] 0TR_=0.106x 7x 1000/32 = 23mmol的02/1 的培养物/h
[0268] 对于株系 CNCM 1-4702,在
[0269] EQ 2：
[0270] q〇2gtg=0.006x 1.07+(0.02+0.018+0,07)x 0.17+0.17x 0.8 = 0.218g/g/h
[0271] 它对应于：
[0272] 〇TR_=〇.218x 4 = 0.87(g的02/l的培养物/小时）
[0273] 0TR_=0.218x 4x 1000/32 = 27.4mmol的02/1 的培养物/h
[0274] 将来自表X的数据用于这些等式使得有可能模拟培养并且确定要施加的0TR_。
[0275] 后者随着增长速率降低而降低，但是这部分地通过生物质浓度增加进行补偿。 [0276]因此，OTRad呆持接近以上给出的0TR_，直至除了脂质的生
[0277]物质的增长速率达到零。
[0278]实例3:使用不同OTR条件的发酵操作
[0279]在不限制营养源的情况下在实例1和2中进行的这些测试使得有可能产生以下模 型，借助该模型使得有可能通过考虑由等式2限定的目标q〇2来控制脂质生产（目标q〇2等于 27.4mmol的02/1的培养物/h:参见实例2)。
[0280]从这一初始目标q02，测试了变化。
[0281]在此通过在培养开始时的最大OTR说明了在这一目标q02任一侧上的变化程度。 [0282]在25和30之间的最大OTR值对应于在本发明的背景内限定的、用于控制氧供应并 且为了考虑目标q〇2的培养开始时的最佳0UR。
[0283] 表XI给出了在T65时测量的CNCM 1-4702的发酵参数。
[0284] 表XI
[0286] 因此，在这些结果的基础上，可以观察到，当相对于由等式2限定的值过量供应氧 时，观察到DHA在过量脂质，尤其是棕榈酸中的稀释。
[0287] 正相反，当相对于由等式2限定的值氧供应是次优时，产生的DHA的量较小。
[0288] 实例4:限制和不限制氮缺乏的比较实例。
[0289] 用以下进行测试：
[0290] -作为对照：株系CNCM 1-4702,在由专利申请WO 01/54510组成的现有技术限定的 条件下培养，也就是说，分开生长阶段与生产阶段，在限制氮供应的步骤期间诱导后者。在 此通过在培养的前三分之一结束时用氨水中断PH调节来诱导这种限制。
[0291] 为了仅考虑在氮缺乏条件下株系CNCM 1-4702关于其脂质产生的行为，不以级联 的方式调节曝气，而是维持在大于10 %的P〇2下。
[0292] -发酵，其中贯穿整个培养持续时间，株系未经历任何营养限制，并且还调节P02至 10%〇
[0293] 结果如下：
[0294] 表 XII
[0296] 在没有营养限制的情况下生物质的脂肪酸丰度仅非常轻微地下降。与本领域的技 术先见相反，因此，对于诱导脂质生产，限制氮源不是必需的。
[0297] 实例5:用株系ATCC 20888的比较实例。
[0298] 在专利申请WO 01/54510的实例4中描述了培养实验方案。使用的株系是裂殖壶菌 属ATCC 20888。
[0299] 按照所述申请的教授内容，进行以下两个程序的比较：
[0300] 1.大于10%的固定调节
[0301] 2.0% 的恒定 p〇2。
[0302] 在下表XIII中给出了获得的结果。
[0303] 表XIII
[0305] 通过按照现有技术的教授内容，尤其是专利申请WO 01/54510的那些教授内容，因 此发现，与披露的内容相反，PO2至0%或多于10%的恒定调节持续发酵的整个持续时间使 得有可能产生脂肪酸中多于35%的PUFA，正与用p02的级联下降（10%，然后是4%，然后是 0.5%的饱和)进行的管理操作的情况相同。
【主权项】
1. 一种用于生产富含二十二碳六稀酸(DHA)的破囊壶菌属(Thraustochytrium)的微藻 的生物质的方法，其特征在于，在异养条件下的培养阶段期间，控制氧的供应，以便仅满足 以下需氧量:1)细胞维持所必需的能量生产，2)基础脂质生产，以及3)除了脂肪酸的生物质 的增长。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过以下等式2计算仅满足要求1)、2)和3)所 必需的氧供应其中 q〇2目标是按克/克的除了脂肪酸的生物质/小时计的氧量； qm是被表示为g的葡萄糖/克的除了脂肪酸的生物质/小时的维持系数； 是被表不为g的基础脂质/ g的除了脂肪酸的生物质/小时的基础脂质积累率； 是被表示为g的氧/g的脂质的相对于脂质形成的氧消耗系数； μ是被表示为g的除了脂肪酸形成的生物质/g的除了脂肪酸的生物质/小时或(1Γ1)的增 长速率； y132八是被表示为g的氧/g的除了脂肪酸的生物质的相对于除了脂肪酸的生物质形成的 氧消耗系数。3. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于在该发酵方法期间，不限制营养 元素，尤其是碳源或氮源。4. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于生长阶段和DHA生产阶段是相伴 的。5. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于这些微藻属于裂殖壶菌属 (Schizochytrium sp.)或是红树林裂殖壶菌（Schizochytrium mangrovei)。6. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于这些微藻是选自株系CNCM I-4469和CNCM 1-4702的株系，其分别在2011年4月14日和2012年11月22日存放在巴斯德研究 所的法国微生物培养物国家保藏中心。7. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于它还包括收获该生物质，任选地 从这种生物质制备细胞提取物或裂解物，然后任选地提取富含DHA的粗制油。8. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于获得的生物质包括按总脂肪酸的 重量计至少40 %的DHA。9. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于获得的生物质包括按总脂肪酸的 重量计至多40 %的棕榈酸。10. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于获得的生物质包括按生物质的 干重计至少25%的脂肪酸。
【文档编号】C12P7/64GK105829540SQ201480068877
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2014年12月18日
【发明人】伯纳德·考利尔
【申请人】罗盖特兄弟公司