包括二氧化碳脱除工艺的发酵生产戊二胺的方法

包括二氧化碳脱除工艺的发酵生产戊二胺的方法
【专利摘要】本发明属于生物发酵工程领域，其提供了发酵制备戊二胺的方法，其包括，培养表达赖氨酸脱羧酶的细胞，获得包含戊二胺的全细胞发酵液；和，提取步骤（1）获得的全细胞发酵液中的戊二胺，其中在向全细胞发酵液中加入强碱之前脱除其中的二氧化碳。本发明的方法可以大幅提高戊二胺的产量。
【专利说明】
包括二氧化碳脱除工艺的发酵生产戊二胺的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物发酵工程领域，具体而言，本发明设及生物催化法生产1，5-戊二 胺及其分离提取技术，即二氧化碳脱除法分离提取全细胞催化液中的戊二胺的技术。
[0002]
【背景技术】
[0003] 1, 5-戊二胺（1,5-Pentanediamine)，又名尸胺（Cadaverine)J, 5-二氨基戊烧 (1，5- Diaminopen化ne)，与二元酸可聚合成高分子聚酷胺材料（即尼龙）。全球每年生产 约700万吨聚酷胺材料，消耗大量石化资源，因此生物法合成聚酷胺的重要组成单体一1， 5-戊二胺具有重要的经济学和生态学意义。
[0004] 全细胞催化法W赖氨酸为底物，利用菌体细胞中的赖氨酸脱簇酶催化产生戊二 胺。目前，赖氨酸作为大宗氨基酸品种之一，其产能严重过剩，利润率极低。因此，开发高效 的W赖氨酸为底物的戊二胺生物催化的生产方法，不但可W开发新型生物基材料市场，还 可W推进氨基酸发酵产业的转型升级。
[0005] 关于从发酵液/全细胞催化液中分离提取戊二胺的现有技术，可W列举W下的报 道。专利US7189543B2公布了直接从催化液中制备戊二胺己二酸盐晶体的方法。使用己二酸 中和全细胞催化过程中产生的戊二胺，获得抑为6.0的戊二胺己二酸盐溶液;去除戊二胺催 化液中的细胞，活性炭脱色后浓缩至盐含量为70-77%，降溫得到戊二胺己二酸盐晶体，用于 尼龙聚合。专利（US2010/0292429A1，CN101981202A和EP1482055A1)和文献（Metabolic 化gineering，2014, 25:113-123)公开了应用下醇萃取法从发酵液中分离提取戊二胺。在 戊二胺发酵液中加入氨氧化钢，高溫回流裂解发酵液中的副产物后，使用下醇多次萃取获 得含有戊二胺的有机相，蒸出有机相中的低沸点溶剂得到高沸点的戊二胺，进一步精馈获 得高纯度的戊二胺。
[0006] 目前公开的戊二胺分离提取的现有技术中，析晶法得到戊二胺簇酸盐的收率低， 并且残存赖氨酸等杂质，难W进一步精制，所得到的戊二胺簇酸盐用作聚酷胺树脂膜材料 时产生鱼眼等表面外观缺陷，并影响注射成型的流动性(CN101578256A)。萃取法得到戊二 胺的收率较低;有机溶剂残留降低了戊二胺产品的纯度;有机溶剂气味大、毒性高、易燃易 爆，增加了实际应用的操作难度;有机溶剂需要回收，增加了工艺流程和能耗。

【发明内容】

[0007] 发明简述 本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵制备1，5-戊二胺的方法，其能提高1，5-戊二胺，和/或能减少强碱用量并降低盐渣生成量，从而降低戊二胺生产的综合成本。具体 而言，本发明的方法包括： (1) 培养表达赖氨酸脱簇酶的细胞，获得包含1，5-戊二胺的发酵液;和 (2) 提取步骤（1)获得的发酵液中的1，5-戊二胺，其中在向发酵液中加入强碱之前脱 除其中的二氧化碳。
[0008] 优选在本发明的方法的步骤（1)中，所述细胞是过表达赖氨酸脱簇酶的细胞，优选 是赖氨酸脱簇酶基因表达增强(如，通过替换赖氨酸脱簇酶基因的启动子为强启动子(如， T7启动子)而表达增强）的细胞。
[0009] 也优选在本发明的方法的步骤（1)中，所述细胞是细菌细胞，优选是大肠杆菌细 胞，如大肠杆菌化21 (DE3)。
[0010] 还优选在本发明的方法的步骤(1)中，所述培养中不补加酸性抑调节剂，而且所述 细胞自身会产生COsW中和1，5-戊二胺。
[0011] 另外优选在本发明的方法的步骤（1)中，所述细菌W赖氨酸为底物，通过赖氨酸脱 簇酶催化而产生1，5-戊二胺。
[0012] 优选在本发明的方法中，步骤(2)包括： (21) 分离(如，离屯、或过滤）出发酵液中的液体； (22) 脱除步骤(21)获得的液体中的二氧化碳，然后加入碱处理;和 (23) 从步骤(22)获得的处理液中提取出含1，5-戊二胺的成分(如，馈分）。
[0013] 更优选在本发明的方法的步骤(22)中，通过减压和/或升溫分离出液体中的二氧 化碳来脱除液体中的二氧化碳。
[0014] 也更优选在本发明的方法的步骤(22)中，碱包括氨氧化钢、氨氧化钟和/或氨氧化 巧。
[0015] 还更优选在本发明的方法的步骤(23)中，所述提取包括蒸馈(如，常压蒸馈、减压 蒸馈和/或精馈）、蒸发(如，闪蒸)和/或干燥(如，喷雾干燥和/或减压干燥）。
[0016] 优选在本发明的方法中，1，5-戊二胺的产量大于30g/L所述发酵液，优选大于50 g/L所述发酵液，更优选大于80 g/L所述发酵液，更加优选大于100 g/L所述发酵液，最优选 大于120 g/L所述发酵液。
[0017] 发明详述 本发明人前期建立了利用副产物二氧化碳自控抑的全细胞催化戊二胺的生产工艺，理 论上，催化反应液中含有等摩尔的戊二胺和二氧化碳(碳酸根离子）。
[0018] 本发明人进一步研究发现，通过减压和升溫处理可W脱除全细胞催化液中赖氨酸 脱簇生成戊二胺时产生的二氧化碳，使催化液的pH升高;进一步使用强碱调节催化液达到 相同的碱性条件时，脱除二氧化碳后碱用量明显降低，后续戊二胺的蒸馈收率明显提高。在 此基础上，建立了从戊二胺盐离子催化液中分离提取戊二胺的方法，完成了本发明。
[0019] 本发明提供的从全细胞催化液中分离提取戊二胺的方法包括如下步骤： (1) 去除戊二胺催化液中的菌体细胞，得到催化液清液； (2) 脱除该清液中部分二氧化碳； (3) 在脱除二氧化碳的清液中加入强碱； (4) 蒸出并收集得到戊二胺。
[0020] 采用固液分离的化工原理方法去除催化液中菌体细胞，收集清液。去除催化液中 细胞的具体方法包括絮凝、沉降、离屯、或过滤等。
[0021] 由于二氧化碳为酸性气体，碱性的戊二胺可W作为二氧化碳的化学吸收剂，可逆 反应生成可溶于水的盐。溫度变化对该可逆反应的影响很大，低溫有利于反应向生成弱酸 弱碱盐的方向进行，而高溫可使弱酸弱碱盐发生分解，释放二氧化碳。本发明人进一步发 现，降低气压同样有利于二氧化碳从戊二胺溶液中脱除。同时进行减压和升溫，可快速的脱 除戊二胺催化液中的二氧化碳。其中二氧化碳分解溫度介于40°C~200°C;蒸馈压力（绝对 压力)介于〇.24?曰~11001^^之间。
[0022] 需要指出的是，虽然提高溫度可W提高二氧化碳的脱除效率，但是同时导致戊二 胺挥发，产物损失率提高。本发明人在实验过程中发现，在蒸馈压力介于20~200k化之间， 加热溫度超过12(TC时，挥发的戊二胺与二氧化碳气体在设备管道表面凝结成乳白色戊二 胺碳酸盐。运不仅会导致戊二胺收率降低，戊二胺生产成本增加，而且还会导致设备管道阻 塞，增加了生产应用的操作难度。考虑到实际生产应用的成本和可操作性，脱除二氧化碳的 加热溫度优选为60-120°C，戊二胺催化液中的二氧化碳的脱除率为30%~80%，戊二胺损失 率为 0.01 %~10.00〇/〇。
[0023] 在脱除二氧化碳的戊二胺催化液中加入强碱，置换出游离的戊二胺。其中强碱包 括氨氧化钢、氨氧化钟或氨氧化巧等。强碱的加入量与催化液中戊二胺含量的摩尔比值为 0.1 ~5.0:1，优选为 0.5 ~3.0:1。
[0024] 戊二胺催化液加入强碱后，可W通过常压蒸馈、减压蒸馈、精馈、闪蒸、喷雾干燥或 减压干燥等方法，收集挥发的戊二胺。其中蒸馈溫度介于4(TC~20(TC;蒸馈压力（绝对压 力）介于0.化化~1100.0 k化之间。
[0025] 本发明还提供了回收利用催化液中逸出的二氧化碳的方法。由于戊二胺催化液中 不含其它酸性气体，因此回收得到的二氧化碳通过加压液化即可得到高纯度二氧化碳;收 集得到的二氧化碳与氨气混合，升溫增压反应可W生产尿素;二氧化碳与碱(如氨水、氨氧 化钢、氨氧化钟、氨氧化巧、氨氧化儀、碳酸钢、碳酸钟、碳酸锭等）中和，生成碳酸锭/碳酸氨 锭、碳酸钢/碳酸氨钢、碳酸钟/碳酸氨钟、碳酸巧、碳酸儀、碳酸氨钢、碳酸氨钟、碳酸氨锭 等。
[0026] 本发明所述的戊二胺全细胞催化液是通过利用副产物C〇2自控抑的方法全细胞催 化生产戊二胺结束时得到的催化液。其中利用副产物C〇2自控抑具体为在全细胞催化的过 程中不向催化液补加酸性pH调节剂且不通入任何气体，利用赖氨酸脱簇酶促反应所产生的 酸性C〇2中和碱性产物戊二胺。
[0027] 上述利用副产物C〇2调控抑的全细胞催化生产戊二胺的方法，副产物C〇2是指赖氨 酸在赖氨酸脱簇酶的催化作用下产生戊二胺并同时产生的C〇2。
[0028] 本发明中，酸性二氧化碳和碱性戊二胺在水溶液中容易形成戊二胺碳酸盐。伴随 着溶液中底物赖氨酸的催化消耗和戊二胺碳酸盐的生成，催化液的抑缓慢升高直至稳定。 底物赖氨酸盐的浓度可W为20-500g/L，稳定时催化液pH不超过8.5，一般不超过8.0。
[0029] 本发明中用于催化生产戊二胺的细胞是指过表达赖氨酸脱簇酶基因的细菌。
[0030] 其中赖氨酸脱簇酶为将赖氨酸转化为1,5-戊二胺的酶，没有特别限制，可举出例 如来自大肠杆菌巧scherichia coli)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆 菌（Corynebacterium glutami州m)、嗜碱芽抱杆菌（Bacillus halodurans)、反当月形单胞 菌（Selenomonas ruminantium)、蜂房哈夫尼菌化afnia alvei)、霍乱弧菌（Vibrio cholerae)、天蓝色链霉菌（Streptomyce S coelicolor)、毛链霉菌（Streptomyces pilosus)、嗜氨基酸真杆菌化ubacterium acidaminophilum)、鼠伤寒沙口氏菌 (Salmonella typhimurium)或深海热球菌(Pyrococcus abyssi)等微生物的酶。优选来自 大肠杆菌的酶。
[0031] 本发明用于全细胞催化生产戊二胺的工程菌是过表达赖氨酸脱簇酶基因的细菌。 所述细菌优选为大肠杆菌，更有选为大肠杆菌B株或其衍生菌株。所述过表达是指提高赖氨 酸脱簇酶在细胞内的量，具体方法可W是增加所述赖氨酸脱簇酶基因的拷贝数，例如使用 多拷贝表达质粒携带赖氨酸脱簇酶基因全部或部分核巧酸序列，或是在染色体中插入多拷 贝赖氨酸脱簇酶基因全部或部分核巧酸序列;过表达的方法也可W是应用高效的仅表达元 件调控基因的表达水平，所述元件可W是强启动子，增强子或RBS等;过表达的方法也可W 是改造基因的编码序列，如密码子优化，提高赖氨酸脱簇酶的翻译效率。
[0032] 用于全细胞催化生产戊二胺的工程菌还可W是在过表达赖氨酸脱簇酶基因的基 础上进一步适量表达赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因 Ca地。所述适量表达赖氨酸-戊二胺 逆向转运蛋白基因 Ca地是指将包含或不包含RBS序列的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因 的全部或部分核巧酸序列置于外源表达质粒中的赖氨酸脱簇酶基因的核巧酸序列之后进 行表达;或使用适用于大肠杆菌的能解除CadB转录阻遏的启动子替换大肠杆菌B株或其衍 生菌株染色体上的赖氨酸-戊二胺逆向转运蛋白基因自身的启动子;所述适用于大肠杆菌 的能解除Ca地转录阻遏的启动子具体为L启动子、trc启动子、T日启动子、Iac启动子、tac启 动子或T?启动子。
[0033] -种制备1，5-戊二胺的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤:将上述任 一所述的工程菌在LB液体培养基中培养，得到种子液;将种子液接入丰富培养基中，发酵培 养;加入诱导剂诱导表达，再加入底物赖氨酸和憐酸化唉醒开始全细胞催化，即得； 所述诱导剂具体为IPTG或乳糖； 所述底物赖氨酸具体为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵 液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸、赖氨 酸盐干粉或其溶液； 所述丰富培养基中含有lOg/L酵母提取物，20 g/L膜蛋白腺，0.9g/L KsHP化-3出0， 1.14 g/LK出P〇4, lOg/L (NH4)2S04，0.3g/L MgS〇4.7此0，5 mL/L微量元素储液，50mg/L 卡那霉素，余量为水； 所述微量元素储液含有6g/L FeS〇4*7此0，1.35g/L CaCl2，0.8g/L ZnS〇4*7此0， 1.5g/L MnS〇4.4出0，0.15g/L CuS〇4.5出0，0.2g/L (畑4 )6M〇7〇24.4出0,0.1g/L 出B03, 0.25g/L CoCl2*6出0和10血/L浓盐酸，余量为水。
[0034] 所述种子液的ODs日日为2-25，优选为3-5; 所述种子液接入丰富培养基的比例为0.5-30.0%，具体为5%; 所述发酵培养的溫度为25 °C-45 °C，具体为37。。 所述发酵培养的DO在50%W上； 所述发酵培养的pH为4.0-9.0; 所述IPTG的终浓度为0.01-10.0 OmM,优选为0.05-0.40mM; 所述IPTG加入的时间为发酵培养后2-lOh，优选为2-化； 所述赖氨酸盐包括k赖氨酸盐酸盐或赖氨酸硫酸盐； 所述加入底物赖氨酸和憐酸化唉醒开始全细胞催化的时间为诱导开始后的0.5-lOh， 优选为1-化； 所述催化还包括如下步骤:溫度控制在25-60 °C，揽拌转速为0-1200rpm; 所述催化过程中，所述溫度具体为30 -50?; 所述催化过程中，所述揽拌转速具体为200-1000rpm。
[0035] -种制备1，5-戊二胺的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤:将权利要 求所述的工程菌在LB液体培养基中培养，得到种子液;将种子液接入无机盐培养基，发酵培 养;加入诱导剂诱导表达，再加入底物赖氨酸和憐酸化唉醒开始全细胞催化，即得； 所述诱导剂为IPTG或乳糖； 所述底物赖氨酸为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发酵液、去 除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸W及赖氨酸 盐干粉或其溶液； 所述无机盐培养基含有2g/L (畑4)2册〇4, 4g/L K此P〇4，0.85g/L巧樣酸，0.7 g/L MgS〇4.7H2〇，10mg/L FeS〇4*7H2〇, 2.25mg/L ZnS〇4*7H2〇, 0.2mg/L CuS〇4*5H2〇, 0.5mg/L MnS〇4*5H2〇, 0.23mg/L NaB4〇7*10出0，2.0mg/L CaCl2*2H2〇, 0.1 mg/L NH4M〇7〇24,0.15 mg/L CoCb ? 6出0,余量为水。
[0036] 上述方法中，所述LB液体培养基中卡那霉素的浓度为5-200mg/L，具体为50mg/l; 所述种子液的ODsqq为2-25，优选为3-5; 所述种子液接入无机盐培养基的比例为0.5-30.0%，具体为2.0%; 所述发酵培养的溫度为25 °C-45 °C，具体为37。。 所述发酵培养的DO在50%W上； 所述发酵培养时葡萄糖的浓度维持在5g/LW下，具体是通过流加补料液实现的，所述 补料液含有7〇〇g/L葡萄糖和20g/L MgS〇4 ? 7出0,余量为水； 所述IPTG的终浓度为0.01-10.0 OmM,优选为0.05-0.40mM; 所述IPTG加入的时间为发酵培养后3-20h，具体为4-12h; 所述赖氨酸盐包括k赖氨酸盐酸盐或赖氨酸硫酸盐； 所述加入底物赖氨酸和憐酸化唉醒开始全细胞催化的时间为诱导开始后的0.5-24 h， 具体为1-5 h; 所述催化过程中，所述溫度具体为30-50 °。 所述揽拌转速具体为200-1000 rpm。
[0037] 所述底物赖氨酸具体为含有赖氨酸生产菌的赖氨酸发酵液、去除菌体的赖氨酸发 酵液、去除菌体并脱色的赖氨酸发酵液、赖氨酸发酵液的离子交换洗脱液、游离赖氨酸W及 赖氨酸盐干粉或其溶液，其中赖氨酸盐是赖氨酸和有机酸或无机酸的反应产物，可W例举 为赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐、赖氨酸碳酸盐、赖氨酸乙酸盐、赖氨酸己二酸盐、赖氨酸下 二酸盐或赖氨酸癸二酸盐等。
[0038] 本发明的有益效果在于： 首先，通过脱除戊二胺催化液中的二氧化碳，降低其中的碳酸(氨)根离子含量，减少了 戊二胺分离提取过程中置换戊二胺的强碱用量，相应地减少了戊二胺挥发后形成的盐渣 量，从而降低了戊二胺生产的辅料成本和废渣处理成本； 其次，二氧化碳的脱除可避免因戊二胺蒸馈过程中碱用量不足造成的二氧化碳与气态 的戊二胺中和后凝结在加热容器出口或管道，导致管道堵塞和收率降低等问题； 再次，通过合理控制二氧化碳脱除条件，避免戊二胺在脱除二氧化碳的过程中大量蒸 出，导致产品收率降低、生产成本提高； 最后，本发明提供了赖氨酸脱簇副产物二氧化碳的捕集及利用方法，不但可W减少溫 室气体的排放，还可W产生额外的经济效益。
[0039] 综上所述，本发明技术在实践上适用于1，5-戊二胺的工业化生产，具有很高的实 用性和应用性。
[0040] 为了便于理解，W下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要 特别指出的是，运些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明 书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
[0041] 另外，本发明引用了公开文献，运些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文 内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
[0042]
【附图说明】
[0043] 图 1 pET28a-cadA 质粒图谱。
[0044] 图2全细胞催化生产戊二胺的过程曲线 图3碱液回收二氧化碳过程的pH变化曲线 图4二氧化碳脱除过程曲线
【具体实施方式】
[0045] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] 实施例1 HPLC法检测赖氨酸和戊二胺 取ImL全细胞催化液，SOOOg离屯、5min，收集上清液检测赖氨酸含量;取10化上清液于 2血离屯、管中，加入20化L 0.5mol/L化肥化水溶液和10化L 1%(体积比）二硝基氣苯乙腊溶 液，于60°C水浴中暗处恒溫加热60min，然后冷却至室溫，加入70化L 0.04mol/L K出?化水溶 液(pH=7.2 ±0.05，用40g/L KOH水溶液调整抑)释并摇匀，放置15min过滤后可进样，进样量 为1如1^; 所用色谱柱为C18柱（Z0RBAX Eclipse XDB-C18,4.6*150mm，Agilent，USA);柱溫:40 °C ;紫外检测波长:360nm;流动相A为0.04mol/L K出P〇4水溶液(pH=7.2±0.05，用40g/100mL KOH水溶液调整pH)，流动相B为55%(体积比）乙腊水溶液，流动相总流量为ImL/min，洗脱过 程如下： 洗脱起始时刻(Omin)流动相A占流动相总流量的体积份数为86%、流动相B占流动相总 流量的体积份数为14%;洗脱过程分为5个阶段，每个阶段中流动相A和流动相D占流动相总 流量的体积份数均为线性变化;第1阶段(从起始时刻开始共进行2min)结束时流动相A占流 动相总流量的体积份数为88%、流动相B占流动相总流量的体积份数为12%，第2阶段(从第1 阶段结束时刻开始共进行2min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为86%、流动相B 占流动相总流量的体积份数为14%，第3阶段(从第2阶段结束时刻开始共进行6min)结束时 流动相A占流动相总流量的体积份数为70%、流动相B占流动相总流量的体积份数为30%，第4 阶段(从第3阶段结束时刻开始共进行IOmin)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为 30%、流动相B占流动相总流量的体积份数为70%。W市售k赖氨酸标准品制作标准曲线，计 算样品的赖氨酸浓度。
[0047]检测戊二胺时，取1化L样品上清液加入含有10化L 4.2g/100mL的碳酸氨钢水溶液 的2mL离屯、管，混匀后加入20化L含有体积百分含量为1%的2,4-二硝基氣苯的乙腊溶液，混 匀;60 °C衍生反应60分钟(严格计时，30分钟取出轻微震荡混匀继续衍生反应）。取出避光降 溫至室溫，加入160化L乙腊，縱满震荡混匀30秒，有机系滤膜过滤后取15yL进样。
[004引流动相A为抑7.2的5.4 g/L憐酸二氨钟水溶液，流动相B为体积百分含量80%的乙 腊水溶液，将A和B按照体积比5:95的比例，1 mL/min的流速累入流动相，所用色谱柱为C18 柱（Z0RBAX Eclipse XDB-C18,4.6*150mm，Agilent,USA);柱溫：35°C;检测波长：360nm。
[0049] W I，5-戊二胺盐酸盐(购自sigma公司）为标准品，I，5-戊二胺盐酸盐的浓度在1-5 g/L之间线性关系良好。W标准品的浓度为横坐标，标准品积分峰面积为纵坐标，制作标 准曲线。
[0050] W下实施例中的1，5-戊二胺浓度均由标准曲线公式计算得到的1,5-戊二胺盐酸 盐的测定值换算成1，5-戊二胺浓度值。
[0化1 ] 实施例2全细胞催化生产戊二胺工程菌的构建 (一)赖氨酸脱簇酶基因 CadA过表达质粒的构建 在pET28a( + )表达载体的T7启动子和RBS之后插入优化的赖氨酸脱簇酶基因 CadA的 0RF。W优化设计的序列设计引物，W野生型大肠杆菌K12 W3110菌株的基因组DNA为模板， 使用高保真聚合酶KAPA化Fi?化tStar，WP巧日P2为引物，PCR扩增CadA基因，该基因的核 巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。PCR程序为：98°C变性30秒，65°C退火15秒，72°C延伸150 秒，26个循环，通过引物Pl引入突变位点，从而获得改造的赖氨酸脱簇酶基因 cadA*的片段。 [005。 Pl:5-CATGCCATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCATATGGGAGT (下划线所示序列为化O I酶切识别位点） P2:5 '-ACGCGTCGACCTCCTTATGAGCAAAAAAGGGAAGTG-3， (下划线所示序列为Sal I酶切识别位点） 切胶回收上述PCR电泳条带，使用限制性内切酶Nco I和Sal I双酶切赖氨酸脱簇酶基 因 cadA*的DNA片段和祀T28a( + )质粒，得到酶切后的赖氨酸脱簇酶基因 cadA*基因片段和 载体大片段;将酶切后的赖氨酸脱簇酶基因 cadA*基因片段与载体大片段连接，转化至大肠 杆菌EC135(Zhang et al, Plos Genetics，2012,8(9): e100 2987)的感受态细胞，在含有 50 mg/L卡那霉素的LB平板上筛选，获得含有重组质粒的转化子，提取质粒并将其送测序， 将结果正确的质粒命名为祀T28a-cadA*质粒示意图见图1。
[0化3](二)染色体Ca地基因启动子的替换 W大肠杆菌BL2UDE3)菌株基因组DNA为模板，W引物P3和P4、P5和P6分别进行PCR扩 增，获得长度分别为510bp和610bp的两条DNA片段，分别如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所 示。其中，T7启动子序列和Iac调控序列由引物P4和P5引入。PCR按如下方式进行:94°C变性 30 s，52°C退火30 s，W及72 °C延伸30 s(30个循环）。其中，引物序列如下： P3:5 '-CGCGGATCCTGCGCCATTCTCAACATCCTT-3' (下划线所示序列为BamHI酶切识别位点） P4:5 '-TCCGCTCACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTATGCCGCA ACATATT ATACCAACAG-3 ' P5:5 '-ACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCGAAATTAG GAGAAGAGCATGAG-3， P6:5 '-ATTGCGGCCGC TCCGCAGTATTCCAGTTAGCT-3， (下划线所示序列为Not I酶切识别位点） 将SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的DNA分子的混合物为模板，WP3和P6为引物，通过 Overlap PCR扩增到长约1.化b的Overlap片段，如SEQ ID No.4所示。其中PCR程序为：94 DC 变性30秒，52 °C退火30秒，72 °C延伸60秒，26个循环。
[0054] SEQ ID No. 4中自5'末端起第477位至第495位核巧酸所示的序列为T?启动子序 列，SEQ ID No.4中自5'末端起第496位至第520位核巧酸所示的序列为Iac调控序列。
[0055] Bam H巧日Not I双酶切沈Q ID No.3所示的DNA分子，得到基因片段；Bam H巧日Not I双酶切地OV质粒，得到载体大片段;将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命 名为地0V-PT7-ca地，并其送测序，验证其含有正确T?启动子和Iac调控基因序列，保存备用。 [0化6] 将构建好的地0V-PT7-ca地质粒电转化入大肠杆菌化21 (DE3)菌株，于30 °C、150 巧m，在LB培养基中复苏2 h后，根据Addgene公司的地OV质粒的商品指南，挑选出同源重组 阳性的单克隆，经测序确认其染色体上的Ca地基因的自身启动子被替换为T7启动子，将该 菌株命名为E. coli BL21 PcadB:: Pt7。
[0化7] (S)戊二胺工程菌的构建 将质粒祀T28a-cadA*转化至E. COli BL21 PcadB:: Pt7的感受态细胞，在含有50 mg/L 卡那霉素的LB平板上筛选，获得工程菌E. coli BL21 PcadB:: PT7/pET28a-cadA*，用于1， 5-戊二胺全细胞催化。
[0化引 实施例3菌体培养和戊二胺催化生产工艺 刮取工程菌E. COli BL21 (DE3) PcadB:: Pt?/ 祀T28a-cadA*菌苔接入含有50 ml LB (含50 mg/L卡那霉素巧-200 mg/L均可)培养基的500血S角瓶中，在37 °C 220 rpm摇床 中培养4 h，得到种子液，ODsoo为4-5;培养所得的种子液按2%的接种量接入含有2 L无机盐 培养基的10 L发酵罐中，培养溫度为37 °C，DO控制在30%W上，罐压控制在0.02-0.1 OM化。 通过流加补料液使培养液中葡萄糖的浓度维持在5 g/LW下。当培养液中菌体ODsoo达到30-40时加入0.1 mM诱导剂IPTG，化后菌体培养液ODsqq达到80左右，离屯、获得湿菌体。
[0059] 其中无机盐培养基成分和补料液成分如下：无机盐培养基：2 g/L (畑4)2册化，4 g/L K出P〇4, 0.85 g/L Citric acid(巧樣酸），0.7 g/L MgS〇4*7出0，10 mg/L FeS〇4* 7此0，2.25 mg/L ZnS〇4*7此0，0.2 mg/L CuS〇4*5此0，0.5 mg/L MnS〇4*5此0，0.23 mg/L 化B407 ? 10此0, 2.0 mg/L CaCb ? 2此0, 0.1 mg/L NH4M07O24,0.15 mg/L CoCb ? 6出0,余量为水。补料液包含700 g/L葡萄糖和20g/L MgS化-7出0,余量为水。
[0060] 配制含有300 g/L赖氨酸盐酸盐和0.2 mmol/L PLP的催化液体系，调控溫度至37。 CW后，发酵罐揽拌转速设置为500 rpm，加入20 g/L湿菌体(折合细胞干重4 g/L)开始全细 胞催化。不补加酸性物质调节抑，并且不通空气，利用副产物C〇2调节自调控催化体系的抑。 在催化开始的前20分钟，pH迅速上升至7.2左右，而在之后的几个小时抑缓慢升高至7.8(图 2)。每隔0.化从发酵罐中取出催化液，12000 X g离屯、5分钟，倒出上清液，按照实施例1的 赖氨酸和-戊二胺方法检测全细胞催化过程中1,5-戊二胺产量。如图2所示，赖氨酸消耗和 戊二胺生产过程变化趋势与pH类似，前0.5小时赖氨酸迅速消耗且戊二胺迅速积累，之后变 化过程缓慢。催化地的底物催化消耗率达到99.8%，赖氨酸盐酸盐残余量仅为0.67 g/L。 [0061] 实施例4减压蒸馈脱除戊二胺催化液中的二氧化碳 离屯、去除催化反应液中的菌体，取SOOmL离屯、后的戊二胺催化液，加入20L油浴旋转蒸 发仪的圆底烧瓶中，减压蒸馈脱除二氧化碳。二氧化碳解吸过程中循环水式真空累的真空 表读数达到-0.095 Mpa左右，水浴锅加热溫度分别设置为60 °C、70 °C、80°C、90 °C、100。 C、120 °C、140°C和160°C，考察不同溫度条件下的二氧化碳脱除情况。压力和溫度保持稳定 后减压蒸馈60 min,蒸馈结束后在圆底烧瓶中加入超纯水，并定容至初始体积，测定蒸馈前 后的戊二胺催化液中的二氧化碳含量。使用总有机碳总氮分析仪(Vario T0C)检测催化液 总无机碳(TIC)含量，计算催化反应液的二氧化碳脱出率。计算公式为：二氧化碳脱除率= (减压蒸馈前戊二胺催化液中TIC含量-减压整流后戊二胺催化液中TIC含量）-减压蒸馈前 戊二胺催化液中TIC含量X 100%。实验结果表明，戊二胺催化液中二氧化碳脱出率随着加热 溫度升高而提高(表1)。 roowi 要1 末同)成店嚴俯泪駐义化了巧^肪偶从、谅的^每从S担脱除态
二氧化碳脱除的巧程中，戊二胺也会随之挥发。在上述不同溫度条件下的减压蒸觸巧 程中，将冷却循环水溫度设置为20 °c，收集冷凝后的馈分，检测其中的戊二胺含量，计算二 氧化碳脱除过程中的戊二胺的损失率。计算方法为:戊二胺损失率=(馈分戊二胺含量X馈 分体积）-(蒸馈前催化液的戊二胺含量X加入圆底烧瓶中的催化液体积）X 100%，结果如 表2所示:戊二胺的损失率随着蒸馈溫度的升高而提高，当加热溫度设置为60 %时，戊二胺 损失率低于0.1%;而加热溫度升高至160%时，戊二胺损失率达到8%w上。加热溫度溫度大 于等12(TC时，大量的戊二胺挥发逃逸，与二氧化碳气体在溫度较低的设备管道表面凝结成 乳白色的戊二胺碳酸盐，不仅容易堵塞管道，而且增加了设备清洗难度。 r00631 棄9末同)成圧泉饱潟睛义化下巧^肤腊生燕
买砸例5顺徽凹收脈除的二'氧化恢
离屯、去除催化反应液中的菌体，取500血离屯、后的戊二胺催化液，加入化旋转蒸发仪的 圆底烧瓶中，减压蒸馈脱除二氧化碳。蒸馈过程中循环水式真空累的真空表读数为-0.095 Mpa左右，水浴锅加热溫度分别设置为40%、50%、60%和70%，考察不同溫度条件下的二氧 化碳解析情况。循环水式真空累水槽中加入IOL含量为6g/L的氨氧化钢溶液，用于吸收戊二 胺催化液中解吸的二氧化碳。将pH电极插入水槽中，实时记录循环水式真空累水槽碱液的 pH值。随着脱除的二氧化碳在碱液中化学吸收，水槽碱液的抑逐渐降低。加热溫度越高，水 槽碱液的抑降低越快(图3)。
[0064]使用总有机碳总氮分析仪(型号Vario T0C)检测循环水式真空累水槽碱液中的总 无机碳(TIC)含量，计算碱液吸收二氧化碳的吸收量。加热溫度设置为50 °C减压蒸馈时的碱 液吸收的二氧化碳过程曲线如图4所示，循环水式真空累水槽碱液中TIC含量逐渐升高。
[00 化] 实施例6二氧化碳脱除减少置换游离戊二胺所需的强碱消耗量 按照实施例5的溫度和压力条件脱除二氧化碳90分钟，倒出圆底烧瓶中脱除二氧化碳 后的戊二胺催化液，加入超纯水稀释至化，测定稀释后催化液的pH值。水浴锅加热溫度分别 设置为40 °C、50 °C、60 °C和70 °C脱除二氧化碳后，催化液的pH由7.66分别上升至8.45、9.63、 9.75和9.90。进一步使用氨氧化钢调节稀释至等体积的戊二胺催化液的pH，将100 mL脱除 二氧化碳后的催化液的抑调节至11、12和13，分别需要消耗42111^721111^和1061111的氨氧化钢 溶液（lOOg/L);而稀释相同戊二胺含量的脱除二氧化碳之前的催化液则分别消耗97mU HlmL和185mL氨氧化钢溶液。结果表明，在强碱置换出游离戊二胺的工序，脱除催化液中的 二氧化碳可明显降低强碱用量，蒸馈戊二胺后形成的固体废渣更少。
[0066] 实施例7二氧化碳脱除提高戊二胺蒸馈收率 离屯、去除催化反应液中的菌体，取SOOmL离屯、后的戊二胺催化液，加入20L旋转蒸发仪 的圆底烧瓶中，油浴加热溫度设置为70 °C减压蒸馈脱除二氧化碳。90分钟后加入等摩尔量 的氨氧化钢，将油浴溫度设置为120 °C，继续减压蒸馈120min，收集戊二胺馈分。对照试验不 脱除二氧化碳，按照相同的条件直接蒸馈加入等摩尔量氨氧化钢的戊二胺催化液，收集戊 二胺馈分。脱除二氧化碳后再蒸馈强碱置换的戊二胺催化液，可得到62. ：3g戊二胺，而对照 试验仅得到11.?戊二胺。
[0067] 序列表 <110〉宁夏伊品生物科技股份有限公司 中国科学院微生物研究所 <120〉包括二氧化碳脱除工艺的发酵生产戊二胺的方法 <130〉 CN <160〉 4 <170〉 PatentIn version 3.5 <210〉 1 <211〉 2148 <212〉 DNA <213〉 Escherichia coli <400〉 I


【主权项】
1. 发酵制备1，5-戊二胺的方法，其包括： (1) 培养表达赖氨酸脱羧酶的细胞，获得包含1，5-戊二胺的发酵液;和 (2) 提取步骤（1)获得的发酵液中的1，5-戊二胺，其中在向发酵液中加入强碱之前脱 除其中的二氧化碳。2. 权利要求1所述的方法，其中步骤（1)中，所述细胞是过表达赖氨酸脱羧酶的细胞，优 选是赖氨酸脱羧酶基因表达增强（如，通过替换赖氨酸脱羧酶基因的启动子为强启动子 (如，T7启动子)而表达增强）的细胞。3. 权利要求1所述的方法，其中步骤（1)中，所述细胞是细菌细胞，优选是大肠杆菌细 胞，如大肠杆菌BL21(DE3)。4. 权利要求1所述的方法，其中步骤（1)中，所述培养中不补加酸性pH调节剂，而且所述 细胞自身会产生C02以中和1，5-戊二胺。5. 权利要求1所述的方法，其中步骤（1)中，所述细菌以赖氨酸为底物，通过赖氨酸脱羧 酶催化而产生1，5-戊二胺。6. 权利要求1所述的方法，其中步骤(2 )包括： (21) 分离(如，离心或过滤）出发酵液中的液体； (22) 脱除步骤(21)获得的液体中的二氧化碳，然后加入碱处理;和 (23 )从步骤(22 )获得的处理液中提取出含1，5-戊二胺的成分(如，馏分）。7. 权利要求6所述的方法，其中步骤(22)中，通过减压和/或升温分离出液体中的二氧 化碳来脱除液体中的二氧化碳。8. 权利要求6所述的方法，其中步骤（22)中，碱包括氢氧化钠、氢氧化钾和/或氢氧化 钙。9. 权利要求6所述的方法，其中步骤(23)中，所述提取包括蒸馏(如，常压蒸馏、减压蒸 馏和/或精馏）、蒸发(如，闪蒸)和/或干燥(如，喷雾干燥和/或减压干燥）。10. 权利要求1所述的方法，其中1，5-戊二胺的产量大于30g/L所述发酵液，优选大于 50 g/L所述发酵液，更优选大于80 g/L所述发酵液，更加优选大于100 g/L所述发酵液，最 优选大于120 g/L所述发酵液。
【文档编号】C12P1/00GK105861586SQ201610322421
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】马吉银, 温廷益, 刘树文, 梁勇, 李戴欢, 张芸, 商秀玲, 赵春光, 郭小炜, 孟刚
【申请人】宁夏伊品生物科技股份有限公司, 中国科学院微生物研究所