一种规模化生产康百汀的工艺及获得的高纯度康百汀的制作方法
【专利摘要】本发明属于医药技术领域，具体涉及一种规模化生产康百汀的工艺及获得的高纯度康百汀。本发明提供的规模化生产康百汀的工艺中的种子培养基主要由白砂糖、甘油、KH2PO4、MgSO4·7H2O、维生素溶液和水组成，发酵培养基主要由白砂糖、甘油、黄豆粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、植物提取液和水组成。本发明提供的规模化生产康百汀的工艺中的培养基可以有效的增强桔青霉的发酵能力，提高康百汀的产量，同时，还可以降低桔青霉在发酵过程中产生的杂质，提高康百汀的纯度。本发明提供的生产康百汀的工艺是一种生产成本低、高产量、高纯度和适合规模化生产的工艺。
【专利说明】
一种规模化生产康百订的工艺及获得的高纯度康百订
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种规模化生产康百汀的工艺及获得的高纯 度康百汀。
【背景技术】
[0002] 康百汀又称为美伐他汀，是一种真菌的次生代谢产物，属HMG-C0A还原酶抑制剂， 其作用是竞争性抑制HMG-CoA还原酶，该酶是胆固醇生物合成的限速酶。康百汀于1976年由 AkiraEndo从真菌Penici 11 iumCitrinum 发现，并于1976 年由 A.G. Brown从Penicil 1 ium 131^；[(3011^^1：111]1中单独分尚出来，其分子式为〇23!124〇5，分子量为390.52。
[0003] 康百汀可以有效的降低体内的胆固醇，其衍生物普伐他汀在降低胆固醇方面具有 更强的药性。康百汀可以通过其结构某个特定碳的羟基化转化为普伐他汀，即康百汀可以 作为普伐他汀生产的中间体或初始材料。作为普伐他汀的前体或原料，康百汀的质量和产 量直接影响转化菌的转化效率和普伐他汀的纯度。因此，研究和开发高质量和产量的康百 汀生产工艺是仍是目前研究的重点。
[0004]刘家勤发表了一篇题目为"美伐他汀摇瓶培养基的优化初探"的论文，该论文研究 表明：当培养基的配方为葡萄糖66g/L、麦芽糖37g/L、豆柏15g/L、玉米浆13g/L、硫酸铵 1.3g/L、甘油40g/L、聚氧化丙烯聚氧化乙烯甘油醚2.5g/L、饮用水适量时，发酵菌种的发酵 单位可以提尚75%。
[0005] 徐蓉等发表了一篇题目为"桔青霉产美伐他汀发酵条件优化和小罐放大"的论文， 该论文研究了不同碳、氮源，无机盐，初始pH值和接种量等因素对桔青霉HD-32-2产美伐他 汀生产能力的影响，该论文着重对4种发酵培养基组分进行正交试验，形成最优的发酵培养 基为葡萄糖80g/L、麦芽糖20g/L、黄豆饼粉llg/L和磷酸氢二钾5g/L，其余与初始培养基相 同，优化后的发酵培养比初始培养的发酵水平提高了 3倍。
[0006] 李敏发表了一篇题目为"美伐他汀提取工艺研究"的论文，该论文公开了干法和湿 法浸提两种美伐他汀的提取工艺。干法提取美伐他汀的步骤为发酵液用稀酸处理后过滤， 湿菌丝通过气流干燥，干燥方式有进风140°C气流干燥、进风80°C气流干燥和进风160°C闪 蒸三种，美伐他汀的环化在气流干燥的同时完成，干燥后的菌渣(含水量低于5%)用于萃取 等后续的工艺。干法提取美伐他汀所获得的美伐他汀粗品收率仅为60%。而湿法浸提提取 美伐他汀的步骤为发酵液中的菌丝经过滤得到后，用乙酸丁酯，浸提4小时，浸提比例为1: 7;第二次浸提时间为2小时，物料比为1:4;提取浓缩液真空减压蒸馏的方式进行，生产过程 中适宜的闭环温度为70-80°C，时间为6小时。通过实验确定浸提的最佳溶剂、最佳条件，所 获得的美伐他汀粗品收率为70%。
[0007] 因此，研究和开发高产量和高纯度、适合规模化生产的康百汀生产工艺仍是目前 研究的重点。
【发明内容】
[0008] 为了解决现有技术中康百汀生产工艺存在的不足，本发明的目的在于提供一种生 产成本低、高产量、高纯度和适合规模化生产的一种规模化生产康百汀的工艺，以解决上述 缺陷。
[0009] 本发明提供了一种规模化生产康百汀的工艺，包括以下步骤：
[0010] S1将纯种桔青霉接种于种子培养基中进行种子培养，然后接种在发酵培养基中进 行发酵培养，得发酵液；
[0011] S2往步骤S1中得到的发酵液中加入上述发酵液总重量2-8 %的硅藻土，过滤，收集 滤饼;加入上述滤饼6-10倍量的乙酸丁酯在30-50°C下萃取，过滤，得滤液；
[0012] S3往步骤S2得到的滤液中加入上述滤液重量1-3倍活性炭，搅拌1-2h，过滤，将滤 液加热至90-120 °C，反应6-12h后，将滤液在40-80 °C下真空浓缩体积至1/4-3/4后，温度降 至5-10°C结晶6-10h，过滤，将晶体在60-70°C下干燥至干燥失重彡1 %，得康百汀粗品；
[0013] S4往步骤S3得到的康百汀粗品中加入上述康百汀粗品2-4倍的丙酮溶液溶解，活 性炭脱色，降温结晶，即得；
[0014] 所述种子培养基主要由以下组分组成：白砂糖45-55g/L、甘油3〇-5(^/1、腿#〇4 1-3g/L、MgS〇4 · 7H20 l-2g/L、维生素溶液0.1-0.4ml/L，水加至 1L;
[0015] 所述发酵培养基主要由以下组分组成：白砂糖45-55g/L、甘油30-40g/L、黄豆粉5_ 10g/L、KH2P〇4 0.5-2g/L、MgS〇4· 7H20 0.5-2g/L、植物提取液0.4-1.2g/L，水加至 1L。
[0016] 进一步地，所述种子培养基主要由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油40g/L、 KH2P〇4l.3g/L、MgS〇4· 7H20 1.2g/L、维生素溶液0.3ml/L，水加至 1L。
[0017] 进一步地，所述发酵培养基主要由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油32g/L、黄豆 粉7.5g/L、KH2P〇4 lg/L，MgS〇4.7H20 lg/L、植物提取液0.8g/L，水加至 1L。
[0018] 进一步地，所述种子培养基中维生素溶液由生素 m 0.03-0. lg/L、维生素 B2 0.01-0.1g/L和维生素 C 0.05-0. lg/L组成。
[0019] 进一步地，所述种子培养基中维生素溶液由生素也1.08g/L、维生素 B2 1.08g/L和 维生素 C 0. lg/L组成。
[0020] 进一步地，所述发酵培养基中植物提取液由小槐花提取液和余甘子提取液按体积 比3-6:1-2组成。
[0021] 进一步地，所述发酵培养基中植物提取液由小槐花提取液和余甘子提取液按体积 比4:1组成。
[0022] 进一步地，所述种子培养条件为:温度为26 ± 1°C，压强为0.04-1.08MPa，空气流量 为0.4-1.1 vvm，搅拌转速为80-120rpm，培养周期为60 ± 3h。
[0023] 进一步地，所述发酵培养基的培养条件为:温度为26± 2°C，压强为0.04-1.08MPa， 空气流量为0.6-1.2^111，搅拌转速为150-250印111，发酵生产周期为200-30011。
[0024] 另外，本发明还提供了所述的规模化生产康百汀的工艺获得的高纯度康百汀。
[0025] 本发明提供的桔青霉购于成都摩尔生物医药有限公司。本发明提供的小槐花提取 液的制备工艺为:将小槐花洗净，加入上述小槐花重量比4-6倍的水，加热提取2-3次，每次 l_2h，过滤，合并滤液，即得。本发明提供的余甘子提取液的制备工艺为:将余甘子洗净，粉 碎，加入上述粗粉4-6倍的水，加热提取3-4次，每次2-3h，过滤，合并滤液，即得。
[0026] 本发明提供的种子培养基和发酵培养基可以有效的增强桔青霉的发酵能力，提高 桔青霉的比生产率。经试验发现，本发明实施例1-3组康百汀的平均产量为10.67mg，其平均 产量与对照组相比提高了96.5%，实施例1-3组康百汀的平均比生产率为28.5%，其平均比 生产率与对照组相比提高了 100.7%，而对比例1-4组的康百汀的平均产量均比本发明实施 例1-3组的产量低，说明本发明提供的维生素溶液和由小槐花提取液和余甘子提取液按一 定体积比组成的植物提取液均可有效增强桔青霉的发酵能力，提高桔青霉的比生产率，可 以有效的提尚康百汀的广量。
[0027] 本发明提供的发酵培养基中植物提取液还可以降低桔青霉在发酵过程中产生的 杂质，提高康百汀的纯度。经试验发现，本发明实施例1-3组的康百汀平均纯度为99.3%，其 平均纯度与对照组相比提高了2.16%;实施例1-3组康百汀的平均总杂质含量为0.35%，其 平均杂质含量与对照组相比降低了 71.54%。而对比例2-4组的康百汀平均纯度比本发明实 施例1-3组低，平均总杂质含量比本发明实施例1-3组高，说明本发明提供的由小槐花提取 液和余甘子提取液按一定体积比组成的植物提取液可以有效的降低桔青霉在发酵过程中 产生的杂质，提高康百汀的纯度。
[0028] 本发明提供的规模化生产康百汀的工艺中的培养基可以有效的增强桔青霉的发 酵能力，提高桔青霉的比生产率，从而提高康百汀的产量，同时还可以降低桔青霉在发酵过 程中产生的杂质，提高康百汀的纯度，是一种生产成本低、高产量、高纯度和适合规模化生 产的康百汀生产工艺。
[0029] 与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势：
[0030] (1)本发明提供的种子培养基和发酵培养基可以有效的提高桔青霉的发酵能力， 提尚結青霉的比生广率，可以有效的提尚康百汀的广量；
[0031] (2)本发明提供的发酵培养基可以降低桔青霉在发酵过程中产生的杂质，提高康 百汀的纯度，更有利于产业化生产。
【具体实施方式】：
[0032] 以下通过【具体实施方式】的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限 制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本 发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0033] 实施例1、
[0034] 所述种子培养基由以下组分组成：白砂糖45g/L、甘油30g/L、KH2P〇4 lg/L、MgS〇4 · 7H20 lg/L、维生素溶液0.1ml/L，水加至1L;维生素溶液由生素 B10.03g/L、维生素 B2 O.Olg/ L和维生素 C 0.05g/L组成。
[0035]所述发酵培养基由以下组分组成：白砂糖45g/L、甘油30g/L、黄豆粉5g/L、 KH2P〇4〇.5g/L、MgS〇4 · 7H20 0.5g/L、植物提取液0.4g/L，水加至1L;所述植物提取液由小槐 花提取液和余甘子提取液按体积比3:2组成。
[0036]所述康百汀的制备工艺：
[0037] S1将桔青霉接种在上述种子培养基中进行种子培养，所述培养条件为:温度为26 °C，压强为0.04MPa，空气流量为0.5vvm，搅拌转速为lOOrpm，培养周期为62h;然后接种于上 述发酵培养基中进行发酵培养，所述培养条件为:温度为28 °C，压强为0.06MPa，空气流量为 0.8vvm，搅拌转速为200rpm，发酵生产周期为250h，得发酵液；
[0038] S2往步骤S1中得到的发酵液中加入上述发酵液总重量5 %的硅藻土，过滤，收集滤 饼;加入上述滤饼8倍量的乙酸丁酯在45°C下萃取，过滤，得滤液；
[0039] S3往步骤S2得到的滤液中加入上述滤液重量2倍活性炭，搅拌2h，过滤，将滤液加 热至100 °C，反应8h后，将滤液在60 °C下真空浓缩体积至1 /4，温度降至8 °C结晶8h，过滤，将 晶体在65°C下干燥至干燥失重%，得康百汀粗品；
[0040] S4往步骤S3得到的康百汀粗品中加入上述康百汀粗品4倍的丙酮溶液溶解，活性 炭脱色，降温结晶，即得。
[0041 ] 实施例2、
[0042] 所述种子培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油40g/L、KH2P〇4 1.3g/L、 MgS〇4· 7H20 1.2g/L、维生素溶液0.3ml/L，水加至1L;所述维生素溶液由生素出0.08g/L、 维生素 B2 0.08g/L和维生素 C 0.1g/L组成。
[0043] 所述发酵培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油32g/L、黄豆粉7.5g/L、 KH2P〇4lg/L，MgS〇4 · 7H20 lg/L、植物提取液0.8g/L，水加至1L;所述植物提取液由小槐花提 取液和余甘子提取液按体积比4:1组成。
[0044] 所述康百汀的制备工艺与实施例1类似。
[0045] 实施例3、
[0046] 所述种子培养基由以下组分组成：白砂糖55g/L、甘油50g/L、KH2P〇4 3g/L、MgS〇4 · 7H20 2g/L、维生素溶液0.4ml/L，水加至1L;所述维生素溶液由生素 Bi 0.1g/L、维生素 B2 0.1g/L和维生素 C 0.1g/L组成。
[0047] 所述发酵培养基由以下组分组成：白砂糖55g/L、甘油40g/L、黄豆粉10g/L、 KH2P〇42g/L、MgS〇4 · 7H20 2g/L、植物提取液1.2g/L，水加至1L;所述植物提取液由小槐花提 取液和余甘子提取液按体积比6:1组成。
[0048] 所述康百汀的制备工艺与实施例1类似。
[0049] 对比例1、
[0050] 所述种子培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油40g/L、KH2P〇4 1.3g/L、 MgS〇4· 7H20 1.2g/L、维生素溶液0.3ml/L，水加至1L;所述维生素溶液由生素出0.13g/L和 维生素 B2 0.13g/L组成。
[0051] 所述发酵培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油32g/L、黄豆粉7.5g/L、 KH2P〇4lg/L，MgS〇4 · 7H20 lg/L、植物提取液0.8g/L，水加至1L;所述植物提取液由小槐花提 取液和余甘子提取液按体积比4:1组成。
[0052] 所述康百汀的制备工艺与实施例1类似。
[0053]与实施例2的区别在于，维生素溶液中没有添加维生素 C，增加维生素出和维生素 B2 的含量。
[0054] 对比例2、
[0055] 所述种子培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油40g/L、KH2P〇4 1.3g/L、 MgS〇4· 7H20 1.2g/L、维生素溶液0.3ml/L，水加至1L;所述维生素溶液由生素出0.08g/L、 维生素 B2 0.08g/L和维生素 C 0.1g/L组成。
[0056]所述发酵培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油32g/L、黄豆粉7.5g/L、 KH2P〇4lg/L，MgS〇4 · 7H20 lg/L、植物提取液0.8g/L，水加至1L;所述植物提取液为小槐花提 取液。
[0057] 所述康百汀的制备工艺与实施例1类似。
[0058] 与实施例2的区别在于，植物提取液为小槐花提取液。
[0059] 对比例3、
[0060] 所述种子培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油40g/L、KH2P〇4 1.3g/L、 MgS〇4· 7H20 1.2g/L、维生素溶液0.3ml/L，水加至1L;所述维生素溶液由生素出0.08g/L、 维生素 B2 0.08g/L和维生素 C 0.1g/L组成。
[0061] 所述发酵培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油32g/L、黄豆粉7.5g/L、 KH2P〇4lg/L，MgS〇4 · 7H20 lg/L、植物提取液0.8g/L，水加至1L;所述植物提取液为余甘子提 取液。
[0062] 所述康百汀的制备工艺与实施例1类似。
[0063] 与实施例2的区别在于，植物提取液为余甘子提取液。
[0064] 对比例4、
[0065] 所述种子培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油40g/L、KH2P〇4 1.3g/L、 MgS〇4· 7H20 1.2g/L、维生素溶液0.3ml/L，水加至1L;所述维生素溶液由生素出0.08g/L、 维生素 B2 0.08g/L和维生素 C 0.1g/L组成。
[0066] 所述发酵培养基由以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油32g/L、黄豆粉7.5g/L、 KH2P〇4lg/L，MgS〇4 · 7H20 lg/L、植物提取液0.8g/L，水加至1L;所述植物提取液由小槐花提 取液和余甘子提取液按体积比1:1组成。
[0067] 所述康百汀的制备工艺与实施例1类似。
[0068] 与实施例2的区别在于，所述植物提取液中小槐花提取液和余甘子提取液的体积 比为1:1。
[0069]试验例一、康百汀的产量检测试验
[0070] 1、试验材料:实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制 备的种子培养基和发酵培养基。
[0071] 2、试验方法：
[0072] 将实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的种子 培养基和发酵培养基，分别设置实施例1组、实施例2组、实施例3组、对比例1组、对比例2组、 对比例3组和对比例4组，其中以种子培养基不加维生素溶液、发酵培养基不加植物提取液 的实施例2制备的种子培养基和发酵培养基作为对照组，将不同组的培养基在同一条件下 制备康百汀，采用15L发酵罐，装液量7L，菌丝接种体积分数为10%，
[0073] 每12h取样分析。
[0074]测定康百汀的生物量和产物量，计算康百汀的比生长率。其中：生物量测定:采用 菌丝干重法，取20ml发酵液离心后收集菌体至滤纸上，80°C烘至恒重称量;产物量的测定： 采用高效液相色谱法(HPLC)法测定，比生产率是指单位菌体生产的产物量，比生产率=产 物量/生物量。
[0075] 3、试验结果
[0076]试验结果如表1所示。
[0077]表1康百汀的产量检测试验
[0078] ]
[0079] I
[0080] 由表1可知，本发明实施例1-3组康百汀的平均产量为10.67mg/ml，其平均产量与 对照组相比提高了96.5%，实施例1-3组康百汀的平均比生产率为28.5%，其平均比生产率 与对照组相比提高了 100.7%，其中实施例2为最佳实施例。而对比例1-4组的康百汀的平均 产量均比本发明实施例1-3组的产量低，说明本发明提供的维生素溶液和由小槐花提取液 和余甘子提取液按一定体积比组成的植物提取液均可有效的增强桔青霉的发酵能力，提高 桔青霉的比生产率，可以有效的提高康百汀的产量。
[0081] 试验例二、康百汀的质量检测试验
[0082] 1、试验材料:实施例1、实施例2、实施例3、对比例2、对比例3和对比例4制备的种子 培养基和发酵培养基。
[0083] 2、试验方法：
[0084] 将实施例1、实施例2、实施例3、对比例2、对比例3和对比例4制备的种子培养基和 发酵培养基，分别设置实施例1组、实施例2组、实施例3组、对比例2组、对比例3组和对比例4 组，其中以发酵培养基不加植物提取液的实施例2制备的种子培养基和发酵培养基作为对 照组。将不同组的培养基在同一条件下制备康百汀，采用高效液相色谱法(HPLC)法测定康 百汀的纯度和杂质含量。
[0085] 3、试验结果
[0086]试验结果如表2所示。
[0087] 表2康百汀的质量检测试验
[0088]
[0089]
[0090] 由表2可知，本发明实施例1-3组的康百汀平均纯度为99.3%，其平均纯度与对照 组相比提高了2.16%;实施例1-3组康百汀的平均总杂质含量为0.35%，其平均杂质含量与 对照组相比降低了71.54%，其中实施例2为最佳实施例。而对比例2-4组的康百汀平均纯度 比本发明实施例1-3组低，平均总杂质含量比本发明实施例1-3组高，说明本发明提供的由 小槐花提取液和余甘子提取液按一定体积比组成的植物提取液可以有效的降低桔青霉在 发酵过程中产生的杂质，提高康百汀的纯度。
【主权项】
1. 一种规模化生产康百汀的工艺，其特征在于，包括以下步骤： Sl将纯种桔青霉接种于种子培养基中进行种子培养，然后接种在发酵培养基中进行发 酵培养，得发酵液； S2往步骤Sl中得到的发酵液中加入上述发酵液总重量2-8%的硅藻土，过滤，收集滤 饼;加入上述滤饼6-10倍量的乙酸丁酯在30-50°C下萃取，过滤，得滤液； S3往步骤S2得到的滤液中加入上述滤液重量1-3倍活性炭，搅拌1-2h，过滤，将滤液加 热至90-120°C，反应6-12h后，将滤液在40-80°C下真空浓缩体积至1/4-3/4后，温度降至5-10°C结晶6-10h，过滤，将晶体在60-70°C下干燥至干燥失重彡1%，得康百汀粗品； S4往步骤S3得到的康百汀粗品中加入上述康百汀粗品2-4倍的丙酮溶液溶解，活性炭 脱色，降温结晶，即得； 所述种子培养基主要由以下组分组成：白砂糖45-55g/L、甘油3〇-50g/L、KH2P〇4 l_3g/ L、MgS〇4 · 7H20 l-2g/L、维生素溶液0.1-0.4ml/L，水加至 1L; 所述发酵培养基主要由以下组分组成：白砂糖45-55g/L、甘油30-40g/L、黄豆粉5-10g/ L、KH2P〇4 0.5-2g/L、MgS〇4· 7H20 0.5-2g/L、植物提取液0.4-1.2g/L，水加至 1L。2. 如权利要求1所述的规模化生产康百汀的工艺，其特征在于，所述种子培养基主要由 以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油40g/L、KH 2P〇4 1.3g/L、MgS〇4 · 7H20 1.2g/L、维生素溶液 0.3ml/L，水加至 1L。3. 如权利要求1所述的规模化生产康百汀的工艺，其特征在于，所述发酵培养基主要由 以下组分组成：白砂糖52g/L、甘油32g/L、黄豆粉7.5g/L、KH 2P〇4 lg/L，MgS〇4· 7H20 lg/L、 植物提取液0.8g/L，水加至1L。4. 如权利要求1所述的规模化生产康百汀的工艺，其特征在于，所述种子培养基中维生 素溶液由生素 B1 0.03-0. lg/L、维生素 B2 0.01-0. lg/L和维生素 C 0.05-0. lg/L组成。5. 如权利要求4所述的规模化生产康百汀的工艺，其特征在于，所述种子培养基中维生 素溶液由生素 Bi 0.08g/L、维生素 B2 0.08g/L和维生素 C 0.1g/L组成。6. 如权利要求1所述的规模化生产康百汀的工艺，其特征在于，所述发酵培养基中植物 提取液由小槐花提取液和余甘子提取液按体积比3-6:1-2组成。7. 如权利要求6所述的规模化生产康百汀的工艺，其特征在于，所述发酵培养基中植物 提取液由小槐花提取液和余甘子提取液按体积比4:1组成。8. 如权利要求1所述的规模化生产康百汀的工艺，其特征在于，所述种子培养的培养条 件为：温度为26 ± 1°C，压强为0.04-0.08MPa，空气流量为0.4-1. Ovvm，搅拌转速为80-120印111，培养周期为60±311。9. 如权利要求1所述的规模化生产康百汀的工艺，其特征在于，所述发酵培养的培养条 件为：温度为26 ± 2 °C，压强为0.04-0.08MPa，空气流量为0.6-1.2vvm，搅拌转速为150-250rpm，发酵生产周期为200-300h。10. 如权利要求1-9任一所述的规模化生产康百汀的工艺获得的高纯度康百汀。
【文档编号】C12P17/06GK105907808SQ201610293538
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】黄智勇, 徐会根, 罗定军, 陈继敏, 李耀荣, 熊志, 叶家雄
【申请人】广东蓝宝制药有限公司