调控基因在分泌型腺毛基细胞中优势表达的启动子及应用
【专利摘要】调控基因在分泌型腺毛基细胞中优势表达的启动子及应用。本发明公开了一种植物生物技术领域的基因启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，能够调控目的基因在植物分泌型腺毛基细胞中优势表达。同时本发明还涉及前述基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途。由于利用植物腺毛特异表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作时，不会对植物的生长发育造成危害。因此，本发明对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。
【专利说明】
调控基因在分泌型腺毛基细胞中优势表达的启动子及应用
技术领域
[0001] 本发明设及植物生物技术领域，尤其设及一种调控基因在分泌型腺毛基细胞中优 势表达的启动子及其应用。
【背景技术】
[0002] 青葛(Artemisia annua L.)是菊科葛属一年生草本植物，植株有浓烈的挥发性香 气，其植株中含有许多次级代谢产物:青葛素、挥发油、Q-羡締、精脑、青葛酬等，此外还含有 黄酬类化合物。青葛素(Ademisinin)是从其地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍 半祗内醋化合物，作为世界卫生组织（WHO)推荐的抗追疾药物联合治疗（Artemisinin- based combination therapies, ACTS) 的主要有效成分。目前青葛素的主要来源是从青葛 的地上部分提取，然而青葛中青葛素的含量非常低(〇.〇1%-1%)，运使得运种药物的大规 模商业化生产受到了极大限制。
[0003] 青葛的叶片表面有两种腺毛：分泌型腺毛（glandular secretoiy t;richome，GST) 和非分泌型腺毛(T shaped trichomeJST)，两种腺毛对于植物的生长、发育、防御、花粉传 播等都起到至关重要的作用。其中，青葛素只在青葛的分泌型腺毛中合成，分泌型腺毛是青 葛叶片表面一种具有十细胞结构的特化器官，是由两个基细胞、两个柄细胞、六个分泌型细 胞W及外部的囊腔结构所构成。启动子是位于结构基因5'端上游的特定核酸序列，能够调 控下游基因的表达，启动子就像一个"开关"，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作 用来发挥其特定的功能。启动子一共分=种:组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。 在目前青葛的基因工程研究中，多采用组成型启动子，例如花挪菜花叶病毒35S启动子 (CaMV35S )，运种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，会过度消耗细胞内 的物质和能量，并且不能在时间和空间上调控目的基因的表达，极可能会对植物的正常生 长造成一定的负担和危害。因此急需找到在植物的组织器官中特异性表达的启动子来代替 组成型启动子，从而更好的对植物基因的表达进行调控。由于腺毛特异表达的启动子对于 植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可W克服组成型启动子 的种种弊端。因此，本发明致力提供一种克隆到植物腺毛组织特异表达的启动子。
【发明内容】
[0004] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种调控基因在分泌型腺毛基细胞中 优势表达的启动子，能引导基因在转基因植物分泌型腺毛中特异表达。上述启动子为MYB家 族转录因子基因启动子，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0005] 进一步地，上述启动子为诱导型启动子。
[0006] 本发明还提供了上述启动子在植物生产代谢产物的基因工程育种中的应用。
[0007] 进一步地，上述启动子为特异型启动子，能够代替组成型启动子引导外源基因在 植物分泌型腺毛中特异表达。
[000引本发明还提供了一种重组表达载体，其包含如SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。
[0009] 本发明还提供了一种重组表达转化体，其包含如SEQ ID NO. I所示的核巧酸序列。
[0010] 本发明还提供了一种调控基因在分泌型腺毛基细胞中优势表达的启动子的制备 方法，包括W下步骤：
[0011] 步骤一、培养青葛无菌苗；
[0012] 步骤二、克隆调控基因在分泌型腺毛基细胞中优势表达的启动子基因组序列；
[0013] 步骤=、分析调控基因在分泌型腺毛基细胞中优势表达的启动子上面的顺式作用 元件，确定上述启动子类型；
[0014] 步骤四、将克隆到的上述启动子通过酶切连接连入PCAMBIA1391Z载体中；
[0015] 步骤五、将步骤四中构建好的载体转化根癌农杆菌；
[0016] 步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青葛；
[0017] 步骤屯、PCR检现赠基因植株；
[0018] 步骤八、确定上述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。
[0019] 进一步地，上述步骤二W基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增启动子序 列。
[0020] 进一步地，上述步骤S中的顺式作用元件包括:TATA box、CAAT box、G-box、ARE、 GATA-mo t i f、GAG-mo t i f、ABRE、肥S。
[0021 ]启动子序列中调控元件见下表1:
[0022]表1:启动子序列中调控元件分析
[00731
[0024] 进一步地，上述步骤四中，为构建PCAMBIA1391Z载体，正向引物中引入PstI酶切位 点，反向引物中引入BamHI酶切位点，引物序列如下所示：
[0025] 1391z-proAaMIXTAl-F：AACTGCAGAAAGGCCCCCTTAAAAGATACG
[0026] 1391z-proAaMIXTAl-R：CGGGATCCAATGAAGACGAAAACCGTCGC
[0027] 进一步地，上述步骤六具体包括：
[0028] 1)外植体的预培养；
[0029] 2)农杆菌与外植体的共培养；
[0030] 3)抗性再生植株的筛选。
[0031] 本发明的有益效果在于，利用有效的青葛表皮毛组织特异性启动子代替组成型启 动子可W用于构建在分子生物学中在青葛分泌型腺毛特异表达目的基因的融合基因，利用 遗传转化技术将其转入其他植物的基因组中，从而实现目的基因的定向操作已获得转基因 植物，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛用于利用植物腺毛组织表达和生产代 谢产物的基因工程育种中。
[0032] W下将结合附图对本发明作进一步说明，W充分说明本发明的目的、技术特征和 技术效果。
【附图说明】
[0033] 通过阅读参照W下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0034] 图1示出了本发明的一个较优实施例中的AaMIXTAl基因启动子序列及其顺式作用 元件；
[0035] 图2示出了转基因青葛植株的PC郎日性检测结果图；
[0036] 图3示出了利用AaMIXTAl基因启动子与GUS基因融合的载体pCAMBIA1391z-pro AaMIXTAl通过农杆菌介导的稳定转化青葛后，所获得的转基因青葛中GUS组织染色图；
[0037] 图4示出了 AaMIXTAl在青葛中分泌型腺毛基部表达示意图。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合具体实例对本发明进行详尽说明，W下实例将有助于本领域的技术人员 进一步理解本发明而不W任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于本发明的保护范 围。
[0039] 下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 分子克隆：实验室手册见化W York:Cold Spring化rbor Laboratory Press的1989年版中 所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0040] 本实施例设及的根癌农杆菌邸A105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄； 根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3): 38-43》文 献中公开。根癌农杆菌EHA105，质粒PCAMBIA1391Z可通过公开市售的商业渠道取得，如可W 从澳大利亚GAMBIA公司购得，菌株编号为Gambarl。
[0041 ]实施例
[0042 ]本实施例设及AaMIXTAl基因启动子的获得，具体包括如下步骤：
[0043] 步骤一、培养青葛无菌苗
[0044] 青葛种子用体积分数为75%的乙醇浸泡Imin,再用20% (w/v)的化QO浸泡20min 后，无菌水冲洗3次~4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无任何激素的MS固体培养基 上，25°C、1化/她(Ii曲t/dark)光照培养，14天后即可获得青葛无菌苗；
[0045] 步骤二、基因组DNA中启动子序列的克隆
[0046] 1.基因组DNA的提取
[0047] 在1.5血离屯、管中加入2粒钢珠，在其中放一片青葛叶片（Icm2左右大小，用冰盒盛 取）。加入300化TPS buf f er (通风楓内操作，TPS中含有2 %琉基乙醇），55-60HZ，震荡90秒。 再加入30化L TPS buffe;r(通风楓）d65°C水浴化(每隔20min摇一摇），可适当延长时间，最 长1.化。冷却至室溫，4°C 1200化pm离屯、15min。取30化レ40化L上清液。等体积加入30化心 400化异丙醇(异丙醇在-20°C预冷）。混合后在-20°C冰箱中放置IO-ISmin(可延长至化）。取 出4 °C 12000巧m离屯、IOmin，吸去上清，在通风楓中倒置IO-ISmin。加入75 %乙醇500-600化， 将沉淀吹打起或用手指弹起，放在摇床上摇15-20min，重复一次。吸干液体，放在37°C中烘 干，直到沉淀变为透明。加入50化dd出0回溶，4 °C保存。
[004引 2. PCR扩增
[0049] W基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增分泌型腺毛特异启动子序列。为了提高产 物的特异性，采用两轮巢式PCR(Nested PCR)扩增，根据本实验室基因组测序得到的 AaMIXTAl基因的启动子序列设计巢式PCR引物如表2所示，首轮PCR反应体系如表3所示。PCR 条件为:95°C预变性5min ;94°C变性30s; 55°C退火30s; 72°C延伸3min，35个循环;72°C延伸 IOmin。在I %的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物。
[0化0] 亲2巢式PCR引物巧计
[0化1 ]
[0化2]
[0化3]
[0054] H化1-的'|职什丄。。1口，|尸^ |大'化^。^^化1。1、，^^化1。1、/入应体系见表 4dPCR 条件为:95°C 预变性 5min; 94°C 变性 30s; 55°C 退火 30s; 72°C 延伸 Smin，35 个循环;72°C 延伸lOmin。在1%的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物，切胶回收目的片段，纯化DM。然后连 接到pMD18-T(购自化KaRa公司）载体用于测序，将该片段的序列与基因序列进行拼接，获得 AaMIXTAl基因上游2569bp的片段。
[0化日]表4第二轮PCR反应体系
[0化6]
[0化7] 巧驟二、分机恃判WAaMiWAi虽囚旧功于W顺巧化用兀巧，側疋AaMIXTAl基因启 动子的类型
[005引本发明中得到的AaMIXTAl基因启动子序列长度为2569bp。为了寻找启动子上面的 乃顷式作用元件，用 Pl曰ntc曰re (http : //bioinform曰tics .psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/)对AaMIXTAl基因的启动子进行分析。分析发现多克隆到的启动子上面具 有除了TATA box和CAAT box,还具有很多顺式作用元件：G-box、ARE、ABRE-motif、GATA- motif、肥S等;G-box在很多植物启动子中都有发现，它是很多应激响应启动子行使功能所 必须的元件，在植物启动子对光、无氧环境和植物激素的响应过程中起到很重要的作用;此 夕h G A - m 01 i f受光调控，A B R E - m 01 i f在植物中能够响应脱落酸；W上结果分析表明， AaMIXTAl基因启动子是一个诱导型的启动子，能受多种激素和自然因素诱导。AaMIXTAl基 因启动子序列及其顺式作用元件示于图1。
[0059] 步骤四、将得到的启动子连入PCAMBIA-1391Z载体，融合GUS报告基因。
[0060] 为了研究基因启动子在植物不同组织部位中的表达，将AaMIXTAl基因的启动子 proAaMIXTAl连接PCAMBIA-1391Z载体融合GUS报告基因，为了实现对表达载体的构建，正向 引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入BamHI酶切位点，引物序列如下表所示：
[0061 ]表 5pCAMBIA1391z-proAaMIXTAl 载体构建 PCR 引物 [00A91
12345 步骤五、将构建好的pCAMBIA1391z-proAaMIXTAl载体转化根癌农杆菌并检测。 2 将含有构建完成的植物双元表达载体转入根癌农杆菌化HA105)，并进行PCR验证。 结果表明：含有基因启动子片段的植物双元表达载体成功的构建到根癌农杆菌菌株中，从 而获得含基因启动子和GUS基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391z-proAaMIXTAl的根癌农 杆菌菌株中。 3 步骤六、将带有pCAMBIA1391z-proAaMIXTAl载体的根癌农杆菌转化青葛 4 1)外植体的预培养 5 青葛种子用体积分数为75 %的乙醇浸泡Imin;再用20 % (w/v)的NaQO浸泡20min; 无菌水冲洗3~4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS,该MS培养基采用 Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可W通过商业渠道获得;25 °C、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青葛无菌苗，待苗长至5cm左右后，剪取无 菌苗叶片外植体用于转化；
[0068] 2)农杆菌与外植体的共培养
[0069] 将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100皿ol/L AS组成的共培养培养基中，滴加含 活化好的所述含DELO到DEL8基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使 外植体与菌液充分接触，28°C暗培养3d，W滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液 体培养基悬液的叶片外植体为对照；
[0070] 3)抗性再生植株的筛选
[0071] 将所述的共培养3d的青葛外植体转入到MS、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、50mg/L Kan和500mg/L Cb组成的发芽筛选培养基上，于25°C、16小时的日光（light)和8小时的黑暗 (dark)中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将生长良 好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS0和125mg/L化组成的生根培养基上培养至生根，从而获得 Kan抗性再生青葛植株；
[0072] 步骤屯、PCR检测转基因植株
[0073] 根据目的基因所在表达盒promoter-GUS序列promoter和GUS分别设计正向引物 (proAaMIXTAlF:CTCCGTATTATCTTATACTAGTA)和反向引物（GUSR:GACATCGGCTTCAAATGGCGTA) 对GUS基因进行检测；结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而W非 转化青葛基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段，如图2所示；
[0074] 步骤八、启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位的确定
[0075] 对PCR检测为阳性的青葛植株，取其叶片进行GUS组织染色，结果如图3所示；图4则 示出了AaMIXTAl在青葛中分泌型腺毛基部表达示意图；结果表明，染色部位在青葛的分泌 型腺毛基部中优势表达，说明proAaMIXTAl基因启动子在转基因青葛中能够引导外源基因 在腺毛中特异表达，由此可见，本发明所克隆的proAaMIXTAl基因启动子可用于利用植物腺 毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。
[0076] W上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创 造性劳动就可W根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员 依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可W得到的技术 方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种调控基因在分泌型腺毛基细胞中优势表达的启动子，其特征在于，所述启动子 为MYB家族转录因子基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子为诱导型启动子。3. 根据权利要求1或2所述的启动子在植物生产代谢产物的基因工程育种中的应用。4. 一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列。5. -种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列。6. -种调控基因在分泌型腺毛基细胞中优势表达的启动子的制备方法，其特征在于， 所述制备方法包括以下步骤： 步骤一、培养青蒿无菌苗； 步骤二、克隆调控基因在分泌型腺毛基细胞中优势表达的启动子基因组序列； 步骤三、分析调控基因在分泌型腺毛基细胞中优势表达的启动子上面的顺式作用元 件，确定所述启动子类型； 步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中； 步骤五、将步骤四中构建好的载体转化根癌农杆菌； 步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿； 步骤七、PCR检测转基因植株； 步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二以基因组DNA为模板，采用 两轮巢式PCR方法扩增启动子序列。8. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的所述顺式作用元件包 括：TATA box、CAAT box、G-box、ARE、GATA-motif、GAG-motif、ABRE、HES〇9. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391z 载体，正向引物中引入Pst頂每切位点，反向引物中引入BamM酶切位点，引物序列如下所示： 1391z-proAaMIXTAl-F：AACTGCAGAAAGGCCCCCTTAAAAGATACG 1391z-proAaMIXTAl-R：CGGGATCCAATGAAGACGAAAACCGTCGC〇10. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤六具体包括： 1) 外植体的预培养； 2) 农杆菌与外植体的共培养； 3) 抗性再生植株的筛选。
【文档编号】C12N15/84GK105925577SQ201610298499
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】唐克轩, 石璞, 付雪晴, 唐岳立, 孙小芬, 吕宗友, 颜廷祥, 陈明慧
【申请人】上海交通大学