一种聚苹果酸的提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种聚苹果酸的提取方法，将发酵培养聚苹果酸和膜分离技术结合一起，在发酵进入稳定期后，取样进行膜过滤，透过的物质进行分级提取，同时截留的大分子量的物质以及菌体回流，继续合成聚苹果酸，摒弃了传统的独立发酵和提取过程，提高了工作效率，降低了提取工艺的成本，并且可以根据选择不同截留分子量的超滤膜一次性提取不同分子量的聚苹果酸，是一种高效制备不同分子量聚苹果酸的有效方法。
【专利说明】
-种聚苹果酸的提取方法
技术领域
[0001] 本发明设及高分子聚合物制备领域，尤其设及一种聚苹果酸的提取方法。
【背景技术】
[0002] 出芽短梗霉又名出芽巧霉，分类属于半知菌纲，是一种具有酵母型和菌丝型形态 的多形真菌。出芽短梗霉在发酵过程中能够合成聚苹果酸、抗菌素、酶、胞外多聚糖及单细 胞蛋白等多种产物。有报道指出LIUSJ等利用出芽短梗霉发酵得到了聚苹果酸，并发现聚苹 果酸的产生是在对数期。
[0003] 聚苹果酸是W苹果酸为唯一单体合成的高分子聚合物，独特的化学结构使其具有 生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性等优良性质。其次，它作为一种水溶性脂肪族聚 醋，具有高度水溶性、可化学衍生性。聚苹果酸的独特的性质，使其在医药、化妆品、环境治 理W及香精香料等许多方面有着广阔的应用前景。生物合成法合成聚苹果酸主要是通过微 生物在发酵合成后，分泌到胞外，存在于发酵液中，再经过后续的提取工艺即可得到聚苹果 酸产品，和化学合成法相比，生物法具有成本低、反应条件溫和、分子量相对较高等优点，因 此生物法合成聚苹果酸具有广阔的发展前景。
[0004] 聚苹果酸能够应用到药物载体领域，其分子量是评价其作为药物载体性能的重要 指标，能够用作药物载体的聚合物分子量范围是1.5~200W)a，在该范围内，适当提高聚苹 果酸分子量，可W提高其载药量，而当分子量过高时，则难W穿过细胞膜而失去作为药物载 体的性能。
[0005] 目前，有关微生物发酵合成聚苹果酸的方法有多种，其中包括诱变获得高产菌株、 优化发酵条件W及培养基提高产量、复合添加生长因子提高产量等等，有关聚苹果酸提取 方面的专利也有一些，包括有机溶剂提取法、全水化提取等等，实验室曾经采用改变发酵条 件或添加某一种生长因子的方法生产不同分子量的聚苹果酸，该方法只能针对合成某一特 定分子量的聚苹果酸。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明旨在提出一种聚苹果酸的提取方法，W解决现有技术中聚苹果 酸分子量大，并且一次提取聚苹果酸分子量单一的问题。
[0007] 为达到上述目的，本发明的技术方案是运样实现的:一种聚苹果酸的提取方法，包 括种子培养、发酵培养、分离提取及聚苹果酸纯度的测定，其中分离提取的方法如下：
[000引（1)当种子液发酵培养48-6化时，开始将发酵液进行分离，在发酵罐出料口处安有 超滤膜，每隔8-12h从发酵罐出料口处膜过滤取出300~500ml的发酵液透过液，将菌体W及 大分子物质截留在发酵罐中继续反应，同时往发酵罐中加入与透过液相同体积的发酵培养 基，获得的发酵液依次经过截留分子量为20KDa、10KDa、5邸a的超滤膜进行超滤；
[0009] (2)将步骤（1)中依次经过=种超滤膜超滤获得的=种滤液，分别进行活性炭脱 色，然后分别经过旋转蒸发浓缩后进行真空冷冻干燥，获得=种分子量的聚苹果酸。
[0010] 优选，种子培养的方法为:将出芽短梗霉斜面活化4-化，然后用无菌水洗下抱子， 制备抱子悬液，将抱子悬液转接到装有种子培养基的容器中培养，培养溫度为25-35°C，转 速 160-200r/min，培养 30-6化。
[0011] 优选，发酵培养的方法为:在无菌条件下，将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐 中进行培养，培养条件为转速500-700r/min，罐压为0.1 -0.3Mpa，通风比1:6-1:4。
[0012] 优选，聚苹果酸纯度的测定采用高效液相色谱法，首先称取质量为ml的聚苹果酸， 配制成浓度为2g/L的溶液，然后用移液管取5血聚苹果酸溶液加入等体积的Imol/L出S化溶 液，于ll〇°C条件下水解lOh，将聚苹果酸完全水解为单体苹果酸;然后用高效液相色谱法测 定水解前后苹果酸的含量，结合苹果酸的标准曲线得出聚苹果酸中苹果酸的含量，水解前 苹果酸含量和水解后苹果酸的含量之差为聚苹果酸的含量m2,聚苹果酸的纯度为：
[0013] 优选，种子培养基的组成为：薦糖80-120g/L，酵母膏2-4g/L，硫酸锭l-3g/L，下二 酸3-5邑/1，皿2口04 0.2-0.8邑/1，]\%504.7出0 0.05-0.15邑/1，2记04.7此0 0.03-0.06邑/1，其 余为蒸馈水。
[0014] 优选，发酵培养基的组成为：薦糖100-300g/L，蛋白腺20-40g/L，K&P04 0.05- 0.13g/L，NaN〇3 3-5g/L，MgS〇4. 7出0 0.3-0.9g/L，KCl 0.2-0.8g/L，MnS〇4 0.01-0.08g/L， 其余为蒸馈水。
[0015] 优选，种子培养基的组成为：薦糖lOOg/L，酵母膏3g/L，硫酸锭2g/L，下二酸4g/L， 1(出口04 0.5邑/1，1邑504?7出0 0.1邑/1，211504?7出0 0.05邑/1，其余为蒸馈水。
[0016] 优选，发酵培养基的组成为：薦糖200g/L，蛋白腺30g/L，K此P〇4〇. Ig/L，化N03 4g/ ^1邑504*7出0 0.6邑/1，腺10.5邑/1，1记04 0.05邑/1，其余为蒸馈水。
[0017] 相对于现有技术，本发明所述的一种聚苹果酸提取方法，具有W下优势：
[0018] (1)本发明所述的一种聚苹果酸的提取方法，将发酵培养聚苹果酸和膜分离技术 巧妙的结合一起，在发酵进入稳定期后，取样进行膜过滤，透过的物质分级提取，同时截留 的大分子量的物质W及菌体回流，继续合成聚苹果酸，擬弃了传统的独立发酵和提取过程， 提高了工作效率，降低了提取工艺的成本。
[0019] (2)本发明所述的一种聚苹果酸的提取方法，可W根据选择不同截留分子量的超 滤膜一次性提取不同分子量的聚苹果酸，是一种高效制备不同分子量聚苹果酸的有效方 法。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例对本发明的内容进一步说明。
[0021] 实施案例1:
[0022] (1)种子培养
[0023] 将出芽短梗霉斜面活化地，然后用无菌水洗下抱子，制备抱子悬液，将抱子悬液转 接到含种子培养基的容器中培养，培养溫度25 °C，转速16化/min，培养30h，其中种子培养基 组成为：薦糖80g/L，酵母膏2g/L，硫酸锭Ig/L，下二酸3g/L，K此P〇4 0.2g/L，MgS〇4 ? 7出0 0.05g/L，aiS〇4 ? 7出0 0.03g/L，其余为蒸馈水；
[0024] (2)发酵培养
[0025] 在无菌条件下，将步骤（1)中得到的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行 培养，培养条件为转速50化/min，罐压0.1 Mpa，通风比1:4，其中发酵培养基为:薦糖lOOg/L， 蛋白腺20g/L，KH2P〇4 0.05g/L，NaN〇3 3g/L，MgS〇4.7H2〇 0.3g/L，KCl 0.2g/L，MnS〇4 O.Olg/L，其余为蒸馈水；
[00%] (3)发酵液分离、过滤
[0027]当步骤(2)中种子液发酵培养48h时，开始将发酵液进行分离，在发酵罐出料口处 安装有超滤膜，每隔化从发酵罐出料口处膜过滤取出300ml发酵液透过液，截留菌体W及大 分子物质返回到发酵罐中继续反应，同时往发酵罐中加入300ml发酵培养基，获得的发酵液 依次用截留分子量为20KDa、10KDa、5邸a的超滤膜进行超滤；
[00%] (4)聚苹果酸的制备
[0029] 将步骤(3)中超滤获得的=种分子量区间的滤液，分别进行活性炭脱色，然后分别 经过旋转蒸发浓缩后进行真空冷冻干燥；
[0030] (5)聚苹果酸纯度的测定
[0031 ]对步骤(4)中获得的=种分子量的聚苹果酸采用高效液相色谱法进行聚苹果酸的 含量测定，测得聚苹果酸的纯度均达到80.44% W上。
[0032] 实施案例2:
[00削 （1)种子培养
[0034] 将出芽短梗霉斜面活化化，然后用无菌水洗下抱子，制备抱子悬液，将抱子悬液转 接到含有种子培养基的容器中培养，培养溫度35 °C，转速20化/min，培养60h，其中种子培养 基组成为:薦糖120g/L，酵母膏4g/L，硫酸锭3g/L，下二酸5g/L，K出P〇4 0.8g/L，MgS〇4 ? 7此0 0.15g/L，aiS〇4 ? 7出0 0.06g/L，其余为蒸馈水；
[0035] (2)发酵培养
[0036] 在无菌条件下，将步骤（1)中得到的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行 培养，培养条件为转速70化/min，罐压0.3Mpa，通风比1:6，其中发酵培养基为:薦糖300g/L， 蛋白腺40g/L，KH2P〇4 0.13g/L，化N03 5g/L，MgS〇4.7H2〇 0.9g/L，KCl 0.8g/L，MnS〇4 0.08g/L，其余为蒸馈水；
[0037] (3)发酵液分离、过滤
[0038] 当步骤(2)中种子液发酵培养54h时，开始将发酵液进行分离，在发酵罐出料口处 安装有超滤膜，每隔IOh从发酵罐出料口处膜过滤取出400ml发酵液透过液，截留菌体W及 大分子物质返回到发酵罐中继续反应，同时往发酵罐中加入400ml发酵培养基，获得的发酵 液依次用截留分子量为20KDa、1 OKDa、5邸a的超滤膜进行超滤；
[0039] (4)聚苹果酸的制备
[0040] 将步骤(3)中超滤获得的=种分子量区间的滤液，分别进行活性炭脱色，然后经过 旋转蒸发浓缩后进行真空冷冻干燥；
[0041] (5)聚苹果酸纯度的测定
[0042] 对步骤(4)中获得的=种分子量的聚苹果酸采用高效液相色谱法进行聚苹果酸的 含量测定，测得聚苹果酸的纯度均达到84.03% W上。
[0043] 实施案例3:
[0044] (I)种子培养
[0045] 将出芽短梗霉斜面活化4.化，然后用无菌水洗下抱子，制备抱子悬液，将抱子悬液 转接到含有种子培养基的容器中培养，培养溫度28°C，转速18化/min,培养40h，其中种子培 养基组成为：薦糖lOOg/L，酵母膏3g/L，硫酸锭2g/L，下二酸4g/L，K此P〇4 0.5g/L，MgS〇4 ? 7出0 0.1邑/1，211504?7出0 0.05邑/1，其余为蒸馈水；
[0046] (2)发酵培养
[0047] 在无菌条件下，将步骤（1)中得到的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行 培养，培养条件为转速60化/min，罐压0.2Mpa，通风比1:5，其中发酵培养基为:薦糖200g/L， 蛋白腺30g/L，KH2P〇4 0.1g/L，NaN〇3 4g/L，MgS〇4*7出0 0.6g/L，KCl 0.5g/L，MnS〇4 0.05g/ L，其余为蒸馈水；
[004引（3)发酵液分离、过滤
[0049] 当步骤(2)中种子液发酵培养60h时，开始将发酵液进行分离，在发酵罐出料口处 安装有超滤膜，每隔12h从发酵罐出料口处膜过滤取出500ml发酵液透过液，截留菌体W及 大分子物质返回到发酵罐中继续反应，同时往发酵罐中加入500ml发酵培养基，获得的发酵 液依次用截留分子量为20KDa、1 OKDa、5邸a的超滤膜进行超滤；
[0050] (4)聚苹果酸的制备
[0051] 将步骤(3)中超滤获得的S种分子量区间的滤液，分别进行活性炭脱色，然后经过 旋转蒸发浓缩后进行真空冷冻干燥；
[0052] (5)聚苹果酸纯度的测定
[0053] 对步骤(4)中获得的=种分子量的聚苹果酸采用高效液相色谱法进行聚苹果酸的 含量测定，测得聚苹果酸的纯度均达到83.95% W上。
[0化4] 实施案例4:
[00对 （1)种子培养
[0056] 将出芽短梗霉斜面活化地，然后用无菌水洗下抱子，制备抱子悬液，将抱子悬液转 接到含有种子培养基的容器中培养，培养溫度28°C，转速18化/min,培养40h，其中种子培养 基组成为:薦糖lOOg/L，酵母膏3g/L，硫酸锭2g/L，下二酸4g/L，K出P〇4 0.5g/L，MgS〇4 ? 7此0 0.1g/L，ZnS〇4 ? 7出0 0.05g/L，其余为蒸馈水；
[0057] (2)发酵培养
[0058] 在无菌条件下，将步骤（1)中得到的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行 培养，培养条件为转速60化/min，罐压0.2Mpa，通风比1:5，其中发酵培养基为:薦糖200g/L， 蛋白腺30g/L，KH2P〇4 0.1g/L，NaN〇3 4g/L，MgS〇4*7出0 0.6g/L，KCl 0.5g/L，MnS〇4 0.05g/ L，其余为蒸馈水；
[0059] (3)发酵液分离、过滤
[0060] 当步骤(2)中种子液发酵培养60h时，开始将发酵液进行分离，在发酵罐出料口处 安装有超滤膜，每隔IOh从发酵罐出料口处膜过滤取出400ml发酵液透过液，截留菌体W及 大分子物质返回到发酵罐中继续反应，同时往发酵罐中加入400ml发酵培养基，获得的发酵 液依次用截留分子量为20KDa、1 OKDa、5邸a的超滤膜进行超滤；
[0061] (4)聚苹果酸的制备
[0062] 将步骤(3)中超滤获得的=种分子量区间的滤液，分别进行活性炭脱色，然后经过 旋转蒸发浓缩后进行真空冷冻干燥；
[0063] (5)聚苹果酸纯度的测定
[0064] 对步骤(4)中获得的=种分子量的聚苹果酸采用高效液相色谱法进行聚苹果酸的 含量测定，测得聚苹果酸的纯度均达到85.12% W上。
【主权项】
1. 一种聚苹果酸的提取方法，包括种子培养、发酵培养、分离提取及聚苹果酸纯度的测 定，其特征在于分离提取的方法如下： (1) 当种子液发酵培养48_60h时，开始将发酵液进行分尚，在发酵罐出料口处安有超滤 膜，每隔8_12h从发酵罐出料口处膜过滤取出300~500ml的发酵液透过液，将菌体以及大分 子物质截留在发酵罐中继续反应，同时往发酵罐中加入与透过液相同体积的发酵培养基， 获得的发酵液依次经过截留分子量为20KDa、10KDa、5KDa的超滤膜进行超滤； (2) 将步骤（1)中依次经过三种超滤膜超滤获得的三种滤液，分别进行活性炭脱色，然 后分别经过旋转蒸发浓缩后进行真空冷冻干燥，获得三种分子量的聚苹果酸。2. 根据权利要求1所述的一种聚苹果酸的提取方法，其特征在于所述种子培养的方法 为:将出芽短梗霉斜面活化4-5h，然后用无菌水洗下孢子，制备孢子悬液，将孢子悬液转接 到装有种子培养基的容器中培养，培养温度为25-35°C，转速160-200r/min，培养30-60h。3. 根据权利要求1所述的一种聚苹果酸的提取方法，其特征在于所述发酵培养的方法 为:在无菌条件下，将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件为转速 500-700r/min，罐压为0 · 1-0 · 3Mpa，通风比 1:6-1:4。4. 根据权利要求1所述的一种聚苹果酸的提取方法，其特征在于所述聚苹果酸纯度的 测定采用高效液相色谱法，首先称取质量为ml的聚苹果酸，配制成浓度为2g/L的溶液，然后 用移液管取5mL聚苹果酸溶液加入等体积的lmol/L H2S〇4溶液，于110°C条件下水解10h，将 聚苹果酸完全水解为单体苹果酸;然后用高效液相色谱法测定水解前后苹果酸的含量，结 合苹果酸的标准曲线得出聚苹果酸中苹果酸的含量，水解前苹果酸含量和水解后苹果酸的 含量之差为聚苹果酸的含量m2,聚苹果酸的纯度为：5. 根据权利要求2所述的一种聚苹果酸的提取方法，其特征在于所述种子培养基的组 成为:蔗糖80-120g/L，酵母膏2-4g/L，硫酸铵 l-3g/L，丁二酸3-5g/L，KH2P〇4 0 · 2-0 · 8g/L， MgS〇4 · 7H20 0.05-0.15g/L，ZnS〇4 · 7Η200· 03-0.06g/L，其余为蒸馏水。6. 根据权利要求3所述的一种聚苹果酸的提取方法，其特征在于所述发酵培养基的组 成为：蔗糖100-30(^/1，蛋白胨20-4(^/1，1〇12?040.05-0.138/1，恥腸3 3-58/1，]\%504.7!120 0.3-0.9g/L，KCl 0.2-〇.8g/L，MnS〇4 0.01_0.08g/L，其余为蒸馏水。7. 根据权利要求5所述的一种聚苹果酸的提取方法，其特征在于所述种子培养基的组 成为：蔗糖l〇〇g/L，酵母膏3g/L，硫酸铵2g/L，丁二酸4g/L，KH 2P〇4 0 · 5g/L，MgS〇4 · 7H20 0.1g/L，ZnS〇4 · 7H20 0.05g/L，其余为蒸馏水。8. 根据权利要求6所述的一种聚苹果酸的提取方法，其特征在于所述发酵培养基的组 成为：蔗糖 200g/L，蛋白胨 30g/L，KH2P〇4 0.1g/L，NaN034g/L，MgS〇4 · 7H20 0.6g/L，KCl 0.5g/L，MnS〇4 0.05g/L，其余为蒸馏水。
【文档编号】C12R1/645GK105925626SQ201610409712
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】殷海松, 乔长晟, 边艳慧, 陈珊, 汤卫华, 刘鹏, 张乐, 牛红军, 刘鑫龙, 张轶斌, 马倩影, 刘晨
【申请人】天津市轻工业化学研究所有限公司