一种快速检测食品添加剂(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠)联合毒性方法
【专利摘要】本发明公开一种快速检测食品添加剂(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠)联合毒性方法。该方法针对食品添加剂新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的化合结构及其对细胞毒性作用的实验结果，筛选表征新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合细胞毒性的特异性指标：细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH，通过高内涵分析系统对六个指标检测分析，根据特异性指标的分析结果鉴定其联合毒性。本发明方法对检测过程进行了优化，具有快速、可靠、重复性好、特异性强等优点，可以为食品添加剂新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的正确使用提供理论依据，对保证食品添加剂的正确使用和食品安全具有重要意义。
【专利说明】
一种快速检测食品添加剂(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠)联合毒性方法
技术领域
[0001]本发明属于食品安全领域，涉及一种快速检测食品添加剂(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠)联合毒性的方法，具体涉及一种一次性快速检测两种食品添加剂:新红、对羟基苯甲酸甲酯钠同时添加产生的毒性效应。
【背景技术】
[0002]食品添加剂是所有加工食品配料中的重要组成部分之一，可以使加工食品增加营养;提高色、香、味、形等感官质量和内在质量;防止食品腐败变质;改善食品的加工条件等。目前所使用的添加剂的使用标准是依据单一物质的毒性而制定的，而食品行业中食品添加剂都是联合使用的，实际生活中人类每天摄取多种食品，一种食品添加剂在允许使用范围内是安全的，而几种同时使用时，可能会产生相加、协同、拮抗等形式的联合作用，存在着使单一物质的毒性作用增强的危险性。目前尚未有标准的评测两种及以上的食品添加剂毒性的方法，因此亟需建立一种操作简便、可以快速准确地评测食品添加剂联合毒性的现代化检测方法。
[0003]高内涵分析(high content analysis，HCA)是一种基于细胞表型分析的高效新药筛选技术，能够在保持细胞结构和功能完整的前提下，同时检测被筛样品对细胞的形态、生长、周期、迀移、凋亡、代谢途径及信号传导等方面的影响，实现化合物多种生物活性和毒性的早期、快速、高通量检测。具有操作简单、快速高效、实时监测、高灵敏性、短时间获得丰富数据信息等优点。目前该技术主要用于单一化合物(新药物)筛选等方面，而对食品添加剂(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠)联合毒性的快速检测方法未有报道和公开。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种鉴别食品添加剂(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠)联合毒性方法，特别是一种一次性快速检测新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合毒性的方法。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下:
[0006]该方法包括以下步骤:
[0007]步骤(I).在预铺细胞粘附剂的96孔板上，S丽C-7721细胞(人肝癌细胞)以5X 14个/孔/10yL种板，37°C，5%CO2培养12h ；采用的细胞培养液为RPM1-1640培养基；
[0008]步骤(2).取出步骤(I)携有培养后SMMC-7721细胞的96孔板，弃掉培养液，然后加入160yL/孔RPM1-1640培养基、40yL/孔5\待测样品，培养时间为7211;同时设立加入4(^17孔的细胞培养液作阴性对照(即设立步骤(I)携有培养后SMMC-7721细胞的96孔板弃掉培养液后加入160yL/孔RPM1-1640培养基、40yL/孔的细胞培养液，培养时间为72h，作阴性对照)；
[0009]所述的待测样品为新红、对羟基苯甲酸甲酯钠混合液，最终浓度依照食品包装袋上的剂量添加；
[0010]步骤(3).取出步骤(2)培养后的96孔板，加50μ?ν孔的活细胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0011 ]所述的活细胞染料溶液为Hoechst 34580，Mitotracker orange，IysoTrackerDeep Red三种染料的混合液，三者的最终浓度比值为1:2:1;
[0012]步骤(4).弃掉培养液，加10yL/孔预温至37°C的固定液，常温避光放置20min;其中固定液为质量百分比4%的多聚甲醛；
[0013]步骤(5).在步骤(4)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤I次，再加入10yL/孔的透膜缓冲液，常温避光孵育1min;
[0014]所述的透膜缓冲液为含质量百分比0.1%TritonX-100的PBS缓冲液；
[0015]步骤(6).在步骤(5)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入I:1000(体积比)的FITC标记的细胞微管蛋白抗体，常温避光孵育Ih;
[0016]步骤(7).在步骤(6)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高内涵图像分析系统检测，检测条件如下:第一通道选择“DAPI”检测Hoechst 34580标记的细胞核，第二通道选择“FITC”检测FITC标记的细胞微管蛋白，第三通道选择“Cy3”检测Mitotracker orange标记的线粒体膜电位(活细胞)，第四通道选择“Fura-2”检测lysoSensor Blue标记的溶酶体PH值;普通光源下检测细胞总数;选择20倍物镜，每孔采集10个视野的图像，存储信息用于图像分析；
[0017]步骤(8).采用MetaXpress分析软件对步骤(7)检测到的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH进行定位和定量分析，并以细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH参数形式表示，根据MetaXpress分析软件分析的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH六个参数判定食品添加剂新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的联合毒性。
[0018]判定该剂量的新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合使用有细胞毒性的标准:溶酶体PH与阴性对照组(加入细胞培养液组)差异显著(P<0.05)，以及其它五个指标中的任一指标或多个指标与阴性对照组差异显著(P<0.05)，即可判定该剂量的新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合使用有细胞毒性。注:如果细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位五个指标中的任一指标或多个指标与阴性对照组差异显著(P<0.05)，而溶酶体PH与阴性对照组差异不显著(P>0.05)，该次检测无效，需要重新对样品进行检测；如果细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH六个指标都与阴性对照组差异不显著(P>0.05)，则表明该剂量的新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合使用无细胞毒性;如果溶酶体PH单一指标与阴性对照组差异显著(P<0.05)，则表明该剂量的新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合使用具有潜在的细胞毒性，需要进一步进行分析鉴定。
[0019]本发明的有益效果:本发明针对食品添加剂新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的化合结构筛选了表征新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的联合细胞毒性的六个特异性指标，具有较好的特异性;本发明进行了重复性验证，利用棋盘法做了 100个浓度组合，每个组合重复3次，证明了该方法具有较好的重复性;本发明根据细胞染料的特性进行了混合比例优化，从而使普通方法需要进行四次操作才能完成的实验指标而现在只需要操作一次，使试剂使用量、检测时间等方面都大为减少，一定程度上也减少了出错的概率;本发明建立了快速检测食品添加剂新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的联合细胞毒性方法，可以为食品添加剂新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的正确使用提供理论依据，对保证食品添加剂的正确使用和食品安全具有重要意义。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例对本发明作进一步的分析。
[0021]实施例1
[0022]步骤(I).到超市采集XXX牌果味饮料，记录添加新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的剂量，分别为 0.05g/kg、0.16g/kg。
[0023]步骤(2).在预铺细胞粘附剂的96孔板上，S丽C-7721细胞(人肝癌细胞)以5X 14个/孔/10yL种板，37°C，5%CO2培养12h ；采用的细胞培养液为RPM1-1640培养基；
[0024]步骤(3).取出步骤(2)携有培养后SMMC-7721细胞的96孔板，弃掉培养液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培养基、40yL/孔5 X待测样品(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠混合液)，新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的添加量分别为0.05g/kg、0.16g/kg，培养时间为72h;同时设立加入40μ!7孔的细胞培养液作阴性对照；
[0025]步骤(4).取出步骤(3)培养后的96孔板，加50yL/孔的活细胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0026]步骤(5).弃掉培养液，加10yL/孔预温至37°C的固定液，常温避光放置20min;其中固定液为质量百分比4%多聚甲醛；
[0027]步骤(6).在步骤(5)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤I次，再加入10yL/孔的透膜缓冲液，常温避光孵育1min;
[0028]步骤(7).在步骤(6)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入I:1000(体积比)的FITC标记的细胞微管蛋白抗体，常温避光孵育Ih。
[0029]步骤(8).在步骤(7)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高内涵图像分析系统检测，检测条件如下:第一通道选择“DAPI”检测Hoechst 34580标记的细胞核，第二通道选择“FITC”检测FITC标记的细胞微管蛋白，第三通道选择“Cy3”检测Mitotracker orange标记的线粒体膜电位(活细胞)，第四通道选择“Fura-2”检测lysoSensor Blue标记的溶酶体PH值;普通光源下检测细胞总数。选择20倍物镜，每孔采集10个视野的图像，存储信息用于图像分析；
[0030]步骤(9).采用MetaXpress分析软件对细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH进行定位和定量分析，并以细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH参数形式表示，根据MetaXpress分析软件分析的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH六个参数判定食品添加剂的联合毒性。结果显示，添加0.05g/kg新红、0.16g/kg对羟基苯甲酸甲酯钠后，细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH与阴性对照无显著性差异(P>0.05)，表明该剂量的新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合添加是无细胞毒性的。
[0031]实施例2
[0032]步骤(I).到超市采集XXX牌饮料，记录其添加新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的剂量，分别为0.05g/kg、0.18g/kg。
[0033]步骤(2).在预铺细胞粘附剂的96孔板上，S丽C-7721细胞(人肝癌细胞)以5X 14个/孔/10yL种板，37°C，5%CO2培养12h ；采用的细胞培养液为RPM1-1640培养基；
[0034]步骤(3).取出步骤(2)携有培养后SMMC-7721细胞的96孔板，弃掉培养液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培养基、40yL/孔5 X待测样品(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠混合液)，新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的添加量分别为0.05g/kg、0.18g/kg，培养时间为72h;同时设立加入40μ!7孔的细胞培养液作阴性对照；
[0035]步骤(4).取出步骤(3)培养后的96孔板，加50yL/孔的活细胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0036]步骤(5).弃掉培养液，加10yL/孔预温至37°C的固定液，常温避光放置20min;其中固定液为质量百分比4%多聚甲醛；
[0037]步骤(6).在步骤(5)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤I次，再加入10yL/孔的透膜缓冲液，常温避光孵育1min;
[0038]步骤(7).在步骤(6)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入I:1000(体积比)的FITC标记的细胞微管蛋白抗体，常温避光孵育Ih。
[0039]步骤(8).在步骤(7)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高内涵图像分析系统检测，检测条件如下:第一通道选择“DAPI”检测Hoechst 34580标记的细胞核，第二通道选择“FITC”检测FITC标记的细胞微管蛋白，第三通道选择“Cy3”检测Mitotracker orange标记的线粒体膜电位(活细胞)，第四通道选择“Fura-2”检测lysoSensor Blue标记的溶酶体PH值;普通光源下检测细胞总数。选择20倍物镜，每孔采集10个视野的图像，存储信息用于图像分析；
[0040]步骤(9).采用MetaXpress分析软件对细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH进行定位和定量分析，并以细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH参数形式表示，根据MetaXpress分析软件分析的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH六个参数判定食品添加剂的联合毒性。结果显示，添加0.05g/kg新红、0.18g/kg对羟基苯甲酸甲酯钠后，细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH与阴性对照无显著性差异(P>0.05)，表明该剂量的新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合添加是无细胞毒性的。
[0041 ] 实施例3
[0042]步骤(I).到超市采集XXX牌饮料，记录其添加新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的剂量，分别为0.05g/kg、0.20g/kg。
[0043]步骤(2).在预铺细胞粘附剂的96孔板上，S丽C-7721细胞(人肝癌细胞)以5X 14个/孔/10yL种板，37°C，5%CO2培养12h ；采用的细胞培养液为RPM1-1640培养基；
[0044]步骤(3).取出步骤(2)携有培养后SMMC-7721细胞的96孔板，弃掉培养液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培养基、40yL/孔5 X待测样品(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠混合液)，新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的添加量分别为0.05g/kg、0.20g/kg，培养时间为72h;同时设立加入40μ!7孔的细胞培养液作阴性对照；
[0045]步骤(4).取出步骤(3)培养后的96孔板，加50yL/孔的活细胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0046]步骤(5).弃掉培养液，加10yL/孔预温至37°C的固定液，常温避光放置20min;其中固定液为质量百分比4%多聚甲醛；
[0047]步骤(6).在步骤(5)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤I次，再加入10yL/孔的透膜缓冲液，常温避光孵育1min;
[0048]步骤(7).在步骤(6)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入I:1000(体积比)的FITC标记的细胞微管蛋白抗体，常温避光孵育Ih。
[0049]步骤(8).在步骤(7)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高内涵图像分析系统检测，检测条件如下:第一通道选择“DAPI”检测Hoechst 34580标记的细胞核，第二通道选择“FITC”检测FITC标记的细胞微管蛋白，第三通道选择“Cy3”检测Mitotracker orange标记的线粒体膜电位(活细胞)，第四通道选择“Fura-2”检测lysoSensor Blue标记的溶酶体PH值;普通光源下检测细胞总数。选择20倍物镜，每孔采集10个视野的图像，存储信息用于图像分析；
[0050]步骤(9).采用MetaXpress分析软件对细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH进行定位和定量分析，并以细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH参数形式表示，根据MetaXpress分析软件分析的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH六个参数判定食品添加剂的联合毒性。结果显示，添加0.05g/kg新红、0.20g/kg对羟基苯甲酸甲酯钠后，细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH与阴性对照无显著性差异(P>0.05)，表明该剂量的新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合添加是无细胞毒性的。
[0051 ] 实施例4
[0052]步骤(I).到超市采集XXX牌糖果及饮料，将两者混合后记录新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的剂量，分别为0.05g/kg、0.21 g/kg。
[0053]步骤(2).在预铺细胞粘附剂的96孔板上，S丽C-7721细胞(人肝癌细胞)以5X 14个/孔/10yL种板，37°C，5%CO2培养12h ；采用的细胞培养液为RPM1-1640培养基；
[0054]步骤(3).取出步骤(2)携有培养后SMMC-7721细胞的96孔板，弃掉培养液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培养基、40yL/孔5 X待测样品(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠混合液)，新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的添加量分别为0.05g/kg、0.21 g/kg，培养时间为72h;同时设立加入40μ!7孔的细胞培养液作阴性对照；
[0055]步骤(4).取出步骤(3)培养后的96孔板，加50yL/孔的活细胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0056]步骤(5).弃掉培养液，加10yL/孔预温至37°C的固定液，常温避光放置20min;其中固定液为质量百分比4%多聚甲醛；
[0057]步骤(6).在步骤(5)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤I次，再加入10yL/孔的透膜缓冲液，常温避光孵育1min;
[0058]步骤(7).在步骤(6)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入I:1000(体积比)的FITC标记的细胞微管蛋白抗体，常温避光孵育Ih。
[0059]步骤(8).在步骤(7)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高内涵图像分析系统检测，检测条件如下:第一通道选择“DAPI”检测Hoechst 34580标记的细胞核，第二通道选择“FITC”检测FITC标记的细胞微管蛋白，第三通道选择“Cy3”检测Mitotracker orange标记的线粒体膜电位(活细胞)，第四通道选择“Fura-2”检测lysoSensor Blue标记的溶酶体PH值;普通光源下检测细胞总数。选择20倍物镜，每孔采集10个视野的图像，存储信息用于图像分析；
[0060]步骤(9).采用MetaXpress分析软件对细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH进行定位和定量分析，并以细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH参数形式表示，根据MetaXpress分析软件分析的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH六个参数判定食品添加剂的联合毒性。结果显示，添加0.05g/kg新红、0.21g/kg对羟基苯甲酸甲酯钠后，细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH与阴性对照无显著性差异(P>0.05)，表明该剂量的新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合添加是无细胞毒性的。
[0061 ] 实施例5
[0062]步骤(I).实验室配制出的饮料，测得最后新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的剂量，分别
^1.2g/L,0.8g/Lo
[0063]步骤(2).在预铺细胞粘附剂的96孔板上，S丽C-7721细胞(人肝癌细胞)以5X 14个/孔/10yL种板，37°C，5%CO2培养12h ；采用的细胞培养液为RPM1-1640培养基；
[0064]步骤(3).取出步骤(2)携有培养后SMMC-7721细胞的96孔板，弃掉培养液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培养基、40yL/孔5 X待测样品(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠混合液)，新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的终浓度分别为1.2g/L、0.8g/L，培养时间为72h;同时设立加入40μ!7孔的细胞培养液作阴性对照；
[0065]步骤(4).取出步骤(3)培养后的96孔板，加50yL/孔的活细胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0066]步骤(5).弃掉培养液，加10yL/孔预温至37°C的固定液，常温避光放置20min;其中固定液为质量百分比4%多聚甲醛；
[0067]步骤(6).在步骤(5)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤I次，再加入10yL/孔的透膜缓冲液，常温避光孵育1min;
[0068]步骤(7).在步骤(6)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入I:1000(体积比)的FITC标记的细胞微管蛋白抗体，常温避光孵育Ih。
[0069]步骤(8).在步骤(7)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高内涵图像分析系统检测，检测条件如下:第一通道选择“DAPI”检测Hoechst 34580标记的细胞核，第二通道选择“FITC”检测FITC标记的细胞微管蛋白，第三通道选择“Cy3”检测Mitotracker orange标记的线粒体膜电位(活细胞)，第四通道选择“Fura-2”检测lysoSensor Blue标记的溶酶体PH值;普通光源下检测细胞总数。选择20倍物镜，每孔采集10个视野的图像，存储信息用于图像分析；
[0070]步骤(9).采用MetaXpress分析软件对细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH进行定位和定量分析，并以细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH参数形式表示，根据MetaXpress分析软件分析的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH六个参数判定食品添加剂的联合毒性。结果显示，添加1.2g/L新红、0.8g/L对羟基苯甲酸甲酯钠后，细胞总数、细胞微管蛋白、细胞核状态、线粒体膜电位、溶酶体PH与阴性对照无显著性差异(P>0.05)，活细胞总数与阴性对照组差异显著(P<0.05)。由于溶酶体PH指标与阴性对照无显著性差异(P>0.05)，按照判断标准，该次检测无效，需要重新对样品进行检测;重新检测结果显示，添加1.2g/L新红、0.8g/L对羟基苯甲酸甲酯钠后，细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、线粒体膜电位与阴性对照无显著性差异(P>0.05)，细胞微管蛋白、溶酶体PH与阴性对照差异显著(P<0.05)，表明该剂量的新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合添加是有细胞毒性的。
[0071 ] 实施例6
[0072]步骤(I).实验室配制出的饮料，测得最后新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的剂量，分别为0.62g/kg、0.67g/kg。
[0073]步骤(2).在预铺细胞粘附剂的96孔板上，S丽C-7721细胞(人肝癌细胞)以5X 14个/孔/10yL种板，37°C，5%CO2培养12h ；采用的细胞培养液为RPM1-1640培养基；
[0074]步骤(3).取出步骤(2)携有培养后SMMC-7721细胞的96孔板，弃掉培养液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培养基、40yL/孔5 X待测样品(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠混合液)，新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的添加量分别为0.62g/kg、0.67g/kg，培养时间为72h;同时设立加入40μ!7孔的细胞培养液作阴性对照；
[0075]步骤(4).取出步骤(3)培养后的96孔板，加50yL/孔的活细胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0076]步骤(5).弃掉培养液，加10yL/孔预温至37°C的固定液，常温避光放置20min;其中固定液为质量百分比4%多聚甲醛；
[0077]步骤(6).在步骤(5)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤I次，再加入10yL/孔的透膜缓冲液，常温避光孵育1min;
[0078]步骤(7).在步骤(6)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入I:1000(体积比)的FITC标记的细胞微管蛋白抗体，常温避光孵育Ih。
[0079]步骤(8).在步骤(7)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高内涵图像分析系统检测，检测条件如下:第一通道选择“DAPI”检测Hoechst 34580标记的细胞核，第二通道选择“FITC”检测FITC标记的细胞微管蛋白，第三通道选择“Cy3”检测Mitotracker orange标记的线粒体膜电位(活细胞)，第四通道选择“Fura-2”检测lysoSensor Blue标记的溶酶体PH值;普通光源下检测细胞总数。选择20倍物镜，每孔采集10个视野的图像，存储信息用于图像分析；
[0080]步骤(9).采用MetaXpress分析软件对细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH进行定位和定量分析，并以细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH参数形式表示，根据MetaXpress分析软件分析的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH六个参数判定食品添加剂的联合毒性。结果显示，添加0.62g/kg新红、0.67g/kg对羟基苯甲酸甲酯钠后，细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管状态、线粒体膜电位与阴性对照无显著性差异(P>0.05)，而溶酶体PH与阴性对照差异显著(P<0.05)，表明该剂量的新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合添加是有潜在细胞毒性的，需要进一步分析验证。
[0081 ] 实施例7
[0082]步骤(I).实验室配制出的饮料，测得最后新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的剂量，分别为1.lg/kg、l.2g/kg。
[0083]步骤(2).在预铺细胞粘附剂的96孔板上，S丽C-7721细胞(人肝癌细胞)以5X 14个/孔/10yL种板，37°C，5%CO2培养12h ；采用的细胞培养液为RPM1-1640培养基；
[0084]步骤(3).取出步骤(2)携有培养后SMMC-7721细胞的96孔板，弃掉培养液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培养基、40yL/孔5 X待测样品(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠混合液)，新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的添加量分别为1.仏/1^、1.28/1^，培养时间为7211;同时设立加入40μ!7孔的细胞培养液作阴性对照；
[0085]步骤(4).取出步骤(3)培养后的96孔板，加50yL/孔的活细胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0086]步骤(5).弃掉培养液，加10yL/孔预温至37°C的固定液，常温避光放置20min;其中固定液为质量百分比4%多聚甲醛；
[0087]步骤(6).在步骤(5)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤I次，再加入10yL/孔的透膜缓冲液，常温避光孵育1min;
[0088]步骤(7).在步骤(6)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入I:1000(体积比)的FITC标记的细胞微管蛋白抗体，常温避光孵育Ih。
[0089]步骤(8).在步骤(7)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高内涵图像分析系统检测，检测条件如下:第一通道选择“DAPI”检测Hoechst 34580标记的细胞核，第二通道选择“FITC”检测FITC标记的细胞微管蛋白，第三通道选择“Cy3”检测Mitotracker orange标记的线粒体膜电位(活细胞)，第四通道选择“Fura-2”检测lysoSensor Blue标记的溶酶体PH值;普通光源下检测细胞总数。选择20倍物镜，每孔采集10个视野的图像，存储信息用于图像分析；
[0090]步骤(9).采用MetaXpress分析软件对细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH进行定位和定量分析，并以细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH参数形式表示，根据MetaXpress分析软件分析的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH六个参数判定食品添加剂的联合毒性。结果显示，添加1.lg/kg新红、1.2g/kg对羟基苯甲酸甲酯钠后，细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、线粒体膜电位与阴性对照无显著性差异(P>
0.05)，而细胞微管状态、溶酶体PH与阴性对照差异显著(P < 0.0 5 )，表明该剂量的新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合添加是有细胞毒性的。
[0091 ] 实施例8
[0092]步骤(I).实验室配制出的饮料，测得最后新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的剂量，分别为2.lg/kg、l.2g/kg。
[0093]步骤(2).在预铺细胞粘附剂的96孔板上，S丽C-7721细胞(人肝癌细胞)以5X 14个/孔/10yL种板，37°C，5%CO2培养12h ；采用的细胞培养液为RPM1-1640培养基；
[0094]步骤(3).取出步骤(2)携有培养后SMMC-7721细胞的96孔板，弃掉培养液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培养基、40yL/孔5 X待测样品(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠混合液)，新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的添加量分别为2.1 g/kg a.2g/kg，培养时间为72h;同时设立加入40μ!7孔的细胞培养液作阴性对照；
[0095]步骤(4).取出步骤(3)培养后的96孔板，加50yL/孔的活细胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0096]步骤(5).弃掉培养液，加10yL/孔预温至37°C的固定液，常温避光放置20min;其中固定液为质量百分比4%多聚甲醛；
[0097]步骤(6).在步骤(5)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤I次，再加入10yL/孔的透膜缓冲液，常温避光孵育1min;
[0098]步骤(7).在步骤(6)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入I:1000(体积比)的FITC标记的细胞微管蛋白抗体，常温避光孵育Ih。
[0099]步骤(8).在步骤(7)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高内涵图像分析系统检测，检测条件如下:第一通道选择“DAPI”检测Hoechst 34580标记的细胞核，第二通道选择“FITC”检测FITC标记的细胞微管蛋白，第三通道选择“Cy3”检测Mitotracker orange标记的线粒体膜电位(活细胞)，第四通道选择“Fura-2”检测lysoSensor Blue标记的溶酶体PH值;普通光源下检测细胞总数。选择20倍物镜，每孔采集10个视野的图像，存储信息用于图像分析；
[0100]步骤(9).采用MetaXpress分析软件对细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH进行定位和定量分析，并以细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH参数形式表示，根据MetaXpress分析软件分析的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH六个参数判定食品添加剂的联合毒性。结果显示，添加2.lg/kg新红、1.2g/kg对羟基苯甲酸甲酯钠后，细胞总数与阴性对照无显著性差异(P>0.05)，而活细胞数量、细胞核状态、线粒体膜电位、细胞微管状态、溶酶体PH与阴性对照差异显著(P < 0.0 5 )，表明该剂量的新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合添加是有细胞毒性的。
【主权项】
1.一种快速检测食品添加剂(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠)联合毒性方法，其特征在于该方法包括以下步骤: 步骤(I).在预铺细胞粘附剂的96孔板上，SMMC-7721细胞以5 X 14个/孔/I OOyL种板，37°C,5% CO2培养12h; 步骤(2).取出步骤(I)携有培养后SMMC-7721细胞的96孔板，弃掉培养液，然后加入160yL/孔RPM1-1640培养基、40yL/孔5 X待测样品，培养时间为72h;同时设立加入40yL/孔的细胞培养液作阴性对照； 所述的待测样品为新红、对羟基苯甲酸甲酯钠混合液，最终浓度依照食品包装袋上的剂量添加； 步骤(3).取出步骤(2)培养后的96孔板，加50yL/孔的活细胞染料溶液，37 °C孵育30min； 所述的活细胞染料溶液为Hoechst 34580 ? Mi to tracker orange ? IysoTracker DeepRed三种染料的混合液，三者的最终浓度比值为1:2:1; 步骤(4).弃掉培养液，加10yL/孔预温至37°C的固定液，常温避光放置20min; 步骤(5).在步骤(4)处理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS进行洗涤I次，再加入100μL/孔的透膜缓冲液，常温避光孵育1min; 步骤(6).在步骤(5)处理后的96孔板中加入10yL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入1000倍体积FITC标记的细胞微管蛋白抗体，常温避光孵育Ih; 步骤(7).在步骤(6)处理后的96孔板中加入10yL/孔的I3BS进行洗涤2次后，加入200μL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高内涵图像分析系统检测，检测条件如下:第一通道选择“DAPI”检测Hoechst 34580标记的细胞核，第二通道选择“FITC”检测FITC标记的细胞微管蛋白，第三通道选择“Cy3”检测Mitotracker orange标记的线粒体膜电位(活细胞)，第四通道选择“Fura-2”检测IysoSensor Blue标记的溶酶体PH值;普通光源下检测细胞总数;选择20倍物镜，每孔采集10个视野的图像，存储信息用于图像分析； 步骤(8).采用MetaXpress分析软件对步骤(7)检测到的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH进行定位和定量分析，并以细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH参数形式表示，根据MetaXpress分析软件分析的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH六个参数判定食品添加剂新红、对羟基苯甲酸甲酯钠的联合毒性。2.如权利要求1所述的一种快速检测食品添加剂(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠)联合毒性方法，其特征在于步骤(4)其中固定液为质量百分比4%的多聚甲醛。3.如权利要求1所述的一种快速检测食品添加剂(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠)联合毒性方法，其特征在于步骤(5)所述的透膜缓冲液为含质量百分比0.1 %Triton X-100的PBS缓冲液。4.如权利要求1所述的一种快速检测食品添加剂(新红、对羟基苯甲酸甲酯钠)联合毒性方法，其特征在于步骤(8)判定某剂量下新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合使用有细胞毒性的标准如下: ①若溶酶体PH与阴性对照组差异不显著(P>0.05)，但是细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位五个指标中的任一指标或多个指标与阴性对照组差异显著(P<0.05)，则该次检测无效，需要重新对样品进行检测； ②若溶酶体PH与阴性对照组差异显著(P<0.05),且细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位五个指标中的任一指标或多个指标与阴性对照组差异显著(P<0.05)，则判定该剂量下新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合使用有细胞毒性； ③若细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH六个指标都与阴性对照组差异不显著(P>0.05)，则表明该剂量的新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合使用无细胞毒性； ④若溶酶体PH单一指标与阴性对照组差异显著(P<0.05)，则表明该剂量的新红、对羟基苯甲酸甲酯钠联合使用具有潜在的细胞毒性，需要进一步进行分析鉴定。
【文档编号】C12Q1/02GK105925658SQ201610244076
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】曲道峰, 韩剑众, 谷炎培
【申请人】浙江工商大学