微泡菌属细菌生物合成对羟基苯甲酸和酯类的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种合成对羟基苯甲酸和酯类的方法，特别是一种微泡菌属细菌生物 合成对羟基苯甲酸和酯类的方法。
【背景技术】
[0002] 对羟基苯甲酸（4HBA)是用途广泛的有机合成原料，主要应用于食品、化妆品、医 药的防腐、防霉剂和杀菌剂的合成方面。2002年，我国4HBA的生产量为6 000吨，并以每年 11. 4%的速度递增，预计2014年的生产量可达2万吨以上。对羟基苯甲酸的用途之一是对 羟基苯甲酸酯类的合成，该酯类化合物的英文名为Paraben，其中甲酯又名为尼泊金甲、乙 酯又名为尼泊金乙，是目前使用最多的防腐剂。对羟基苯甲酸的另外一个重要用途是在合 成液晶高分子上的应用。液晶是在1959年利用对羟基苯甲酸的乙酸酯经熔融和固相聚缩 合后首次获得，后来经过改良成具有实用价值的材料。现在市场上的液晶商品"Xydar"是 对羟基苯甲酸、对苯二酚和酞酸的聚合物；"X-7G"是4HBA和聚对苯二甲酸乙二酯在熔融状 态下的聚合物；"Vectra"是对羟基苯甲酸和2-羟基-6-萘甲酸熔融聚合物；"Tian"是对 羟基苯甲酸和2-羟基-6-萘甲酸及对苯二酚的聚合物。
[0003] 现行的4HBA生产工艺是以石油产物的苯和丙烯出发，在催化剂氯化铝的存在下 高温高压合成异丙苯，然后将异丙苯在80-130°C左右用氧气氧化成过氧化氢异丙苯。过氧 化氢异丙苯在酸性和60-100°C条件下生成苯酚。从苯酚到4HBA的制备有多种方法。常规 工艺是利用Kolbe-Schmitt反应，即将苯酚加入K0H制备成酚钾盐，然后与二氧化碳在高温 高压下进行气固相羧基化反应生成4HBA。整个合成工艺必须在高温高压下进行，需要消耗 大量能源导致生产效率低成本高。特别是合成途径中有环境污染物质苯酚的生成，给工业 排水的处理带来很大困难。
[0004] 对羟基苯甲酸的化学结构类似于芳香族氨基酸，在理论上利用生物的芳香族氨基 酸合成途径，即莽草酸途径（Shikimatepathway)可以合成对羟基苯甲酸。莽草酸途径由 7步反应合成分支酸，是普遍存在于植物、真菌和细菌中的一条重要芳香族化合物合成代谢 途径。第一步是3-脱氧-0 -阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP)合酶催化4-磷酸赤藓糖和 磷酸烯醇式丙酮酸缩合成DAHP。磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤藓糖分别是糖酵解途径和 磷酸戊糖途径上的重要中间代谢产物。从分支酸到对羟基苯甲酸的合成主要有分支酸裂解 酶途径和苯丙素途径。分支酸裂解酶途径由分支酸裂解酶直接催化分支酸生成对羟基苯甲 酸。苯丙素途径是利用植物合成苯丙素的途径。从分支酸合成的苯丙氨酸在解氨酶的催化 下，脱掉氨基生成相应的苯丙素，然后和CoA链接成对羟基肉桂酸-CoA。对羟基肉桂酸-CoA 裂解酶（HCHL)将对羟基肉桂酸-CoA的侧链切割掉生成对羟基苯甲醛，最后氧化成对羟基 苯甲酸。HCHL基因在植物中不存在，需要从外源引入才能在植物细胞内打通从苯丙素合成 对羟基苯甲酸的通路。
[0005] 存在问题：
[0006] (1)随着电子信息化社会的不断发展，对羟基苯甲酸的市场需求量日益增加，现行 的对羟基苯甲酸生产工艺是以石油成分合成而得，在环境污染的不断恶化、人类的生存已 经面临威胁之际，利用可再生资源代替以石油为原料的生产工艺已成为全球当务之急。
[0007] (2)利用光合作用的植物合成对羟基苯甲酸的最大优点是直接利用二氧化碳，省 去了繁琐的木质纤维素的糖化过程。但是植物细胞中含有葡糖基转移酶，将对羟基苯甲酸 葡糖基化或酯化，给下游提纯工程带来困难。另外利用胡萝卜、甜菜和甘蔗等食物资源生产 工业原料会造成粮食价格的上涨，给社会带来不安定因素。
[0008] (3)目前虽然利用利用重组微生物合成对羟基苯甲酸有一定的研宄进展，但是这 些微生物都是本来不合成积累对羟基苯甲酸的菌株，复杂的改造代谢途径和反馈调控机制 给对羟基苯甲酸的高效生产带来局限性。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是要提供一种微泡菌属细菌生物合成对羟基苯甲酸和对羟基苯甲 酸酯类方法，以解决从可再生资源生物合成对羟基苯甲酸和对羟基苯甲酸酯类的问题。
[0010] 本发明的目的是这样实现的：
[0011] a、筛选分离天然合成对羟基苯甲酸和酯类的A4B菌株
[0012] 制备含有指示菌柱的平板，在液体的人工海水培养基中加入2%的琼脂，高压加热 灭菌后，温度降到大约50°C，琼脂凝固之前参入细胞浓度为108/L的B.subtilislml，混匀 后制备成平皿；然后在平皿的中央位置放上一个滤纸片，在滤纸片上滴入待筛选菌株的培 养液；将平皿放在37°C培养箱培养；利用上述方法筛选到一个形成抑菌圈的细菌，即A4B菌 株；
[0013] 在人工海水培养基中加入2 %的葡萄糖作为碳源培养A4B菌株，然后利用液相 色谱分析了次级代谢产物；A4B菌株合成积累对羟基苯甲酸；A4B菌株还合成了对羟基苯 甲酸甲醋（Methyl4HBA)，对羟基苯甲酸乙醋（Ethyl4HBA)，对羟基苯甲酸丙醋（Propyl 4HBA)，对羟基苯甲酸丁酯（Butyl4HBA)，对羟基苯酸庚酯（Heptyl4HBA)和对羟基苯酸壬 酯（Nonoyl4HBA)，各个的合成量大约是2mM;
[0014]b、菌株鉴定
[0015] 提取A4B菌株的总DNA，然后PCR扩增16SrDNA，将PCR产物提纯后进行碱基测序； 通过对序列进行数据库检索和系统进化树构建后，判明A4B菌株属于Microbulbifer微泡 菌，所述的微泡菌广泛存在于世界各地的海洋环境中；
[0016]c、利用A4B菌株生物合成对羟基苯甲酸步骤：
[0017] (1)准备10ml的含有1 %葡萄糖的海水培养基，海水培养基的成分；
[0018] 0NR7a是人工海水培养基，成分如下表。
[0019] 表0NR7的组成
[0020]
【主权项】
1. 一种微泡菌属细菌生物合成对羟基苯甲酸和酯类的方法，其特征是： a、 筛选分离天然合成对羟基苯甲酸和酯类的A4B菌株 制备含有指示菌柱的平板，在液体的人工海水培养基中加入2%的琼脂，高压加热灭菌 后，温度降到大约50°C，琼脂凝固之前参入细胞浓度为IOVl的B. subtilis lml，混匀后制 备成平皿；然后在平皿的中央位置放上一个滤纸片，在滤纸片上滴入待筛选菌株的培养液； 将平皿放在37度培养箱培养；利用上述方法筛选到一个形成抑菌圈的细菌，即A4B菌株； 在人工海水培养基中加入2 %的葡萄糖作为碳源培养A4B菌株，然后利用液相色谱分 析了次级代谢产物；A4B菌株合成积累对羟基苯甲酸；A4B菌株还合成了对羟基苯甲酸甲 酯（MethyI 4HBA)，对羟基苯甲酸乙酯（Ethyl 4HBA)，对羟基苯甲酸丙酯（PropyI 4HBA)， 对羟基苯甲酸丁酯（Butyl 4HBA)，对羟基苯酸庚酯Ofeptyl 4HBA)和对羟基苯酸壬酯 (Nonoyl 4HBA)，各个的合成量大约是2mM ; b、 菌株鉴定 提取A4B菌株的总DNA，然后PCR扩增16S rDNA，将PCR产物提纯后进行碱基测序；通 过对序列进行数据库检索和系统进化树构建后，判明A4B菌株属于Microbulbifer微泡菌， 所述的微泡菌广泛存在于世界各地的海洋环境中； c、 利用A4B菌株生物合成对羟基苯甲酸步骤： (1)准备IOml的含有1 %葡萄糖的海水培养基，海水培养基的成分； 0NR7a是人工海水培养基，成分如下表。 表0NR7的组成
(2) 接种A4B菌株培养24小时，培养温度为35°C这个培养过程是预培养，得到的培养 液是预培养液； (3) 准备IOL的发酵罐，装入8L的含有1 %葡萄糖的海水培养基； (4) 接种IOml预培养的菌液，在35°C培养到稳定后期，利用液相色谱检测葡萄糖消耗 完后停止培养； (5) 离心将菌体除去，收集上清液体，加入盐酸将液体的pH调成酸性； (6) 加入和上清等量的乙酸乙酯萃取对羟基苯甲酸； (7) 收集含有对羟基苯甲酸的乙酸乙酯相，利用蒸发仪蒸发乙酸乙酯，获得对羟基苯甲 酸。 d、利用A4B菌株生物合成对羟基苯甲酸酯类的步骤： (1) 准备IOml的含有1 %葡萄糖的海水培养基； (2) 接种A4B菌株培养24小时，培养温度为35°C这个培养过程是预培养，得到的培养 液是预培养液； (3) 准备IOL的发酵罐，装入8L的含有1 %葡萄糖的海水培养基； (4) 接种IOml预培养的菌液，在35°C培养到稳定后期，利用液相色谱检测葡萄糖消耗 完后停止培养； (5) 离心将菌体除去，收集上清液体； (6) 加入和上清等量的乙酸乙酯萃取对羟基苯甲酸； (7) 收集含有对羟基苯甲酸的乙酸乙酯相，利用蒸发仪蒸发乙酸乙酯，获得对羟基苯甲 酸酯类。
【专利摘要】一种微泡菌生物合成对羟基苯甲酸和酯类的方法。对羟基苯甲酸是合成液晶等用途广泛的有机合成原料，其酯类有抑菌活性，作为防腐剂广泛应用于食品和化妆品的保存上。我们从海洋中发现一种拥有天然合成对羟基苯甲酸和酯类的微泡菌。该菌株培养液中对羟基苯甲酸的最终积累浓度为10mM。合成的酯类包括对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、庚酯和壬酯，各个的合成量大约是2mM。为了获得对羟基苯甲酸，在海水培养基中加入2％葡萄糖培养A4B菌株至稳定期，用盐酸调成酸性后乙酸乙酯萃取可得。在中性条件下萃取培养液可获得酯类。利用该细菌可以从可再生资源生物合成工业原料的对羟基苯甲酸和其酯类，可降低人类对石化资源的过分依赖。
【IPC分类】C12R1-01, C12P7-64, C12P7-62, C12P7-42
【公开号】CN104818301
【申请号】CN201510167409
【发明人】彭学, 冯昭中, 田俊, 朱莉, 许超艳
【申请人】江苏师范大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年4月9日