脑膜炎奈瑟菌血清组x的新的合成寡聚体及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及合成新的高级寡聚体及其制备方法。特别地，本发明涉及脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清组X(下文中为Men?X)寡聚体(更特别地四聚体)的化学合成。本发明提供从使用具有特定链长的经纯化糖的合成途径中获得的Men?X荚膜寡聚体，并且提供所述新的寡聚体，作为用于开发针对由于Men?X感染引起的细菌性脑膜炎的缀合物疫苗的候选物。
【专利说明】
脑膜炎奈瑟菌血清组X的新的合成真聚体及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及合成新的寡聚体及其制备方法。特别地，本发明设及脑膜炎奈瑟菌 (Neisseria meningitidis)血清组《（serogroup X)(下文中为Men-X)寡聚体（更特别地四 聚体)的化学合成，及其作为用于开发针对由于Men-X感染引起的细菌性脑膜炎的缀合物疫 苗的候选物的用途。
【背景技术】
[0002] 细菌性脑膜炎引起约1，70,000的年死亡数，在工业化国家中有至少5%-10%病死 率，且在发展中国家有20 %病死率。肺炎链球菌（Sheptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆 菌巧aemophilus influenzae)b型化ib)和脑膜炎奈瑟菌引起全世界大多数的细菌性脑膜 炎病例。
[0003] 目前已确定了脑膜炎奈瑟菌的总共13个不同血清组（即A、B、C、D、2犯、H、I、K、L、 W135、X、Y和Z)，但感染中约90%是由血清组A、B、C、Y和W135。然而，脑膜炎奈瑟菌的血清组X (Men-X)最近逐渐成为对公共健康的实质性威胁。血清组X被报道出现在北美、欧洲、澳大利 亚及西非。
[0004] 疫苗接种被认为是控制感染性疾病扩散的最有效方式。有覆盖脑膜炎球菌血清组 A、C、Y及W的数种脑膜炎球菌疫苗，然而目前市场中没有可W防护由血清组X引起的脑膜炎 的许可疫苗。所W，存在开发能够提供覆盖血清组X的更广泛保护的更全面疫苗的需求。
[0005] 目前开发了缀合物疫苗W提供针对多糖抗原的更强保护，其通过将弱（多糖)抗原 与载体蛋白质(优选来自于相同的微生物)共价连接产生，从而通过T-细胞依赖性免疫应答 将所述载体的免疫属性赋予所连接的抗原。
[0006] 寡糖或多糖合成的进步W及生物学研究中开发的新技术已经打开了糖类疫苗设 计的新途径。近年来已制备多种有希望的基于糖类的疫苗候选物，其包括天然糖类和合成 产生的糖类两者。
[0007] 天然糖类证明为疫苗形成中的重要组分，但其具有许多缺点。与天然糖类相关的 主要缺点是本身非常具有挑战性的分离与纯化。另外，任何生物污染物或残留的工艺杂质 带来多种质量保证问题。另外，多糖质量不一致性和多糖大小分布问题导致批次不合格。细 菌多糖在可用于缀合前需要进行修饰，导致对表位不同程度的损伤。
[000引然而，基于合成糖类的疫苗相对于天然糖类具有许多优势，包括其限定良好的化 学结构。任何生物污染的机会也更少，并且因此提供更好的安全谱。另外，合成分子在合成 期间可按需要进行修饰W提高在缀合期间的产率，并通过与寡糖分子连接的内置接头(in? built linker) 使在缀合过程期间对免疫原性表位的损伤最小化。
[0009]鉴于Men-X疾病不断提高的发病率，已经有数种方法用于制备合成可模拟天然多 糖的合成Men-X寡糖。例如，国际专利申请no. PCT/US2011/037364(题目为"Synthetic oligosaccharide for Neisseria meningitidis vaccine")公开了用于寡糖及其缀合物 的化学合成的方法。该发明还提供了用于诊断、治疗和预防由脑膜炎奈瑟菌引起的感染的 免疫原性和免疫保护性组合物及其抗体。另外，题目为"Synthesis of Neisseria meningitidis X capsular polysaccharide fragments"的发表文南犬（Laura Morelli和 Luigi Lay; 2013卷，第2期，ARKIVOC)公开了S种可缀合Men-X芙膜多糖片段（capsular polysaccharide fragment)的合成。
[0010] 目前用于寡糖合成的现存系统设及用于合成细菌Men-x多糖的繁琐的生产和纯化 工序。运些方法或者消耗时间或者会产生不同大小寡聚体的混合物。虽然有关于连续性寡 糖制备的概括性陈述，但并没有关于Men-X四聚体和进一步更高级Men-X寡聚体的制备的可 实现的公开。W上公开的现有技术教导了 Men-X二聚体和S聚体芙膜多糖的化学合成。它们 未公开四聚体的形成并且不能产生高产率的二聚体和=聚体。
[0011] 报道于BeiIstein J.Org.Chem.2014，10，2367-2376的S聚体缀合物不能提供良 好的免疫原性。另外，现有技术在合成起始步骤中使用-40°C用于0-叔己基二甲基氯硅烷 (0-the巧Idimethylsilyl chlo;ride，0TDS)脱保护，并且a-憐酸化需要8-9天，然而本发明 在〇°C至室溫进行并且在远远更短的时间内完成。另外，现有技术公开了氨化反应为24-48 小时，然而本发明需要更短的用于氨化反应的时间。
[0012]发明目的
[0013] 因此本发明的主要目的是新的Men-x芙膜寡聚体(优选Men-x四聚体)的合成。
[0014] 本发明的另一目的是提供用于新的Men-x芙膜寡聚体(优选Men-x四聚体)合成的 方法。
[0015] 然而本发明的另一目的是提供利用具有特定链长的经纯化糖的合成途径。
[0016] 然而本发明的另一目的是提供能够用于具有增强效力的针对脑膜炎奈瑟菌的缀 合物疫苗的合成Men-x芙膜寡聚体。
[0017] 然而本发明的另一目的是提供达到纯度物理化学质量标准的合成Men-x芙膜寡聚 体制备方法。
[0018] 然而本发明的另一目的是其成本效率、增强的效力和改善的保质期。
[0019] 发明概述
[0020] 因此，本发明设及新的Men-x芙膜寡聚体的合成，W及通过组合用W构建Men-x寡 糖主链的两种构建单元(building block)来合成所述Men-x芙膜寡聚体的方法。所述两种 构建单元命名为延伸单元(propagation unit)和末端单元(termination unit)。将所述延 伸单元添加至末端单元，所述末端单元在任一端终止该链。
[0021] 用于合成延伸单元的原料为糖单糖，包括葡糖胺盐酸盐，其为丰富且廉价的原料。
[0022] 在一个实施方案中，此合成的关键步骤为制备a或0端基异构体(anomer)，优选糖 麟酸醋（sugar地OS地onate)的a端基异构体。
[0023] 全部合成顺序在多克级(multigram)规模上进行优化，W该方式其只在几个步骤 内包括柱纯化。该糖巧化导致与接头部分连接的a-端基异构体和e-端基异构体的形成。该 端基异构体混合物利用柱色谱脱保护并分离，导致产生具a或巧妾头立体化学的末端基团。 所述经纯化形式通过iH-NMR分析确认。
[0024] 该二聚体通过利用偶联试剂(如新戊酷氯(pivaloyl chloride))并随后使用舰进 行氧化使延伸单元与末端单元相组合进行制备。为了从二聚体制备四聚体，将二聚体的保 护基团（例如乙酸醋基团)脱保护，并利用与产生二聚体相似的条件使其与延伸单元偶联。
[0025] 该迭代的乙酸醋脱保护和偶联将提供四聚体单元。最终步骤包括(如果需要的话） 叠氮基团向NHAc的一步转化，随后通过碱处理进行保护基（例如乙酸醋、苄基和饥Z)的移 除，W及氨化将提供期望的Men-X高级寡聚体，包括四聚体、五聚体、六聚体等(包含接头）。
[0026] 本发明导致在非常短的时间段内合成所述新的高级寡聚体。
[0027] 本发明使将6C接头与寡聚体连接成为可能，其导致通过在缀合期间提供灵活性使 空间位阻最小化。
[0028] 此外，本发明中的6C接头与糖环直接连接，而不是在现有技术情况中通过憐酸醋 连接。如此安置接头使其得W适当地优化，导致免疫原性W及缀合物疫苗产率提高，并会为 该化合物赋予更好的稳定性。
[0029] 所有使用新方法设计成用于Men-X芙膜多糖的合成的举例说明性步骤导致寡聚体 更好的产率、增强的抗原性(如图1所示）W及超过95%的纯度(如图7和图10中所示）。
[0030] 附图简述
[0031] 图1描述了在使用细菌多糖、带有a接头（1)的合成Men-X四聚体和带有a(l-TT)接 头的合成Men-X四聚体-TT缀合物的抑制性ELISA中抗Men-X抗体与细菌多糖结合的百分比 抑制的图示。
[0032] 图2描述了具有a-接头（1)的Men-X四聚体的1歷时普。
[0033] 图3描述了 1的"C NMR谱。
[0034] 图 4 描述了 1 的DEPT-NMR 谱。
[0035] 图5描述了 1 的2D COSY NMR谱。
[0036] 图6描述了 1 的2D HSQC NMR谱。
[0037] 图7描述了 1的HPLC色谱图。
[003引图8描述了具有fH妾头（1A)的Men-X四聚体的iRMR谱。
[0039] 图9描述了a-接头（1A)的"C NMR谱。
[0040] 图10描述了 1A的HPLC色谱图。
[0041] 发明详述
[0042] 因此，本发明设及脑膜炎芙膜寡糖(更具体地Men-X寡糖）的化学合成，其用于针对 脑膜炎奈瑟菌的缀合物疫苗的开发，脑膜炎奈瑟菌常被称为脑膜炎球菌(meningococcus)， 其为细菌性脑膜炎及其他形式脑膜炎球菌疾病(例如脑膜炎球菌血症(meningococcemia)) 的病原体之一。所述合成按W下步骤完成：
[0043] 1.如方案1所示，合成半缩醒(化合物10)。
[0044] 2.如方案2所示，合成延伸单元(化合物12)和末端单元(化合物14)。
[0045] 3.如方案3所示，合成高级寡聚体。
[0046] 在描述本发明优选实施方案之前，应该理解，该发明不限于所描述的具体材料，因 为其可W变化。也应该理解，本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，且不旨在 W任何方式限制本发明的范围。
[0047] 必须注意的是，除非上下文中另有明确说明，没有数量词修饰的名词表示一个/种 或更多个/种。
[004引术语"化合物(compond r及"化合物(compd r已可互换地使用。
[0049]半缩醒单元的合成：
[0050] 在本发明的一个实施方案中，方案1描述了半缩醒（10)的合成。用于合成Men-X芙 膜寡糖的原料为糖，其选自葡糖胺HC1，更具体地但不限于D(±)葡糖胺HC1化合物(化合物 2)。
[0051] 方案1.半缩醒单元(化合物10)的合成
[0052] 4-0-乙酷基-2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a, 0-D-化喃葡萄糖
[00531
[0054] 在化晚存在下，使葡糖胺HC1经受重氮基转移试剂(例如但不限于咪挫-1-横酷叠 氮化物、Na2C〇3、CuS〇4.甜2〇)W获得化合物3。用于将化合物2转化为化合物3的有机溶剂选 自但不限于甲醇或乙醇，或其中任一种与水的组合。在〇°C至室溫，将如此获得的化合物3与 供体基团（如对甲苯硫酪、S氣化棚乙酸（boron trifluoride diethyl etherate， BF3.0Et2)和无水二氯甲烧(DCM))反应3天至4天，W获得化合物4。用于将化合物3转化为化 合物4的有机溶剂选自二氯甲烧、乙腊或氯仿。在0°C至室溫，在选自甲醇或乙醇或其在水中 的混合物的组合的有机溶剂存在下，将如此获得的化合物4经受脱乙酷化试剂（例如甲醇 钢)3小时至7小时(优选4小时），得到化合物5。将如此获得的化合物5通过在有机溶剂(选自 但不限于乙腊或二氯甲烧)存在或不存在下与苯甲醒二甲缩醒[PhCH(0Me)2]、对甲苯横酸 (p-TSA)、乙腊在室溫下反应过夜来进行亚苄基(benzyl idene)保护。该反应导致形成化合 物6,随后使其在有机溶剂(选自但不限于二甲基甲酯胺(DMF)和二甲基亚讽)存在下经受与 苄基漠和氨氧化钢在室溫下2小时至4小时(优选3小时）的苄基保护。W上反应导致形成化 合物7。随后使化合物7在有机溶剂(选自但不限于无水二氯甲烧(DCM)、氯仿、四氨巧喃)存 在下，在与S乙基硅烷化tsSiH)和S氣化棚乙酸(BF3.0Et2)在0°C下反应2小时至4小时（优 选3小时）的同时经受区域选择性开环，产生化合物8。使化合物8在溶剂(选自但不限于化 晚、二氯甲烧和4-二甲氨基化晚(DMAP) (cat.))存在下，在与乙酸酢(Ac2〇)在0°C下反应3.5 小时至5小时(优选4.5小时）的同时进行乙酷化，产生化合物9。使如此获得的化合物9在等 摩尔比例的选自但不限于丙酬:此0、二氯甲烧:出0中与N-漠代班巧酷亚胺(NBS)在0°C下反 应1小时至3小时(优选2小时）的同时经受硫代甲苯基脱保护W形成化合物10。
[0055] 所述化合物10作为合成延伸单元(12) W及两种末端单元（即14和14A)的共同中间 体。
[0056] 制备传播和末端单元的示意图在如下方案2中示出。
[0057] 方案2:延伸单元(化合物12)和末端单元(化合物14和化合物14A)的合成。
[0化引
[0059] 从方案1如此得到的化合物10经受亚憐酷化剂(phospMtylation agentK不限于 亚憐酸二苯醋化晚）W及随后S乙胺化t3N-TEA)与出0的等摩尔混合物（1:1)在室溫下 (85% )2小时(优选1小时），用于取代末端氨W得到化合物11，其为包含a和0二者混合物的 单体组件(monomeric block)。将如此得到的化合物11与憐酸化3P化)和乙腊在室溫下反应4 天，用于选择性且完全地接收化合物11的a端基异构体作为化合物12。如此得到的化合物12 作为Men-X四聚体合成中的延伸单元。
[0060] 化合物9在-5°c下在四氨巧喃中在N-舰代班巧酷亚胺(NIS)和=氣甲横酸存在下 用接头6-(Z-氨基)-1-己醇处理1小时，得到化合物13。所述化合物13通过在室溫至50°C下 与化0Me、Me0H反应经受脱乙酷化，在连续的S个步骤中获得末端单元。如此获得的末端单 元通过硅胶柱色谱进行分离，导致获得具有产生自a位的6C接头的化合物14(Ri = -(C此） sNHCbz，R2 = H)和具有产生自0位的6C接头的化合物14A (Ri = H，R2 = - (C出)6畑况Z)。
[0061 ]如此获得的化合物14和14A作为寡聚体合成的末端单元。
[0062] 寡聚体合成：
[0063] -旦制备了延伸单元和末端单元，后续的寡聚体可于此后通过如下所述方法和如 方案3所示制备。
[0064] 通过使延伸单元12与末端单元14反应W生成化合物15(具有r1 = -(CH2)sN肥bz，R2= H，R3=Ac的a端基异构体)来制备二聚体。相似地，通过使延伸单元12与末端单元14A反应 W产生二聚体化合物15A(具有r1 = H，R2 = -(C此)6NHCbz，R3=Ac的0端基异构体）。上述制备 二聚体的反应如下进行:在偶联试剂(其不限于新戊酷氯偶联试剂)存在下，在化晚中在室 溫下进行30分钟，随后在-40°C下利用舰进行氧化，在化晚:此0(9.72:0.25)中，反应1.5小 时(86 % )，产生具有良好产率的二聚体化合物15和化合物15A(69 % )。
[0065] 方案3.高级寡聚体(二聚体、=聚体和四聚体)的合成
[0066]
[0067] 如此获得的化合物15和化合物15A通过与碱(例如甲醇钢）于甲醇中在0°C至55 °C 下反应1.5小时来脱乙酷化W分别获得化合物16 (定量的）（具有Ri = -(C也)sNHCbz，R2 = H，R3=H的a端基异构体)和化合物16A(78%)(具有r1 = H，R2 = -(C也)6NHCbz，R3 = H的e端基异构 体)。
[0068] 此后，如此获得的二聚体化合物(化合物16和化合物16A)利用相似的偶联试剂和 条件再次与延伸单元12偶联W分别产生具有高产率的S聚体化合物17(具有Ri = -(C出） sNHCbz，R2 = H，R3=Ac 的 a 端基异构体)和化合物 17A(具有 r1 = H，R2 = -(C出)sNHCbz，R3 = Ac 的 0端基异构体）。
[0069] 使所得的化合物17和化合物17A独立地经受脱酷化试剂，分别产生化合物18(具有 Rl = -(畑2)6NHCbz，R2 = H，R3 = H的a端基异构体）和化合物18A(具有Rl = H，R2 = -(畑2) 6畑Cbz，R3 = H的0端基异构体）。
[0070] 使如此获得的所得化合物18和18A经受迭代反应条件W获得高级合成寡聚体(X和 XA)，其包括四聚体（1和1A)、五聚体、六聚体等，更优选化合物19(具有Ri = -(C出)6NHCbz，R2 =H的a端基异构体)和化合物19A (具有Ri = H，R2 = - (C出)6畑Cbz的0端基异构体)的四聚体。
[0071] 使如此获得的化合物19和19A经受：用（a)硫代乙酸和化晚在室溫下处理，导致叠 氮基团转换为NHAc，随后(b)乙酸醋基团脱保护，W及(C)通过氨化进行苄基和化Z脱保护， 运产生包括四聚体（1和1A)、五聚体、六聚体等的高级合成寡聚体(X和XAKMen-X寡聚体的 运两种端基差向异构体均可通过按照上述方案推断出。
[0072] 如此获得的四聚体（1)和（1A)在短时间段内迅速合成。合成所述四聚体(1)和（1A) 所用时间为225小时至276小时，优选257小时。
[0073] 如此获得的端基异构体寡聚物（即Men-X四聚体巧日Men-X四聚体1A)中的任一种或 二者均用作用于开发针对由于Men-X感染引起的细菌性脑膜炎的缀合物疫苗的潜在候选 物。
[0074] Men-X 四聚体 1
[0078] 上述的方法详述通过非限制性实施例举例说明：
[007
[007
[007 实施例：
[0079] 实施例1:化合物3的合成：
[0080] 1，3,4,6-四-0-乙酷基-2-叠氮基-2-脱氧-0-化喃葡萄糖(3):
[0081]
[0082]向揽拌中的在甲醇中的葡糖胺溶液(20gm，93mmo 1)添加 IH-咪挫-1-横酷叠氮化物 (19.3gm，llOmmol)，随后添加无水碳酸钢（19.7gm，186mmol)。使反应混合物在氮气氛下在 室溫(rt)下揽拌15min。向反应混合物添加化S化.5出0(97111旨，9.3111111〇1)并在室溫下揽拌化。 在反应完成后（通过化C监测），反应混合物通过布氏漏斗过滤。W 10%甲醇：乙酸乙醋 (200mL)洗涂固体残留物。该粗制反应物料2-叠氮基-2-脱氧-D-葡萄糖(20g)原样用于下一 步骤。
[008：3]向揽拌中的在[I比晚（120mL)中的2-叠氮基-2-脱氧-D-葡萄糖（20邑111，971]11]1〇1)逐滴 添加乙酸酢（80mL，776mmol)。使反应混合物在0°C揽拌化，并在室溫下揽拌化。反应完成后 (通过TLC监测），将该反应混合物在减压下浓缩m去除过量的化晚）。将固体残留物W此0 (200mL)稀释并W30%乙酸乙醋:石油酸(pet ether)(200血)抽提两次。通过无水硫酸钢将 有机层干燥，过滤并浓缩。经过两步W92%产率获得16g的纯产物3。
[0084]实施例2:化合物4的合成：
[00化]4-甲基苯基3，4，6-S-0-乙酷基-2-叠氮基-2-脱氧-1-硫代-a，0-D-化喃葡糖巧 (4)：
[0086]
[0087] 巧氮气氛h巧0"C h问携拌中的在DCMQ.2升）中的1，3,4,6-四-0-乙酷基-2-叠氮 基-2-脱氧-D-II比喃葡萄糖(3)(120gm，321mmol)添加对甲苯硫酪(79.8gm，643mmol)。揽拌反 应混合物5min，随后在氮气氛下经过30min逐滴添加 BF3.0Et2( 119mL，965mmol)。使反应在室 溫下揽拌72h。在耗尽最大量原料后（通过化C监测），将反应混合物冷却至0°C并W化H(X)3 (1L)稀释至抑中性。通过无水硫酸钢将抽提的有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗制残 余物通过快速凝胶柱色谱纯化，使用2%乙酸乙醋:石油酸用作洗脱剂W得到黄色糖浆状化 合物（syrup compound)4,80gm，60%产率。
[008引实施例3:化合物5的合成：
[0089] 4-甲基苯基2-叠氮基-2-脱氧-1-硫代-a,0-D-化喃葡糖巧(5):
[0090]
[0091] 在氮气氛下在0°C下，向揽拌中的MeOH( 1升）中的过乙酷化硫代糖巧4(82gm， 187111111〇1)溶液经301]1；[]1逐份添加化016(40.4肖1]1，437111111〇1)。使反应混合物在室溫下再揽拌 池。反应完成后(通过化C监测），向反应混合物中添加乙酸，直至反应混合物的pH变为中性。 用乙酸乙醋(800mL)将该反应混合物抽提两次。通过无水硫酸钢将分离的有机层干燥，过滤 并在减压下浓缩。llOg粗制产物直接用于下一步骤。
[0092] 实施例4:化合物6的合成：
[0093] 4-甲基苯基2-叠氮基-4,6-0-亚苄基-2-脱氧-1-硫代-a,0-D-化喃葡糖巧(6):
[0094]
[0095] 向揽拌中的乙腊（1L)中的S醇硫代糖巧5(ll〇gm，353mmol)溶液添加苯甲醒二甲 缩醒（106血，707mmol)，随后一次性添加 PTSA(6.6gm，35.3mmol)。使反应混合物在室溫下揽 拌过夜。反应完成后(通过化C监测），W水（1L)将反应混合物稀释并W乙酸乙醋（1L)抽提两 次。通过无水硫酸钢将合并的有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。WDCM(500mL)将粗制物料 稀释，随后添加石油酸(2L)导致产物沉淀(类白色固体）。通过布氏漏斗过滤沉淀，收集浅黄 白色(buff white)残留物并干燥。分离到lOOgm 71 %的纯产物6。
[0096] 实施例5:化合物7的合成：
[0097] 4-甲基苯基2-叠氮基-4,6-0-亚苄基-3-0-苄基-2-脱氧-1-硫代-a, 0-D-化喃葡糖 巧(7):
[009引
[0099] 在氮气氛下在室溫下，向揽拌中的DMF(300mL)中的亚苄基醇6(90gm，225mmol)溶 液添加化〇H(22gm，563mmol)，随后添加催化量的TBAI (4. Igm，11.25mmol)。使反应混合物在 室溫下揽拌15min。随后经30min逐滴添加苄基漠（52.2mL，450mmol)。使反应混合物在室溫 下再揽拌化。反应完成后(通过化C监测），W冰冷的水(900mL)将反应混合物稀释，其导致形 成固体沉淀。通过Whatman滤纸将该固体物料滤出。W水巧OOmL)洗涂该固体物料，随后W石 油酸(450mL)洗涂两次，在真空下干燥残留物。W91%的产率作为纯产物7获得的lOOg浅黄 白色固体。
[0100] 实施例6:化合物8的合成：
[0101] 4-甲基苯基2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-1-硫代-a,0-D-化喃葡糖巧(8):
[0102]
[0103] 在氮气氛下在0°C下，向揽拌中的DCM( 600mL)中的化合物7 (30gm，61.27mmo 1)溶液 添加 S乙基硅烷（1171111^，735111111〇1)。使反应混合物在0°(：下揽拌15111111，随后逐滴添加 B的.0Et2 (11.6血，91.9mmo 1)，并使其在相同溫度下揽拌池。反应完成后，在0 °C下，该反应混 合物W饱和碳酸氨钢溶液(300mL)稀释，并且通过抽提分离有机层。WDCM(300mL)将水层再 抽提一次并分离。通过无水硫酸钢将所收集的有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗制残 余物通过快速娃凝胶柱色谱纯化，使用石油酸：乙酸乙醋（7:3)作为洗脱剂W得到2?白色 固体化合物8,产率95 %。
[0104] 实施例7:化合物9的合成：
[0105] 4-甲基苯基4-0-乙酷基-2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-1-硫代-a, 0-D-化喃 葡糖巧(9):
[0106]
[0107] 在氮气氛下在0°C下，向揽拌中的化晚（IL)中的二节醇8(90gm，183mmol)溶液添加 乙酸酢(34.5mL，366mmo 1)，随后添加 DMAP(cat.)。使反应混合物在室溫下再揽拌化。反应完 成后(通过化C监测），将该反应混合物在减压下浓缩去除过量的化晚）。将残留物W水 (900mL)稀释并W乙酸乙醋(900mL)抽提两次。通过无水硫酸钢将合并的有机层干燥，过滤 并浓缩。未经纯化，获得85g( 98 %产率)的纯产物9。
[0108] 实施例8:化合物10的合成：
[0109] 4-0-乙酷基-2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a,0-D-化喃葡萄糖（10):
[0110]
[0111] 在〇°C下，向揽拌中的丙酬:水(7:l)(240mL)中的化合物9(10gm，18.7mmol)溶液逐 份添加 NBS(13.3mL，74.9mmol)。使反应混合物在相同溫度下揽拌30min至化。反应完成后 (通过化C监测），将该反应混合物W饱和硫代硫酸钢（20mL)泽灭反应，并在减压下浓缩。W DCM( 300mL)抽提反应物料3次。通过无水硫酸钢将合并的有机层干燥、过滤并浓缩。粗制物 料利用石油酸中的10%乙酸乙醋通过二氧化娃纯化W获得作为淡黄白色固体的径基化合 物7g，85%产率。
[0112] 实施例9:化合物12的合成：
[0113] 4-0-乙酷基-2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基氨麟酸醋（12):
[0114]
[011引将半缩醒化合物10(4.5g，10.5mmol)溶解于化晚（45mL)中，并W亚憐酸二苯醋 (14. ImL，73.7mmo 1)缓慢处理。使所得反应混合物在室溫下揽拌化。将该反应混合物在0°C 下W化3N:出0(1:1，40血)稀释，并使其再揽拌30111111。将该反应混合物在减压下浓缩，且然后 将其利用甲苯共蒸发（coevaporate)两次。将残留物W饱和化20)3(50mL)稀释，并利用DCM (60* 2)抽提。将有机层过滤、通过无水硫酸钢干燥并在减压下浓缩。将残余物通过快速凝 胶柱色谱纯化，使用Me0H:DCM+l%TEA(05:95)作为洗脱剂W得到暗淡黄色糖浆状麟酸醋 (4邑，81%)。上述获得的麟酸醋端基异构体混合物产物(4肖，6.611111101)和催化量的麟酸在室 溫下、在无水乙腊中揽拌4天。通过在(TC下添加=乙胺(2.5mL)泽灭反应，在真空下浓缩并 W饱和化20)3(100血)稀释，且在DCM中抽提（100mL*2)。将有机层干燥(化2S04)并在减压下 浓缩W产生粗制产物，其利用MeOH-DCM+1 %化3N(3 :97)作为洗脱剂在快速二氧化娃上纯化 W获得作为栋色浓稠糖浆状物的纯化合物12(2g，50% )。
[0116] 实施例10:化合物14和14A的合成：
[0117] 6-(节氧幾基)氨基己基2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖巧（14) 和6-(节氧幾基)氨基己基2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-0-D-化喃葡糖巧（14A):
[011 引
[0119] 4-甲基苯基-4-0-乙酷基-2-叠氮基-3，6-二-0-苄基-2-脱氧-1-硫代-a，e-D-化喃 葡糖巧（9)(6.8g，12.7mmol)、NIS(5.72gm，25.4mmol)和N-(6-?基己基）氨基甲酸节醋 (3.8gm，15.2mmo 1)溶解于THF(80mU中，揽拌并在-5 °C下在惰性气氛中冷却。向上述混合物 经5min逐滴添加 S氣甲横酸(0.05mL)，并将该反应混合物在相同溫度下揽拌比。完成后，将 反应混合物W化2S2O3和化HC03的饱和溶液（各200mL)稀释。将反应混合物W乙酸乙醋 (lOOmL)抽提S次。通过无水硫酸钢将合并的有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗制反 应物料进一步用于脱乙酷化。将粗制反应物料溶解于甲醇（70mL)中并在室溫下经lOmin逐 份添加化OMe(2.2gm)。在50°C下将反应混合物加热比。完成后，将反应混合物冷却至室溫并 WAmberlite IR120酸性树脂中和至中性抑。将反应混合物通过Whatman滤纸过滤，并将滤 液在减压下浓缩。将粗制产物通过快速凝胶柱色谱纯化，使用15%-20%乙酸乙醋:石油酸 作为洗脱剂W得到作为黄色浓稠糖浆状物的化合物14(2.1g，27%)和144(1.8肖，18%产 率)。
[0120] 实施例11:化合物15和15A的合成：
[0121 ] 6-(节氧幾基)氨基己基(4-〇-乙酷基-2-叠氮基-3，6-二-〇-苄基-2-脱氧-a-D-Il比 喃葡糖基憐酸醋)-(1^4)-2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡萄糖巧，S乙锭 盐(15)
[0122] 和
[0123] 6-(节氧幾基)氨基己基(4-〇-乙酷基-2-叠氮基-3，6-二-〇-苄基-2-脱氧-a-D-Il比 喃葡糖基憐酸醋)-(1^4)-2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-0-D-化喃葡萄糖巧，S乙锭 盐(15A)
[0124]
[0125] a-H-麟酸醋 12 (2.87gm，4.84mmol)和醇 14 (1.5gm，2.42mmol)的混合物与无水化晚 在真空中共蒸发S次。将该混合物溶解于无水化晚(50mL)中并在氮气氛下在室溫下逐滴添 加新戊酷氯(0.9血，lOmmol)并继续揽拌1/2小时。将反应混合物冷却至-40°C，经过15min添 加化晚：此〇(8mM 9.75:0.25)中的12(1.2gm，4.85mmol)溶液并揽拌化。利用化2S2O3.甜2〇水 溶液（200mL，1M)泽灭反应混合物。将反应混合物W此0(200mL)稀释并利用DCM(300mL * 2) 抽提。通过无水硫酸钢将分离的有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。粗制产物利用MeOH-DCM + l%Et3N(4: 96)作为洗脱剂在快速二氧化娃上纯化W获得作为浓稠液体的纯化合物15 (2.5邑，86%)。相似地，〇-护麟酸醋12与144在相同条件下反应^69%的产率获得15八。
[0126] 实施例12:化合物16和16A的合成：
[0127] 6-(节氧幾基)氨基己基(2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋)-(1 一 4)-2-叠氮基-3,6-二-〇-苄基-2-脱氧-a-D-Ii比喃葡萄糖巧，立乙锭盐（16)
[012引和
[0129] 6-(节氧幾基)氨基己基(2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋)-(1 一 4)-2-叠氮基-3,6-二-〇-苄基-2-脱氧-0-D-II比喃葡萄糖巧，S乙锭盐（16A)
[0130]
[0131] 将含有0.25M C曲ONa的甲醇(25mL)中的二聚体化合物15 (2.5g，2.04mmo 1)溶液在 55°C下揽拌1.化。将反应混合物冷却至室溫并WAmberlite IR-12(KH+)树脂中和，通过 Whatman滤纸过滤并浓缩。粗制产物利用MeOH-DCM+1%化3N(4:96)作为洗脱剂在快速二氧 化娃上纯化W获得栋色糖浆状物的纯化合物16(2.4g，定量）。相似地，使化合物15A与甲醇 钢在相同条件下反应W78%的产率获得16A。
[0132] 实施例13:化合物17和17A的合成：
[0133] 6-(节氧幾基)氨基己基(4-〇-乙酷基-2-叠氮基-3，6-二-〇-苄基-2-脱氧-a-D-[l比 喃葡糖基憐酸醋）-(1^4)-(2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)- (1 一4)-2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖巧，双乙基锭盐（17)
[0134]和
[OU日]6-(节氧幾基）氨基己基（4-〇-乙酷基-2-叠氮基-3，6-二-〇-苄基-2-脱氧-a-D-[l比 喃葡糖基憐酸醋）-(1^4)-(2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)- (1 一4)-2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-0-D-化喃葡糖巧，双乙基锭盐（17A)
[0136]
[0137] a-H-麟酸醋 12 (2.55gm，4.29mmol)与醇 14 (1.7gm，1.43mmol)的混合物与无水化晚 在真空中共蒸发S次。将残留物溶解于无水化晚(40mL)并在室溫下经lOmin逐滴添加新戊 酷氯（1.07111]^，8.581]11]1〇1)并揽拌30111；[]1。将反应混合物冷却至-40°[，经过15111；[]1添加溶于11比 晚：水(9.75:0.25，1 OmL)中的12 (2.1 gm，8.58mmo 1，6eq.)溶液。冷却停止并使反应混合物再 揽拌化。通过添加饱和的化2S2O3.5此0溶液（50mL)泽灭反应。将反应混合物冷却至室溫，稀 释于水（lOOmL)并利用DCM(400mL)抽提两次。通过无水硫酸钢将分离的有机层干燥，过滤并 在减压下浓缩。残留物使用MeOH-DCM+l%Et3N(5:96)作为洗脱剂通过快速硅胶柱色谱纯 化，产出作为黄色糖浆状物的化合物17 (1.5g，60 % )。相似地，通过a-H-麟酸醋12与16A在相 同条件下反应W88%的产率制备17A。
[013引实施例14:化合物18和18A的合成：
[0139] 6-(节氧幾基)氨基己基(2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋)-(1^4)-(2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)-(1^4)-2-叠氮 基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖巧，双乙基锭盐（18)
[0140] 和
[0141] 6-(节氧幾基)氨基己基(2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋)-(1^4)-(2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)-(1^4)-2-叠氮
基-3,6-^-0-要其-9-脱窗-B-n-肿耐葡朵唐甘.抑-二7,其缺驻M ?A):
[0142]
[0143] 将甲醇（20mL)中的0.25M 邸3〇化的S聚体化合物17(1.5g，0.85mmol)在55-60°C 下揽拌化。将反应混合物在室溫下冷却，W甲醇(20mL)稀释，并WAmberlite IR-12(KH+)树 脂中和，通过Whatman滤纸过滤并浓缩。粗制产物使用MeOH-DCM+1 %化3N( 5:96)作为洗脱剂 在快速二氧化娃上纯化W产生作为黄色浓稠糖浆状物的纯化合物18(1.3gm，89% )。相似 地，通过与甲醇钢在相同条件下反应W69%的产率制备化合物18A。
[0144] 实施例15:化合物19和19A的合成：
[014日]6-(节氧幾基）氨基己基（4-〇-乙酷基-2-叠氮基-3，6-二-〇-苄基-2-脱氧-a-D-[l比 喃葡糖基憐酸醋）-(1^4)-(2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)- (1^4)-(2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡萄糖基憐酸醋）-(1^4)-2-叠氮 基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖巧，乙基锭盐（19)
[0146]和
[0147] 6-(节氧幾基）氨基己基（4-〇-乙酷基-2-叠氮基-3，6-二-〇-苄基-2-脱氧-a-D-[l比 喃葡糖基憐酸醋）-(1^4)-(2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)- (1^4)-(2-叠氮基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡萄糖基憐酸醋）-(1^4)-2-叠氮 基-3，6-二-0-苄基-2-脱氧-0-D-化喃葡糖巧，乙基锭盐（19A)
[014 引
[0149]二聚悴巧巷化甘物 i8 U . 3gm，U. Y bmmoU 与a-H-勝酸鹏 iZ U . 3gm，Z. 25mmo 1)的混 合物与无水化晚在真空中共蒸发S次。将混合物溶解于无水化晚(30mL)并在惰性气氛中的 室溫下经lOmin逐滴添加新戊酷氯(0.65mL，5.25mmol)。将反应混合物揽拌30min。将反应混 合物冷却至-40°0，经过15111；[]1添加11比晚：水(9.75:0.25,3111〇中的12(1.3邑111，5.251]11]1〇1)溶 液。停止冷却并使反应混合物再揽拌化。通过添加饱和化2S2O3.5此0溶液(50mL)泽灭反应。 将反应混合物冷却至室溫，用水稀释（lOOmL)并通过DCM(200mL)抽提两次。通过无水硫酸钢 将分离的有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。残留物使用MeOH-DCM+1%化3N(5:96)作为洗 脱剂通过快速硅胶柱色谱纯化，W产出作为黄色半固体的化合物19(0.9g，53%)。相似地， 通过与a-H-麟酸醋12在相同条件下反应W80%的产率制备19A。
[0150] 实施例16:化合物Men-X四聚体1和1A的合成：
[0151 ] 6-(节氧幾基)氨基己基(4-0-乙酷基-2-乙酷氨基-3,6-二-〇-苄基-2-脱氧-a-D- 化喃葡糖基憐酸醋)-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡萄糖憐酸醋）-(1 一 4)-2-乙 酷氨基-3，6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖巧，乙基锭盐（1)
[0152]和
[0153] 6-(节氧幾基)氨基己基(4-0-乙酷基-2-乙酷氨基-3,6-二-〇-苄基-2-脱氧-a-D- 化喃葡糖基憐酸醋)-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡萄糖憐酸醋）-(1 一 4)-2-乙 酷氨基-3,6-二-〇-韦基-2-脱氧-0-D-II比喃葡糖巧，乙基馈盐（1A)
[0154]
[0155] 在惰性气氛下在室溫下，向揽拌中的无水化晚（lOmL)中的四聚体叠氮化合物19 (0.9g，0.4mmo 1)溶液中，经lOmin逐滴添加硫代乙酸(3.2mL，过量）。使反应混合物在相同气 溫下揽拌过夜。反应完成后（通过化C监测），W冰水（30mL)、随后W饱和碳酸氨钢溶液 (20mL)稀释反应混合物。将反应混合物通过(70mL)DCM抽提两次。通过无水硫酸钢将分离的 有机层干燥，过滤并在减压下浓缩。残留物通过最小体积的DCM(4mL)稀释，随后添加石油酸 (40mL)，运导致产物固体沉淀。倒出有机层，将残留物使用5%-10%Me0H:DCM+l%TEA作为 洗脱剂通过柱色谱纯化W得到作为栋色半固体的N-乙酷基四聚体化合物。分离产率： 600111旨，45%。相似地，在化晚中使化合物194与硫代乙酸在相同条件下反应^40%的产率获 得用NHAC替代化的化合物。
[0156] 6-(节氧幾基)氨基己基(2-乙酷氨基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐 酸醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋）-(1 一 4)- (2-乙酷氨基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)-(1 一 4)-2-乙酷氨基-3,6- 二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖巧，乙基锭盐6-(节氧幾基)氨基己基(2-乙酷氨基- 3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-3,6-二-0-苄基- 2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-化喃 葡糖基憐酸醋)-(1^4)-2-乙酷氨基-3,6-二-0-苄基-2-脱氧-0-D-化喃葡糖巧，乙基 锭盐：
[0157]
[0158] 在氮气氛下，向攒拌中的无水甲醇（20mL)中的来自上一步骤的N-乙酷基四聚体 (600mg，0.253mmol)溶液中，经5min逐份添加化016(60〇111肖，过量）。将反应混合物加热至60 °C，保持1.化。将反应混合物冷却至室溫并使用Amberlite IR-120树脂中和。将反应混合物 通过肺atman滤纸过滤并将残留物用甲醇（50mL)洗涂2-3次。将所收集的滤液在减压下浓 缩。将粗制反应物料使用10 % MeOH: DCM+1 % TEA作为洗脱剂通过快速凝胶柱纯化W产出四 聚体径基化合物(500mg，84%)。在相似条件下具有巧妾头的四聚体W76%的产率脱乙酷化。
[0159] 6-氨基己基（2-乙酷氨基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨 基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋)-(1^4)-2-乙酷氨基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖巧，S钢盐(Men X四聚体1)和6-氨基己基 (2-乙酷氨基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-2-脱氧-a-D-化喃葡 糖基憐酸醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋）-(1 一 4)-2-乙酷氨 基-2-脱氧-0-D-化喃葡糖巧，S钢盐(Men X四聚体1A):
[0160]
1234 在惰性气氛下在室溫下，向甲醇:水，l:l(30mL)中的来自上一步骤中制备的四聚 体径基（300mg，0.128mmo 1)溶液中，添力日Pd (0H) 2/C(20mo 1 %，600mg)。将反应混合物在氨气 氛下W104psi揽拌15h。反应完成后(通过化C监测），将反应混合物通过娃藻±柱床(ce 1 ite bed)过滤。将该娃藻±柱床W30mL的此0洗涂=次。将分离的滤液在减压下浓缩。将粗制物 料通过溶剂处理纯化。将残留物通过DCM洗涂，随后通过冷甲醇洗涂(5mL* 2)次。获得白色 固体化合物。分离产率：120mg，86 %，册SEC纯度：98%。准确质量：1235.84。观测质量(M- Na)-1212.34〇 2 IR: :3436，2517，1632，1383，1443，1204. 3
[016；3] 1h 醒R(500MHz，D20)S5.55-5.44(m，3H)，4.10-3.96(m，4H)，3.96-3.83(m，llH)， 3.82-3.56(m，12H)，3.50(t，J=9.8Hz，lH)，3.45-3.42(m，lH)，2.93(s，2H)，2.10-1.92(m， 12H)，1.69-1.48(m，4H)，1.43-1.27(m，4H). 4 1化 NMR(126MHz，D20)6174.5,174.4,174.2,171.0,96.4,94.4,94.3,94.1,94.0， 74.4,74.3,73.8,73.7,73.0,72.0,71.2,70.8,70.7,70.1,69.9,69.4,68.0,60.3,60.2， 60.0,53.7,53.6,53.5,53.4,39.4,28.2,26.7,25.3,24.8,22.1,22.0,21.8.
[01化]6-氨基己基（2-乙酷氨基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨 基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋)-(1 一4)-2-乙酷氨基-2-脱氧-a-D-化喃葡糖巧，=钢盐(Men X四聚体1):
[01<
[0167] 在惰性气氛下在室溫下，向甲醇：水7:3(30mL)中的的四聚体径基化合物（lOOmg， 0.042mmol)溶液中，添加 Pd(0H)2/C(20mol%)。将反应混合物在氨气氛下WeOpsi揽拌化。 反应完成后(通过化C监测），将反应混合物通过娃藻±柱床过滤。将该娃藻±柱床W30mL的 此0洗涂=次。将分离的滤液在减压下浓缩。将粗制物料通过溶剂处理纯化。将残留物通过 DCM洗涂，随后通过冷甲醇洗涂（5mL * 2)次。随后将纯产物通过使其与水（5mL)中的Dowex 50W Na+形式（2g)在室溫下反应化经受化离子交换。随后将反应物料通过Whatmann滤纸过 滤。将滤液在减压下浓缩。将粗制物料在真空下干燥化得到白色固体化合物。精确质量： 1235.28;分离产率:38mg，71 %，HP沈C纯度:98 %。
[0168] IR: ：34：34，2067，16：34，1383，1221，1043.
[0169] 1h 醒 R(500MHz，D2〇):如 5.41(bs，3H)，4.39(bs，lH)，3.63-3.91(m，2W)，3.43 (bs，4H)，2.86(bs，2H)，1.94(s，12H)，1.45-1.53(m，4H)，1.25(bs，4H).
[0170] "C NMR(126MHz，D2〇):Sc 177,103.6,96.9,96.8,96.6,77.4,76.7,76.3,75.4, 74.5,73.2,72.8,72.5,71.9,62.9,62.7,62.5,57.9,55.9-56.2,41.9,30.8,29.1,27.7， 27,24.5.
[0171] 分析检测：
[0172] 利用合成Men-X四聚体制备的寡聚体和缀合物(Men-X四聚体-IT缀合物)抗原性质 的确定
[0173] 将合成Men-X四聚体及其与破伤风类毒素的缀合物(Men-X四聚体-TT缀合物）的抗 原性与设及无抗原对照的细菌多糖在竞争性酶联免疫测定化LISA)中进行比较。在该测定 中，将八千倍稀释的兔抗脑膜炎奈瑟菌血清组X抗血清(228801;抓)与W10-100化g寡糖/ml 稀释于憐酸缓冲盐水（其含有0.1%v/v Brij 35和5%FBS)中的不同抗原（即细菌多糖、 Men-X四聚体（1和1A)和利用合成Men-X四聚体制备的缀合物（1-1T和1A-TT))在96孔微孔板 内（板A)中解育1小时。单独的板（板B)WMen-X细菌多糖（PS)和甲基化人血清白蛋白（m- HSA)的混合物包被，并且在2-8°C下解育过夜，随后用5%FBS封闭。对于该板B，添加来自于 板A的抗血清-抗原混合物并在37°C下解育1小时W及在室溫下解育化。将该板WpH 7.4且 含有0.1%化ij 35的憐酸缓冲盐水洗涂。将该板在室溫下与过氧化物酶标记的抗兔IgG抗 体在PBS、0.1 %化ij 35和5 %FBS中解育60分钟。再次洗涂该板，并在室溫下与10化1过氧化 物酶底物3，3/，5，5/ -四甲基联苯胺-出化在乙酸钢缓冲溶液中解育10分钟。通过添加50iil的 2M此S化终止反应。在化ISA读取仪(Tecan微板读取仪)上记录A450。抗血清中的抗体对每种 抗原的百分比抑制如下计算：
[0174] 抑制％ = (0Dnac-0Da)/(0^ac-0Db) X 100
[0175] 其中，ODnac为无抗原对照组的光密度，0化为空白孔的光密度。受试抗原(Men-X四 聚体和Men-X四聚体-TT缀合物)和阳性对照的光密度指代为ODa。图1中，a端基异构体（1)的 数据表示为一式=份进行的测量的平均值±50,对于0端基异构体(1A)观测了相似的数据。
[0176] 该抑制性化ISA结果示出了与"无抗原对照组"相比的基于合成Men X四聚体的TT 缀合物的抗原性。如图1中所示，合成Men-X四聚体及其TT缀合物能够显著程度地中和存在 于血清中的特异性针对脑膜炎奈瑟菌血清组X多糖的抗体(分别高达68 %和89%)并抑制抗 体与板上所包被的细菌Men-X多糖的结合。
【主权项】
1. 合成寡聚体的新方法，所述方法包括以下步骤： -合成半缩醛化合物（10)， -合成延伸单元（12)以及末端单元（14)和（14A)， -在偶联试剂的存在下，将所述延伸单元（12)与所述末端单元（14)偶联，并将所述延伸 单元(12)与所述末端单元(14A)偶联，以分别产生化合物(15)和(15A)， -将所述化合物（15)和（15A)与脱乙酰化试剂反应以获得化合物（16)和（16A)，并且随 后利用所述偶联试剂将化合物(16)和(16A)偶联以获得化合物(17)和(17A)， -在所述脱乙酰化试剂和所述偶联试剂的存在下迭代反应以产生新的高级合成寡聚体 (18、18A、19、19A、1、1A、X、XA)， -通过还原性N-乙酰化试剂一步还原，利用所述脱乙酰化试剂进行脱乙酰化并通过氢 化进行苄基和Cbz的最终脱保护， 使得所述方法产生具有更好产率、高纯度和增强效力的新的高级合成寡聚体(X)和 (XA)〇2. 如权利要求1所述的合成寡聚体的新方法，其中所述新的高级合成寡聚体(X)和(XA) 为四聚体(1)和(1A)。3. 如权利要求1和权利要求2所述的合成寡聚体的新方法，其中合成所述四聚体（1)和 (1A)所用时间为225小时至276小时，优选257小时。4. 如权利要求1和权利要求2所述的合成寡聚体的新方法，其中通过氢化对化合物（1) 进行所述最终脱保护所需的时间为10小时至15小时，且对于化合物（1A)为6小时至8小时。5. 如权利要求1所述的合成寡聚体的新方法，其中所述半缩醛化合物（10)通过以下合 成： a. 使化合物(2)的糖经受重氮基转移试剂和随后乙酰化以获得化合物(3)， b. 使化合物(3)与供体基团反应以获得化合物(4)， c. 使所述化合物(4)在有机溶剂中与脱乙酰化试剂反应以获得化合物(5)， d. 使所述化合物(5)经受亚苄基保护，产生化合物(6)， e. 使所述化合物(6)经受苄基保护以获得化合物(7)， f. 使如此获得的所述化合物(7)经受区域选择性亚苄基开环试剂以获得化合物(8)，使 其经受酰化试剂以获得化合物(9)， g. 使所述化合物(9)在0°C至室温下经受硫代甲苯基脱保护以获得半缩醛化合物（10)。6. 如权利要求1所述的合成寡聚体的新方法，其中所述延伸单元（12)通过以下合成:使 所述半缩醛化合物（10)经受亚磷酰化试剂以获得化合物11，使其经受端基异构化以获得化 合物12。7. 如权利要求1所述的合成寡聚体的新方法，其中所述末端单元（14、14A)通过以下合 成： -使化合物9经受糖苷化反应，产生接头连接以获得化合物13， -使所述化合物13与脱乙酰化试剂反应并经受通过已知方法的纯化以获得化合物14和 14A〇8. 如权利要求1所述的合成寡聚体的新方法，其中所述偶联试剂选自：吡啶存在下的新 戊酰氯、1-金刚烷酰氯。9. 如权利要求1、5和7中所述的合成寡聚体的新方法，其中所述脱乙酰化试剂选自：甲 醇钠、乙醇钠。10. 如权利要求1所述的合成寡聚体的新方法，其中所述最终脱保护试剂选自：Pd(OH)2-H2、披 Pd 碳-H2。11. 如权利要求5所述的合成寡聚体的新方法，其中所述糖为葡糖胺(2)，更具体地但不 限于D( ±)葡糖胺HC1化合物(2)。12. 如权利要求5所述的合成寡聚体的新方法，其中所述重氮基转移试剂选自：1H-咪 唑-1 -磺酰叠氮化物、三氟甲磺酰叠氮化物(Tf N3)。13. 如权利要求5所述的合成寡聚体的新方法，其中所述亚苄基保护通过与例如苯甲醛 二甲基缩醛[PhCH(OMe)2]、苯甲醛的试剂反应获得。14. 如权利要求5所述的合成寡聚体的新方法，其中所述苄基保护通过与例如苄基溴、 氢氧化钠的试剂反应获得。15. 如权利要求5所述的合成寡聚体的新方法，其中所述区域选择性开环试剂选自三乙 基硅烷(Et3SiH)、BF 3.OEt2、硼烷四氢呋喃复合物(BH3.THF)和三氟甲磺酸铜Cu(0Tf) 2的组 合。16. 如权利要求5所述的合成寡聚体的新方法，其中所述酰化试剂为吡啶中的乙酸酐 (Ac20)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。17. 如权利要求5所述的合成寡聚体的新方法，其中所述硫代甲苯基脱保护通过与例如 N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)、三氟甲磺酸银(AgOTf)的试剂反应获 得。18. 如权利要求6所述的合成寡聚体的新方法，其中所述亚磷酰化剂选自：亚磷酸二苯 酯吡啶、三氯化磷、咪唑、氯代亚磷酸水杨酯、磷酸。19. 通过如权利要求1所述方法制备的新的高级合成寡聚体，其中所述新的高级合成寡 聚体(X)和(XA)为具有较高纯度和增强效力的合成荚膜寡聚体。20. 如权利要求1和权利要求19所述的新的合成寡聚体，其中所述新的高级合成寡聚体 (X)为具有高于95%纯度和增强效力的四聚体(1)，其具有以下结构式：21. 如权利要求1和权利要求19所述的新的合成寡聚体，其中所述新的高级合成寡聚体 (XA)为具有高于95%纯度和增强效力的四聚体(1A)，其具有以下结构式：22. 如权利要求20和21所述的新的寡聚体，其中所述新的高级合成寡聚体（1)和（1A)通 过所述接头与糖环直接连接。23. 如权利要求19至22所述的新的寡聚体（1)和（1Α)，其中所述寡聚体能够原样使用或 以衍生化形式使用或与载体蛋白质缀合使用以形成针对由于脑膜炎奈瑟菌 (N. meningitidis)血清组X之脑膜炎的疫苗。
【文档编号】C07H1/02GK106061986SQ201580010063
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年2月24日
【发明人】达温德·吉尔, 基肖尔·哈拉莱, 马诺伊·库马尔·奇卡拉
【申请人】默沙东和惠康基金会合资的希勒曼实验室私人有限公司