一种小麦面团稳定时间分子标记QSt5B?488及其应用
【专利摘要】本发明涉及基因工程技术领域可应用于小麦品质育种领域，具体提供了一种小麦面团稳定时间分子标记，该标记位于小麦5B染色体RAC875_C29431_1849和WSNP_KU_C14332_22613741之间；通过该分子标记的应用，可以检测小麦品种或品系中是否具有增加面团稳定时间QSt5B?488基因位点，以加快优质小麦新品种的选育进程，利用该专用的小麦面团稳定时间分子标记，筛选快速精准，选择目标明确，而且节约了检测和生产成本，可以提高优质小麦品种或品系的选择效率和质量，为分子标记辅助育种和分子设计育种提供理论和实践依据。
【专利说明】
一种小麦面团稳定时间分子标记QSt5B-488及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，可应用于小麦品质育种领域，具体提供了一种小 麦面团稳定时间分子标记。
【背景技术】
[0002] 小麦是世界上种植最为广泛的三大粮食作物之一，其种植面积、总产及在国际贸 易中所占的比例均居粮食作物之首。我国作为世界上小麦生产和消费的第一大国，小麦生 产与国家粮食安全密切相关。随着人们生活水平的提高，品质、营养、健康成为现代社会人 们生活的主要追求。由于小麦面粉含有其它作物所欠缺的面筋，适于制作面包、馒头、面条、 饼干、糕点等多种食品，因此对小麦品质的研究至关重要。
[0003] 小麦品种品质的差异主要受相关基因组成数量和比例决定，多个基因间的协同作 用远大于单一"优异"基因的作用。小麦面团稳定时间由主基因和微效基因共同控制，基因 数目多且效应较低，易受环境影响。在传统育种中需要进行大量的品质检测选择，工作量 大，效率低，难以满足现在的需要。而新兴的分子标记辅助选择不受环境影响，可以进行程 序化早代选择和预测，可显著提高目标性状选择的准确性，对加快改良小麦品质及保障我 国粮食安全具有重要的现实意义和理论价值。目前，一些对品质改良有积极作用的优异基 因和QTL尚未得到充分利用。而与小麦面团稳定时间有关的基因鉴定较少，缺乏分子标记辅 助选择的有效标记。
[0004] 目前小麦品质性状分子标记辅助选择受到以下方面的影响，①前期报道的多数 QTLs不是功能性标记，发表的QTLs位点很少经过育种过程或品种进行有效性验证。②QTLs 实用性差，主要由于报道的QTL位点置信区间大，QTLs过多或存在假阳性QTLs，单一遗传群 体定位的基因位点，准确度差，而且降低了分子辅助选择的实际效率，甚至没法有效应用到 小麦育种中。
[0005] 小麦面团稳定时间，必须经过实验室检测才能确定，无法在田间育种中选择，而且 实验室检测需要150g以上的重量，难以在早代选择。因此，育种中迫切需要提供一种针对于 小麦面团稳定时间的实用性分子标记以利于小麦品质育种。
【发明内容】
[0006] 发明人利用高密度遗传图谱，结合长期研究和探索，提供了一种小麦面团稳定时 间分子标记，该标记长度为l〇9bp，位于小麦5B染色体RAC875_C29431_1849和WSNP_KU_ C14332_22613741之间；通过该分子标记的应用，可以检测小麦品种或品系中是否具增加面 团稳定时间的QSt5B-488基因位点，以加快小麦高品质品种的选育进程，由于采用了专用的 小麦面团稳定时间分子标记，筛选快速精准，而且不受环境影响，选择目标明确;而且节约 了检测成本，大大提高了高产小麦品种或品系的选择效率和质量，提高了 QTL检测的效应和 定位精度，开发了实效性分子标记，利用小麦面团稳定时间分子辅助育种，可以程序化应用 于分子聚合育种实践。
[0007] 发明人提供的具体技术方案如下：
[0008] 小麦面团稳定时间分子标记QSt5B-488位于小麦5B染色体RAC875_C29431_1849和 WSNP_KU_C14332_22613741 之间；其核苷酸序列如SEQ ID N0:1 所述。
[0009] 通过该分子标记的应用，可以检测小麦品种或品系中是否含有增加小麦面团稳定 时间的QSt5B-488基因位点，具体步骤为：
[0010 ]利用特异性引物扩增目标植株的的叶片DNA，获得1313bp的片段，其核苷酸序列如 SEQ ID N0:2所示，之后利用Hhal专一酶酶切后检测是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所 述的片段；
[0011] 判定标准为：不具有增加小麦面团稳定时间的基因位点的品种或品系中出现如 SEQ ID NO: 1所述的109bp的电泳带;具有增加小麦面团稳定时间的基因位点的品种或品系 中缺失该片段。
[0012] 为了配合该分子标记，发明人设计了其特异性引物，其
[0013] 正向引物序列：5/-GAGGTTCTCCCATCCATTGTTCCATTATA-3 /(如SEQIDN0:3所示）
[0014] 反向引物序列：5/-GTGAAGTTGCCGGAGGAGCAATAG-3/(如SEQIDN0:4所示）
[0015] 通过特异性引物的扩增，以及对产物的酶切结果进行判定，通过这种方法可以判 定该位点是否含有小麦面团稳定时间增效基因位点，虽然小麦面团稳定时间受多个基因位 点控制，但是由于本发明所判定的位点为是多年多点或得得主效基因位点，其对于小麦面 团稳定时间有着十分重要的增效效果，故而即可获知待测小麦品种是否具有增加小麦面团 稳定时间的相关基因；为小麦面团稳定时间基因聚合、进而改良小麦品质提供分子基础，从 而可以更好的应用于品种改良中去。
[0016] 综上所述，发明人首次提供了一种小麦面团稳定时间分子标记，该标记位于小麦 5B染色体RAC875_C29431_1849和WSNP_KU_C14332_22613741之间；通过该分子标记的应用， 可以检测小麦品种或品系中是否具有增加小麦面团稳定时间的QSt5B-488基因位点，以加 快小麦高品质品种的选育进程、不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节 约了检测和生产成本，大大提高了优质小麦品种或品系的选择效率和质量。
【附图说明】
[0017] 图1为利用本发明所述的分子标记和判定方法对小麦面团稳定时间不同的株系获 得的PCR扩增体系的酶切验证结果，通过电泳图可知，稳定时间短的株系经过酶切后出现了 109bp的电泳带，而面团稳定时间长株系中则没有出现。
【具体实施方式】
[0018] 下述实施例中除特殊说明之外，所采用的均为本领域现有技术；
[0019] 实施例1小麦的叶片DNA提取
[0020] (1)取约0 · 3-0 · 5g叶片入5mL离心管，液氮速冻后研成粉末；
[0021] (2)加入约1600yL已预热至65 °C的缓冲液S，多次倒置混匀，水浴0.5-lh，其间轻摇 几次以充分混匀；
[0022] (3)降温到室温，等待10分钟，加10-15yL RNA酶（10mg/mL)37°C水浴30钟，其间轻 摇几次以充分混匀，约1次/1 Omin;
[0023] (4)取出离心管，加入等体积1600yL，4°C苯酚(Tris-平衡酚）：氯仿：异戊醇（25: 24:1 (体积比）抽提，轻轻混勾lOmin，4°C冰箱静置5min，然后8000rpm离心10min;
[0024] (5)取上清液于另一管，约1300yL，加入等体积冷氯仿(4°C冰箱放置），轻摇lOmin 混勾，8000rpm 离心 lOmin;
[0025] (6)取上清液于另一管，加100yL 3M NaAC(醋酸钠），加入lOOOyL的冷异丙醇（或2 倍体积的冷乙醇），充分混匀后于_20°C冰箱静置20min;
[0026] (7)用枪头挑出絮状的DNA，用70%乙醇清洗2-3次，稍离心5分钟，去掉乙醇，气干 后(无乙醇气味即可），溶于200yL 1 XTE，轻轻混匀，-20°C储存；
[0027] (8)用微量可见/紫外分光光度计Nan〇Dr〇p2000，测定DNA浓度，稀释DNA浓度为 200ng/yL做为工作液。
[0028]附录:溶液配制：
[0029] (1)3M NaAc(pH 5.2)
[0030] 600mL H20中加408.24g NaAc-3H20,（或者246.24g无水醋酸钠）溶解后用冰醋酸 (冰乙酸)调pH值至5.2,定容至1L，灭菌，备用。
[0031] (2)1ΧΤΕ(ρΗ 8.0)
[0032] 800mL H2O中加 1.211g Tris、0.3723g Na2EDTA-2H2〇,用HCL调pH值至8.0,定容至 1L，灭菌，备用。
[0033] (3)RNA酶：（若商业化配置好的lmL处理好的分装RNA酶，可以直接使用。）
[0034] 将固体RNA酶溶于0.01M NaAc，使酶浓度为10mg/mL，加热至100°C处理15-20min， 慢慢冷却至室温，然后加入〇. 1倍体积1M Tris-HCL(pH 7.4)，分装后于-20°c冰箱保存。
[0035] (4)缓冲液 S
[0036] 按照如下配方配制后，定容至1L。
[0037]
[0038] (5)10%SDS 配制：
[0039] 900ml水中100g溶解电泳级SDS，加热至68度助溶，加几滴浓HCL调节溶液PH到7.2， 加水定容到1L，分装备用。（SDS微细晶，易扩散，需戴面罩。10% SDS无需灭菌。
[0040]实施例2目标产物扩增
[0041 ]正向引物序列：5/-GAGGTTCTCCCATCCATTGTTCCATTATA-3 /(如SEQIDN0:3所示）
[0042] 反向引物序列：5/-GTGAAGTTGCCGGAGGAGCAATAG-3 /(如SEQIDN0:4所示）
[0043] PCR扩增:其PCR扩增体系为20yL
[0044]
[0045] 备注:Mix可用：或（Taq酶0.25yL，DNK 2.0yL，Bufferl.5yL，MgCl 0.4yL配置。）
[0046] 扩增条件：
[0047]
[0048] 通过上述扩增即可获得1313bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0049] 实施例4PCR产物专一性酶切：
[0050] 酶切体系10yL:
[0051] 专一酶 HhaI:0.3yL
[0052] PCR 产物：2yL
[0053] 10 XNE buffer :1. OyL
[0054] ddH20:6yL
[0055] 酶切反应条件:PCR扩增产物中添加 0.3yL Hhal专一酶（市场购得），37°C水浴4h. 然后将酶切体系65°C灭火5min。
[0056] 将上述扩增产物分别在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，扩增产物分子量大小 为1313bp，扩增产物酶切后，不具有增加小麦面团稳定时间的基因位点的品种或品系中出 现109bp的电泳带;具有增加小麦面团稳定时间的基因位点的品种或品系(优质株系）中缺 失该片段。
【主权项】
1. 一种小麦面团稳定时间标记，其特征在于：该标记位于小麦5B染色体RAC875_ C29431_1849和WSNP_KU_C14332_22613741 之间；其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所述。2. 权利要求1所述分子标记在育种中的应用，其特征在于:利用其判定植株是否含有增 加面团稳定时间QSt5B-488基因位点，具体步骤为： 利用特异性引物扩增目标植株的的叶片DNA，获得1313bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，之后利用Hhal专一酶酶切后检测是否含有核苷酸序列如SEQ ID N0:1所述的 片段； 判定标准为：不具有增加小麦面团稳定时间基因位点的品种或品系中出现如SEQ ID NO: 1所述的109bp的电泳带;具有增加小麦面团稳定时间基因位点的品种或品系中该片段 被切碎，该片段缺失。3. 根据权利要求2所述的小麦面团稳定时间分子标记，其特征在于：其特异性引物，正 向引物序列：5/-GAGGTTCTCCCATCCATTGTTCCATTATA-3 /(如SEQIDN0:3所示）；反向引物序 列：5' -GTGAAGTTGCCGGAGGAGCAATAG-3'(如SEQ ID NO: 4所示）。
【文档编号】C12Q1/68GK106086016SQ201610717363
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月24日
【发明人】陈建省, 田纪春, 刘佟佟, 李青芳, 刘凯, 张永祥, 孙彩玲, 王芳芳, 安玉玲
【申请人】山东农业大学