一种小球藻核酸模板的制备方法及其应用
【专利摘要】本申请公开了一种小球藻核酸模板的制备方法及其应用。本申请的小球藻核酸模板制备方法，包括以下步骤，(1)将小球藻藻液在低温下离心，弃上清液；(2)双蒸水对小球藻沉淀重悬、洗涤、低温下离心，重复重悬、洗涤、低温下离心至少一次；(3)双蒸水重悬小球藻沉淀，在95℃～100℃热浴10～30min，即得核酸模板。本申请的小球藻核酸模板制备方法，用少量藻液就可制备出能直接用于PCR的核酸模板，与传统小球藻DNA提取相比，本申请的方法所需藻液量少，所需时间短，仅用双蒸水即可，无需额外试剂，操作简单方便，成本低。本申请为小球藻快速PCR扩增和核酸研究提供了一种简单、高效、稳定，且重复性好的核酸模板制备方法。
【专利说明】
_种小球藻核酸模板的制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本申请涉及小球藻核酸研究领域，特别是涉及一种小球藻核酸模板的制备方法及 其应用。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应(缩写PCR)，是一种分子生物学技术，其作用是体外酶促进合成特 异DNA片段。PCR技术作为扩增目的DNA片段和检测鉴定的手段，广泛运用于生命科学、医学 工程、遗传科学、法医鉴定等领域。PCR技术原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖 于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR扩增反应由三个基本反应步骤构成:变性-退火-延 伸。而进行PCR的基础是，基因组DNA的提取，以基因组DNA为扩增模板，利用人工设计的靶序 列两端互补的寡核苷酸引物，进行特异DNA片段扩增。
[0003] 小球藻(Chlorella spp.)是一类普生性单细胞绿藻，细胞形态呈球形或广椭圆 形，直径3~12μηι，无鞭毛。属于绿藻门（ChIorphyta)绿藻纲（ChIorophyceae)绿球藻目 (ChIorococcales)卵囊藻科(Oocystaceae)小球藻属(ChioreIla)。小球藻具有结构简单、 分布广泛、生长迅速、富含油脂和蛋白质等优点，目前已逐渐成为藻类分子生物学和基因工 程研究的热点，特别是在污水处理、生物柴油、饲料与食品、药用等方面。
[0004] 小球藻基因工程研究的基础是基因组DNA提取和靶标序列PCR，但由于小球藻细胞 壁的组分和结构较为特殊，细胞壁外层还含有可抑制多糖降解作用的孢粉质 (sporopolIenin)，该结构很大地影响了细胞壁的破碎效果，使得小球藻基因组DNA提取和 PCR扩增工序复杂，耗费时间，且效果不佳。
[0005] 此外，采用试剂盒法提取小球藻基因组DNA时，所需样本量大，一般需要20mL浓度 为2.0 X 10VmL的藻量;样本量小时，往往会发生小球藻基因组DNA提取失败，浪费样本的同 时也影响了实验进程。
【发明内容】
[0006] 本申请的目的是提供一种新的小球藻核酸模板的制备方法及其应用。
[0007] 为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
[0008] 本申请的一方面公开了一种小球藻核酸模板的制备方法，包括以下步骤，
[0009] (1)将培养的小球藻藻液在低温下离心，弃上清液；
[0010] (2)采用双蒸水对小球藻沉淀进行重悬、洗涤、低温下离心，重复双蒸水重悬、洗 涤、低温下离心至少一次；
[0011] (3)双蒸水清洗后，再采用双蒸水重悬小球藻沉淀，并将重悬的藻液在95°C~100 °C热浴10~30min，即获得核酸模板，存放4°C冰箱备用。
[0012] 其中，步骤(2)中重复双蒸水重悬、洗涤、低温下离心至少一次是指，在进行了一次 的双蒸水重悬、洗涤、低温下离心后，再进行至少一次的双蒸水重悬、洗涤、低温下离心，即 采用双蒸水洗涤至少两次。
[0013] 需要说明的是，本申请的小球藻核酸模板制备方法，所制备的核酸模板可以直接 用于PCR扩增，但本申请并没有对DNA进行提取，相对于传统的DNA提取后进行PCR扩增而言， 本申请的制备方法，第一，采用极其少量的藻液就可以实现PCR扩增，本申请的一种实现方 式中，仅采用500yL浓度为2.0 X 107/mL小球藻藻液，就可以制备出用于PCR扩增的核酸模 板，而传统的小球藻DNA提取，至少需要相同浓度的藻液20mL，否则可能导致DNA提取失败； 第二，本申请的制备方法，与DNA提取相比，时间更短，更简单易操作，本申请的一种实现方 式中制备核酸模板仅仅需要30-40分钟，而传统的DNA提取至少需要2-3小时。
[0014] 还需要说明的是，相对于传统的原核细胞如大肠杆菌等的菌液PCR而言，本申请的 小球藻属于真核生物，并且，如【背景技术】里面提到的，小球藻特殊的细胞壁结构，使其无法 像菌液PCR那样直接采用培养的藻液进行PCR扩增。正是如此，本申请提出了将其藻液在低 温下离心、洗涤后，再进行高温处理;经过大量的试验证实，通过这样的方法获得的样品，可 以直接用于PCR扩增，从而提出了本申请的核酸模板制备方法。
[0015] 优选的，核酸模板制备方法的步骤(1)和(2)中的低温下离心的温度为4°C。
[0016] 可以理解，4°C离心只是实验室中一个比较常规的设定，在不影响核酸模板的情况 下，可以在试验允许的范围内适当调整，例如4°C左右2°C，或更多，在此不做具体限定。
[0017] 优选的，核酸模板制备方法的步骤(3)中，采用双蒸水重悬小球藻沉淀后，在重悬 的藻液表面加一滴石蜡油，然后再进行热浴。
[0018] 本申请的另一面公开了本申请的制备方法所获得的小球藻核酸模板。
[0019] 可以理解，本申请的制备方法所获得的小球藻核酸模板，其可以直接用于PCR扩 增，因此，也可以直接用于其它需要用到核酸模板的小球藻的核酸研究中，因此，本申请的 再一面公开了本申请制备的小球藻核酸模板在小球藻PCR或核酸研究中的应用。其中，核酸 研究包括但不仅限于DNA测序、基因克隆等。
[0020] 本申请的再一面公开了一种小球藻快速PCR方法，包括以下步骤，
[0021 ] (1)采用少量的小球藻藻液，在低温下离心，弃上清液;采用双蒸水对小球藻沉淀 进行重悬、洗涤、低温下离心，重复双蒸水重悬、洗涤、低温下离心至少一次;双蒸水清洗后， 再采用双蒸水重悬小球藻沉淀，并将重悬的藻液在95°C~100°C热浴10~30min，获得小球 藻核酸模板，存放4 °C冰箱备用；
[0022] (2)采用人工设计的引物，对步骤(1)制备的小球藻核酸模板进行PCR扩增。
[0023]其中，步骤（1)中"采用少量的小球藻藻液"，其少量是针对于小球藻核酸提取所需 要的量而言的，如前面提到的，为了保障小球藻核酸提取成功，通常需要采用浓度为2.OX IOVmL的小球藻藻液至少20mL，而本申请的核酸模板制备方法仅需要相同浓度的小球藻藻 液500yL即可，所以说"采用少量的小球藻藻液"，至于其具体量可以是浓度为2.OX IOVmL 的小球藻藻液SOOyLjmL,其中经本申请的试验证明500yL是完全可以成功制备核酸模板 的，并不排除少于500yL，同样也可以制备出符合使用需求的核酸模板。
[0024] 可以理解，本申请的小球藻快速PCR方法，实际上就是在本申请的小球藻核酸模板 制备方法的基础上提出的，至于PCR扩增所采用的引物，可以是已知的任意的常规PCR、实时 荧光PCR等的引物。本申请的一种实现方式中，为了验证本申请的核酸模板，重新设计了PCR 引物，这将在后续的方案中详细描述。
[0025] 需要说明的是，本申请的小球藻快速PCR，是相对于传统的提取小球藻DNA，然后进 行PCR而言的。本申请的小球藻快速PCR，其核酸模板制备方法简单，仅采用双蒸水即可，制 备时间短，仅30-40分钟即可完成;而传统的DNA提取，不仅需要大量的藻液，而且需要特殊 的试剂盒，操作繁琐，DNA提取试剂也相对较长，需要2-3小时。所以，相对而言，本申请提出 了小球藻快速PCR。
[0026] 优选的，本申请的人工设计的引物包括第一组引物和/或第二组引物;第一组引物 的上下游引物分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列，第二组引物的上下游引物分别 为Seq ID No .3和Seq ID No .4所示序列；
[0027] Seq ID No.l:5'-ACTTGGACGACTGTATGGACTG-3'
[0028] Seq ID No.2:5'-AATACCGTGAGGAGGACCTTG-3'
[0029] Seq ID No.3:5'-AATAAGCATCGGCTAACTCTGTG-3'
[0030] Seq ID No·4:5 '-CCCTCTGCCCCTACCAAAC-3 '。
[0031] 由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
[0032] 本申请的小球藻核酸模板制备方法，采用少量的藻液就可以制备出能直接用于 PCR的核酸模板，与传统的小球藻DNA提取方式相比，本申请的制备方法所需藻液量少，并 且，所需时间短，仅仅采用双蒸水即可，无需额外的试剂，操作简单方便，成本低。本申请为 小球藻快速PCR扩增和核酸研究提供了一种简单、高效、稳定，且重复性好的核酸模板制备 方法，提高了相关研究的工作效率，节约研究成本。
【附图说明】
[0033]图1是本申请实施例中制备的小球藻核酸模板的琼脂糖凝胶电泳图；
[0034]图2是本申请实施例中采用制备的小球藻核酸模板进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电 泳图；
[0035]图3是本申请另一实施例中采用制备的小球藻核酸模板进行PCR扩增的琼脂糖凝 胶电泳图；
[0036]图4是本申请另一实施例中采用制备的小球藻核酸模板进行PCR扩增的琼脂糖凝 胶电泳图。
【具体实施方式】
[0037] 现有技术中，小球藻DNA研究的基础就是DNA提取，但是，DNA提取不仅操作繁琐、复 杂；而且还需要大量的小球藻藻液，研究显示，至少需要约20mL浓度为2.OX IOVmL的藻液， 否则很可能会导致DNA提取失败，DNA提取失败不仅造成资源的极大浪费，也耽误时间，影响 科研进度。正是基于这样的研究背景，本申请的发明人提出，可否像菌液PCR那样，直接采用 藻液进行PCR扩增的设想；但是，研究证实，小球藻特殊的细胞壁结构，使得该设想无法实 现。基于这样的认识，本申请的发明人尝试了多种藻液处理方法，最终提出了，采用少量藻 液在低温下离心，双蒸水洗涤后，重悬，在高温下热浴10~30min，由此获得的样品，可以直 接用于PCR扩增，从而提出了本申请的核酸模板制备方法。
[0038] 通过本申请的核酸模板制备方法，可以避免提取DNA，从而避免了因 DNA提取失败 而带来的风险。并且，本申请的制备方法，相对于DNA提取而言，所需藻液量小，仅500yL浓度 为2.OX IOVmL小球藻藻液即可，处理时间也较DNA提取短。本申请的核酸模板制备方法，为 小球藻快速PCR扩增奠定了基础；同时也为其它基于核酸模板的研究提供了一种行之有效 的方法。
[0039] 下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请 进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
[0040] 实施例一
[0041 ] -、小球藻核酸模板的制备
[0042]本例采用培养的浓度为2.OX IO7AiL的小球藻藻液进行研究，同时制备了三个重 复样本的小球藻核酸模板。本例的小球藻核酸模板制备方法，具体包括如下步骤：
[0043] 1)离心机4°C预冷；
[0044] 2)取3个1.5mL离心管，用于三个重复实验，各吸取500yL小球藻藻液，在4°C转速 1394g离心5min，弃上清；
[0045] 3)各离心管中加入ImL ddH20,重悬，4°C1394g离心5min，弃上清；
[0046] 4)重复步骤3)操作1次；
[0047] 5)向各离心管的小球藻沉淀中，加入IOOyL ddH2〇重悬，重悬的藻液转移至PCR管 中，每个PCR管中加一滴石蜡油，防止加热过程中液体挥发；
[0048] 6)将小球藻悬浮液置于PCR扩增仪或水浴锅中100 °C热浴15min;
[0049] 7)100°C热浴结束，取出PCR管，即获得本例的小球藻核酸模板，标记为CK藻液，置4 C冰箱中待用。
[0050] 同时，本例按照传统的方法提取了小球藻DNA，用以对照。本例采用了20mL培养的 浓度为2 · 0 X IOVmL的小球藻藻液进行DNA提取，DNA提取按照QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit试剂盒操作说明书进行。提取后的基因组DNA(缩写gDNA)取IyL用NanoDrop-2000 (Thermo SCIENIFIC)检测DNA浓度。结果显示，本例提取的gDNA浓度为17.9ng/yL。
[0051] 取5yL提取的gDNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。凝胶电泳结果如图1所 示，图中第一泳道为空白、第二泳道为XDNA/Hind III、第三和第四泳道为对照、第五泳道为 本例提取的其中一个核酸模板样品的电泳条带、第六泳道为DL2000、第七泳道为空白。其中 ADNA/Hind III的电泳条带中，由上到下依序为23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、2322bp、 2027bp;DL2000的电泳条带中，由上到下依序为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和 100bp。图1的结果显示，本例提取的核酸模板样品，在23K处有一明显条带，与预期相符;该 条带有一些拖尾，从拖尾情况看表示样品有轻微降解，但不影响作为PCR模板等使用。
[0052]二、引物设计和合成
[0053]本例以小球藻基因组RbcL基因为靶标序列设计引物，引物设计采用软件Primer Premier 5,设计好的引物交由上海Invitrogen公司合成。本例设计的RbcL基因扩增上下游 引物分别如Seq ID No. 1和Seq ID No.2所示序列。
[0054] Seq ID No.l:5'-ACTTGGACGACTGTATGGACTG-3'
[0055] Seq ID No·2:5 '-AATACCGTGAGGAGGACCTTG-3 '。
[0056] 本例设计的引物扩增的片段理论上为273bp。
[0057] 三、PCR 扩增
[0058]采用本例设计的引物，对本例制备的三个小球藻核酸模板进行扩增，以验证本例 的小球藻核酸模板是否可以直接进行PCR，同时，以提取的gDNA作为参考。具体的，设计3个 CK藻液、3个gDNA重复和3个水空白对照，共计9个PCR反应。
[0059]本例的？0?反应体系为：1〇111111〇1/1上游引物0.541^、1〇111111〇1/1下游引物0.541^、2\ Taq PCR Mastermix 5yL、扩增模板2yL，补充水至10yL。其中扩增模板即CK藻液或gDNA或 水。
[0060] 本例的PCR反应条件为，95°C预变性5min，然后进入35个循环:94°C变性30s、62°C 退火30s、72°C延伸lmin，循环结束后，72°C延伸5min，然后4°C待机。
[0061 ] PCR扩增产物采用1.5 %的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳时间约为0.5h。
[0062]琼脂糖凝胶液：用天平称取1.5g琼脂糖，置于干净的三角瓶中，加入IOOmLl XTAE 缓冲液，在微波炉中加热lmin，使之彻底融化。之后按照1:100000比例加入SYBR Safe DNA Gel stain染料，即IOOmL凝胶液中加 IyL染料，充分混匀。
[0063]凝胶板制备:将电泳装置所配备的塑料胶托放置在胶槽中，注意胶托的放置位置， 在胶托的标有黑色条带的一端插上样品梳。将上述琼脂糖溶液放在室温下，或将三角瓶在 冷水中浸泡待温度下降至60°C时，将琼脂糖溶液倒在胶托上，室温放置30min左右。待琼脂 糖彻底凝固后，轻轻拔出样品梳。
[0064]加样:将凝胶连同胶托一起放到电泳槽中，加入I XTAE缓冲液，使缓冲液淹过凝胶 表面约1mm。用移液器吸取5yL PCR扩增产物，按上样缓冲液:PCR扩增产物=1: 5的体积比 例，将两者混匀，混匀后小心地将混合液加到凝胶的加样孔中。并在其中一个加样孔中加入 DNA Ladder，本例米用的是50bp ladder。
[0065]加样完成后，电泳约0.5h，当指标剂泳动到距凝胶前沿约1.5cm的位置上，停止电 泳。
[0066]采用凝聚成像系统观察电泳情况，结果如图2所示，图中，泳道1-3为gDNA的泳道为 三个gDNA平行试验的PCR产物电泳结果，泳道4-6为三个水空白平行试验的PCR产物电泳结 果，第7泳道为50bp ladder，泳道8-10为三个CK藻液的PCR产物电泳结果;其中50bp ladder 由上到下的条带分别代表500bp、400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、IOObp、50bp。由 图2的结果可见，三个水空白对照都没有条带，证明PCR扩增结果是没问题的；而三个gDNA和 三个CK藻液都有相同的扩增产物，根据50bp ladder判断，六个扩增产物的片段大小在250-300bp的中间约为275bp，与理论扩增片段273bp相符，证明本例制备的小球藻核酸模板与传 统的提取的gDNA-样，可以用于小球藻PCR扩增，并且从亮度来看，六个PCR扩增效率相当， 证明本例制备的小球藻核酸模板可以替换gDNA进行PCR扩增，且具有良好的扩增效率。 [0067] 实施例二
[0068] 本例的小球藻核酸模板制备方法与实施例一相同，唯一的区别在于，本例针对小 球藻悬浮液在PCR扩增仪上热浴的温度改为95°C，并对热浴的时间设计了三个梯度，即对三 组样品分别热浴1〇11^11、2〇 1^11、3〇1^11，每个热浴组设计两个重复。最终获得了六个0(藻液， 即两个热浴IOmin的CK藻液、两个热浴20min的CK藻液和两个热浴30min的CK藻液。
[0069] 采用实施例一相同的引物和PCR扩增体系对本例的CK藻液进行检测。PCR扩增具体 设计了两个热浴IOmin的CK藻液、两个热浴20min的CK藻液、两个热浴30min的CK藻液、两个 水空白对照、两个gDNA平行试验，共计10个PCR反应。
[0070] PCR结束后，采用实施例一相同的方法对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。检测 结果如图3所示，图中，泳道1为50bp ladder，泳道2-7依序为两个热浴IOmin的CK藻液、两个 热浴20min的CK藻液、两个热浴30min的CK藻液的PCR产物电泳结果，泳道8和9为水空白试验 的PCR产物电泳结果，泳道10和11为两个gDNA平行试验的PCR产物电泳结果，泳道12空白没 有点样。由图3的结果可见，两个水空白对照都没有条带，证明PCR扩增结果是没问题的；六 个CK藻液和两个gDNA都有相似的条带，虽然从图中看来似乎有些倾斜，但是，应该是相同的 扩增产物，产生倾斜的原因可能是胶板没放正或者电压不稳定，六个CK藻液和两个gDNA的 扩增结果与理论预期相符，并且，六个CK藻液的扩增结果都很亮，与gDNA的扩增结果相当， 可见，95°C热浴10min、20min或30min都可以制备出符合PCR扩增使用需求的核酸模板。 [0071] 实施例三
[0072]本例设计了不同的引物，对实施例二制备的六个小球藻核酸模板进行扩增，PCR扩 增条件和PCR反应个数设计与实施例二相同。本例的引物是针对小球藻16s基因全长序列设 计的，同样采用用软件Primer Premier 5设计，设计好的引物交由上海Invitrogen公司合 成。本例设计的16s基因扩增上下游引物分别如Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列。
[0073] Seq ID No.3:5'-AATAAGCATCGGCTAACTCTGTG-3'
[0074] Seq ID No·4:5 '-CCCTCTGCCCCTACCAAAC-3 '。
[0075] 本例设计的引物扩增的片段理论上为180bp。
[0076] PCR结束后，采用实施例一相同的方法对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。检测 结果如图4所示，图中，泳道1为50bp ladder，泳道2-7依序为两个热浴IOmin的CK藻液、两个 热浴20min的CK藻液、两个热浴30min的CK藻液的PCR产物电泳结果，泳道8和9为水空白试验 的PCR产物电泳结果，泳道10和11为两个gDNA平行试验的PCR产物电泳结果，泳道12和13空 白没有点样。由图4的结果可见，两个水空白对照都没有条带，证明PCR扩增结果是没问题 的;六个CK藻液和两个gDNA都有相似的条带，虽然从图中看来似乎有些倾斜，但是，应该是 相同的扩增产物，产生倾斜的原因可能是胶板没放正或者电压不稳定，六个CK藻液和两个 gDNA的扩增结果在150-200bp之间，约180bp，与理论预期相符，并且，六个CK藻液的扩增结 果都很亮，与gDNA的扩增结果相当，可见，95 °C热浴IOmin、20min或30min都可以制备出符合 PCR扩增使用需求的核酸模板。此外，本例采用了 16s的扩增引物，同样可以扩增出与传统 gDNA相同的靶标条带，可见本申请制备的小球藻核酸模板，可以适用于各种不同靶标的小 球藻PCR扩增。
[0077]可以理解，虽然本申请没有穷举小球藻全基因组的所有靶标基因，但是，RbcL基因 和16s基因，是小球藻基因工程研究中比较重要的两个基因，采用本申请的核酸模板，都可 以扩增出符合预期的靶标序列，因此，有理由相信，本申请制备的小球藻核酸模板，可以替 换传统的小球藻基因组DNA提取，用于小球藻PCR扩增或其它基因工程研究。
[0078]以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申 请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护 范围。
【主权项】
1. 一种小球藻核酸模板的制备方法，其特征在于:包括以下步骤， (1) 将培养的小球藻藻液在低温下离心，弃上清液； (2) 采用双蒸水对小球藻沉淀进行重悬、洗涤、低温下离心，重复双蒸水重悬、洗涤、低 温下离心至少一次； (3) 双蒸水清洗后，再采用双蒸水重悬小球藻沉淀，并将重悬的藻液在95°C~100°C热 浴10~30min，即获得所述核酸模板。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述步骤（1)和(2)中的低温下离心的 温度为4°C。3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中，采用双蒸水重悬 小球藻沉淀后，在重悬的藻液表面加一滴石蜡油，然后再进行热浴。4. 根据权利要求1-3任一项所述的制备方法获得的小球藻核酸模板。5. 根据权利要求4所述的小球藻核酸模板在小球藻PCR或核酸研究中的应用。6. -种小球藻快速PCR方法，其特征在于:包括以下步骤， (1) 采用少量的小球藻藻液，在低温下离心，弃上清液;采用双蒸水对小球藻沉淀进行 重悬、洗涤、低温下离心，重复双蒸水重悬、洗涤、低温下离心至少一次;双蒸水清洗后，再采 用双蒸水重悬小球藻沉淀，并将重悬的藻液在95 °C~100 °C热浴10~30min，获得小球藻核 酸模板，存放4 °C冰箱备用； (2) 采用人工设计的引物，对步骤(1)制备的所述小球藻核酸模板进行PCR扩增。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述人工设计的引物包括第一组引物和/ 或第二组引物；所述第一组引物的上下游引物分别为Seq ID No. 1和Seq ID No.2所示序 列，所述第二组引物的上下游引物分别为Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列； Seq ID No.l:5'-ACTTGGACGACTGTATGGACTG-3' Seq ID No.2:5'-AATACCGTGAGGAGGACCTTG-3' Seq ID No.3:5'-AATAAGCATCGGCTAACTCTGTG-3' Seq ID No.4:5'-CCCTCTGCCCCTACCAAAC-3'。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤（1)中的低温下离心的温度为4 Γ。9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述步骤(1)中，采用双蒸水重悬小球藻沉 淀后，在将重悬的藻液进行热浴之前，在重悬的藻液表面加一滴石蜡油，然后再进行热浴。
【文档编号】C12Q1/68GK106086203SQ201610548285
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】吴甜, 潘文欢, 顾颖, 李静, 张丹
【申请人】深圳绿倍生态科技有限公司