近红外发光的生物质量子点和NIR比率荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及化学和生物医学技术领域，尤其是涉及生物体及细胞中生物信息检测的材料，具体为近红外发光的生物质量子点和nir比率荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

过氧亚硝酸根(onoo^-)是生物体内一种重要的活性氧，是由体内的一氧化氮自由基(no·)和超氧阴离子自由基(o2^-·)快速反应生成，其生成位点主要在细胞中的线粒体。由于onoo^-具有较强的氧化性和亲核性，可以与各种蛋白质、脂质体、核酸等发生反应，从而造成细胞损伤。

准确测定onoo^-的含量,可以提供精准的生物学信息，对于在分子水平上解释onoo^-相关的损伤机制具有重要的意义。另外，细胞损伤的长期积累与心血管疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、炎症甚至癌症息息相关。因此，对onoo^-的成像和定量分析有助于onoo^-相关疾病的早期诊断。目前检测过onoo^-的方法有很多，其中包括电子顺磁共振光谱法(epr)、紫外可见吸收光谱法、色谱法等，现有的检测方法要么实验设备比较昂贵，要么因为检测物质的原因导致灵敏度较低，选择性较差，且不适合用于细胞和活体中onoo^-的成像检测等问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种近红外发光的生物质量子点及nir比率荧光探针，可以实现低成本检测细胞线粒体内和活体内onoo^-含量。发明内容包括近红外发光的生物质量子点及nir比率荧光探针的制备方法和其应用。检定细胞线粒体内和活体内onoo^-含量能表现出高的灵敏性和好的选择性。

本发明第一方面提供了一种近红外发光的生物质量子点的制备方法。制备方法包括如下过程，其中材料份是按份搭配：

s11:制备叶绿素粗提取液，将18-22g洗净晾干的冬青树叶和18-22ml的无水乙醇在破碎装置中打碎，再将破碎后的冬青树叶溶液倒入烧杯中，加入8-11ml丙酮，搅拌均匀后静置，过滤得到叶绿素粗提液；

s12:在圆底三口烧瓶中加入18-21ml油酸及0.04-0.06gnh2-peg-nh2，充入氩气并在搅拌下升温至245-255℃，待溶液变成橙红色后停止加热，冷却至室温后加入4-6ml叶绿素粗提取液，搅拌均匀后继续升温至175-185℃，在搅拌下反应160-200min，冷却至室温后，加入12mol/l的hcl至溶液为强酸性，再在27-33℃下搅拌反应11-13h；

s13：将混合液转移至分液漏斗，加入0.8-1.2ml超纯水，摇匀，静置分层后，将下层溶液其转移至烧杯中，并用饱和naoh溶液调节溶液ph至中性，用水系滤膜过滤，以去除其中的大颗粒物质；

s14：将滤液转移至透析袋中，在超纯水中透析22-25h后，得到hl-bqds溶液。

具体的，在步骤s13中，用0.2-0.4μm水系滤膜过滤；在步骤s14中，透析袋的型号为mwco:800-2000da。

本发明第二方面提供近红外(nir)发光的生物质量子点，其是按照所述的近红外(nir)发光的生物质量子点的制备方法制得。

本发明第三方面提供一种nir比率荧光探针的制备方法，该方法包括如下步骤，其中材料份是按份搭配：

s21:取10mlhl-bqds溶液，加入32-38μl浓度为3.7-3.9mmol/lcy7nhsester，搅拌反应55-65min，转移至mwco:1800-2500da的透析袋中透析23-25h，以去除多余的cy7nhsester；

s22：在透析后的溶液中加入0.08-0.11gedc和0.008-0.011gnhs，搅拌28-35min，加入32-36μl浓度为2.2-2.3mmol/lcy7-nh3⁺搅拌55-65min后，将溶液转移至mwco:1800-2500da的透析袋中透析22-25h，除去多余的cy7-nh3⁺，即得到hl-bqds-cy7溶液。

本发明第四方面提供nir比率荧光探针，该nir比率荧光探针是根据上述的nir比率荧光探针制备方法制成。

本发明第五方面还提供nir比率荧光探针应用，用于测定生物体细胞线粒体内onoo^-的含量。

进一步的，以比率成像分析来测定生物活体内onoo^-的含量。

一方面，由于cy7上具有线粒体靶向基团，hl-bqds-cy7可以靶向进入细胞中的线粒体，同时hl-bqds-cy7中的cy7可特异性识别细胞线粒体中产生的onoo^-；另一方面，由于hl-bqds的荧光发射光谱与cy7分子的吸收重叠，它们是一对荧光共振能量转移(fret)的供体与受体。当hl-bqds供体与cy7受体共价偶联后，基于fret，hl-bqds的荧光强度降低，而cy7的荧光强度升高，因此构建的hl-bqds-cy7新型荧光探针具有双发射特征。当体系中有onoo^-存在时，探针分子中cy7特异性位点的碳碳双键发生断裂，导致cy7的荧光强度降低，而hl-bqds的荧光强度增加。因此，该探针可作为比率荧光探针检测细胞线粒体内onoo^-含量，并表现出了高的灵敏性和好的选择性。由于其双发射荧光波长均处于近红外区，该hl-bhqs-cy7探针可用于原位比率荧光成像追踪活的单细胞中和活体内内源性onoo^-的产生。另外冬青树叶容易获取，成本低。

本发明将通过实施例并结合附图加以说明。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明中hl-bqds-cy7纳米探针的设计和用于onoo^-检测及体内产生过程追踪的原理示意图；

图2为本发明中hl-bqds的透射电镜及高分辨透射电镜照片；

图3为本发明中hl-bqds和hl-bqds-cy7的x射线衍射(xrd)图；

图4为本发明中hl-bqds的x射线光电子能谱(xps)图；

图5为本发明中hl-bqds的傅里叶红外光谱(firt)图；

图6为本发明中hl-bqds和hl-bqds-cy7的紫外-可见吸收图谱；

图7为本发明中hl-bqds荧光激发光谱、荧光发射光谱及cy7的吸收图谱图；

图8为本发明中hl-bqds共价偶联cy7后，荧光发射谱图；

图9为本发明中hl-bqds-cy7在0-15μmol/lonoo^-存在下的荧光光谱图；

图10为本发明中荧光强度比值(i670/i780)的对数值与onoo^-浓度的线性关系图；

图11为本发明中hl-bqds-cy7探针在其它生物活性分子下的选择性图；

图12为本发明中hl-bqds及hl-bqds-cy7纳米探针的细胞毒性对比图；

图13为本发明中hl-bqds-cy7纳米探针及定位试剂与raw264.7细胞共孵育后亚细胞器的共定位成像图；

图14为本发明中细胞中外源性onoo^-的双通道荧光成像图；

图15为本发明中不同浓度外源性onoo^-存在下活细胞的双通道荧光成像图；

图16为本发明中两个通道在不同浓度sin-1存在下细胞的平均荧光强度；

图17为本发明中不同浓度sin-1存在下两个通道的平均荧光强度比值的对数值与sin-1浓度的线性关系图；

图18为本发明中活细胞中内源性onoo^-的双通道荧光成像；

图19为本发明中单个活细胞中内源性onoo^-产生的实时成像图；

图20为本发明中两个通道中单细胞荧光强度随时间的变化图；

图21为本发明中两通道细胞荧光强度比值的对数值与时间的线性关系图；

图22为本发明中hl-bqds-cy7纳米探针在活体内的荧光稳定性图；

图23为本发明中hl-bqds-cy7纳米探针在扑热息痛(apap)药物刺激下小鼠腹腔内onoo^-产生的实时原位比率荧光成像图；

图24为本发明中hl-bqds-cy7纳米探针在700nm通道及790nm通道在不同时间的荧光强度图；

图25为本发明中hl-bqds-cy7纳米探针在两个通道(i700nm、i790nm)荧光强度的比值随时间增加的变化图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

本发明第一方面提供的一个具体实施例，提供一种近红外(nir)发光的生物质量子点的制备方法，其特征在于包括如下过程，其中材料份是按份搭配：

s11:制备叶绿素粗提取液，将18-22g洗净晾干的冬青树叶和18-22ml的无水乙醇在破碎装置中打碎，再将破碎后的冬青树叶溶液倒入烧杯中，加入8-11ml丙酮，搅拌均匀后静置20-40min，过滤得到叶绿素粗提液；

s12:在圆底三口烧瓶中加入18-21ml油酸及0.04-0.06gnh2-peg-nh2，充入氩气并在搅拌下升温至245-255℃，待溶液变成橙红色后停止加热，冷却至室温后加入4-6ml叶绿素粗提取液，搅拌均匀后继续升温至175-185℃，在搅拌下反应160-200min，冷却至室温后，加入12mol/l的hcl至溶液为强酸性，再在27-33℃下搅拌反应11-13h；

s13：将混合液转移至分液漏斗，加入0.8-1.2ml超纯水，摇匀，静置分层后，将下层溶液其转移至烧杯中，并用饱和naoh溶液调节溶液ph值至中性，用0.2-0.4μm水系滤膜过滤，以去除其中的大颗粒物质；

s14：将滤液转移至mwco:800-2000da的透析袋中，在超纯水中透析22-25h后，得到hl-bqds溶液。

通过以上制备方法制得的hl-bqds溶液即是近红外(nir)发光的生物质碳量子点。

本发明第二方面提供的一个具体实施例，提供一种对onoo^-特异性相应的nir比率荧光探针的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤，其中材料份是按份搭配：

s21:取10mlhl-bqds溶液，加入32-38μl浓度为3.7-3.9mmol/lcy7nhsester，搅拌反应55-65min，转移至mwco:1800-2500da的透析袋中透析23-25h，以去除多余的cy7nhsester；

s22：在透析后的溶液中加入0.08-0.11gedc和0.008-0.011gnhs，搅拌28-35min，加入32-36μl浓度为2.2-2.3mmol/lcy7-nh3⁺搅拌55-65min后，将溶液转移至mwco:1800-2500da的透析袋中透析22-25h，除去多余的cy7-nh3⁺，即得到hl-bqds-cy7溶液。

根据上述步骤s21和22制备得到的hl-bqds-cy7溶液即为对onoo^-特异性相应的nir比率荧光探针。

通过实验方法来验证制备的对近红外(nir)发光的生物质量子点的制备和对onoo^-特异性相应的nir比率荧光探针。

准备的实验试剂有：油酸，聚氧乙烯二胺(nh2-peg-nh2,mw＝2000)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，超氧化钾(ko2)，3-吗啡酰亚胺盐酸盐(3-morpholinosydnoniminehydrochloride，sin-1)和4'-羟基-3'-甲氧基苯乙酮(apocynin)均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2-(n,n-二乙基氨基)-二氮烯-2-氧二乙铵盐(nonoate)，叔丁基过氧化氢(tbuooh)，二乙烯三胺/一氧化氮加合物(diethylenetriamine/nitricoxideadduct，noc-18)，二甲胺四环素盐酸盐(minocycline)，亚硫酸氢钠甲萘醌(msb)及1400w二盐酸化物(1400w)均购于sigma-aldrich公司.脂多糖(lps)，佛波酯(pma)和1×pbs均购于北京索莱宝科技有限公司；γ-干扰素(interferon-gamma，inf-γ)，透析袋(mwco:1000da；mwco:2000da)购于上海生工生物工程股份有限公司；mitolite^tmredfx600，lysobrite^tmred，cyanine7amine(cy7-nh3⁺)，cyanine7monosuccinimidylester(cy7nhsester)均购于aatbioquest,inc.nucviewtm购于genecoporia公司。实验所用细胞株：raw264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；所有裸鼠均购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司；动物实验经广西师范大学动物伦理委员会(no.20150325-xc)同意批准。实验其他化学试剂均为国产分析纯，实验用水为18.2mω·cm。

准备的实验仪器包括：caryeclipse荧光光谱仪(agilenttechnologies，usa)用于荧光光谱的测定，cary-60紫外-可见分光光度计(agilenttechnologies，usa)用于紫外-可见吸收光谱的测定；傅立叶转换红外光谱仪(perkin-elmerinstruments，usa)用于bqds表面基团的表征；x射线粉末衍射仪xrd(rigaku，japan)；爱丁堡fls980型时间分辨荧光光谱仪(edinburgh，england)用于荧光寿命测定；透射电子显微镜(transmissionelectromicrosope，tem，philips，netherlands)用于bqds粒径范围的测定表征；x射线光电子能谱仪(xps，usa)用于bqds元素分析；el×800型酶标仪(biotekinstruments，usa)用于细胞毒性测定；zeisslsm710激光扫描共聚焦显微镜系统(clsm，zeiss，germany)用于活细胞成像的测定；szcl-3b数显智能控温磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；phs-3c型ph计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；kodakinvivofxproimagingsystem(布鲁克)。

一份hl-bqds-cy7溶液的具体制备过程步骤如下，其中的质量和容量或体积根据需要可以同比例变化：

s11:取20g洗净晾干的冬青树叶，放入破碎机中，加入20ml无水乙醇，打碎3min，将破碎的冬青树叶溶液倒入烧杯中，加入10ml丙酮，搅拌均匀后静置30min，过滤，得到叶绿素粗提取液；

s12：在圆底三口烧瓶中加入20ml油酸及0.05gnh2-peg-nh2，充入氩气并在搅拌下升温至250℃，待溶液变成橙红色后停止加热，冷却至室温后加入5ml叶绿素粗提取液，搅拌均匀后继续升温至180℃，在搅拌下反应3h，冷却至室温后，加入12mol/lhcl至溶液为强酸性，在30℃下搅拌反应12h；

s13：将混合液转移至分液漏斗，加入1ml超纯水，摇匀，静置分层后，将下层溶液其转移至烧杯中，并用饱和naoh溶液调节溶液ph至中性，用0.22μm水系滤膜过滤，以去除其中的大颗粒物质；

14：滤液转移至mwco:1000da的透析袋中，在超纯水中透析24h后，得到hl-bqds溶液；

s21：取10mlhl-bqds溶液，加入35μl3.794mmol/lcy7nhsester，搅拌反应1h，转移至mwco:2000da的透析袋中透析24h，以去除多余的cy7nhsester；

s22：在透析后的溶液中加入0.1gedc和0.01gnhs，搅拌30min，加入35μl2.27mmol/lcy7-nh3⁺搅拌1h后，将溶液转移至mwco:2000da的透析袋中透析24h，除去多余的cy7-nh3⁺，得到hl-bqds-cy7溶液。

图1所示，通过上述例子中方法制备的一种在近红外发光的生物质量子点，也就是hl-bqds溶液，然后将近红外染料cy7与其偶联，得到hl-bqds-cy7溶液，即对onoo^-特异性相应的nir比率荧光探针。由于hl-bqds的荧光发射光谱与cy7分子的吸收重叠，当hl-bqds与cy7共价偶联后，基于fret机理，hl-bqds的荧光强度降低，而cy7的荧光强度升高，构建的hl-bqds-cy7新型荧光纳米探针具有双发射特征。当体系中有onoo^-存在时，探针分子中cy7特异性位点的碳碳双键发生断裂，导致cy7的共轭体系破坏，荧光强度降低，而hl-bqds的荧光强度增加。另一方面，由于cy7上具有线粒体靶向基团，hl-bqds-cy7探针可以靶向进入细胞中的线粒体，因此，该探针可作为比率荧光探针检测细胞线粒体内onoo^-含量。由于其双发射荧光波长均处于近红外区，hl-bhqs-cy7可用于原位onoo^-的比率荧光成像，及跟踪活的单细胞中和活体内内源性onoo^-的产生。

下面通过实验对hl-bqds和hl-bqds-cy7表征。

采用透射电镜(tem)分别对hl-bqds的形貌、分散程度和粒径进行了表征。从图2可以看出，hl-bqds具有良好的分散性，直径在2nm左右。图2中(b)图为hl-bqds的高分辨透射电镜图(hrtem)，其晶格常数为0.22μm，对应石墨烯(100)的晶面，说明hl-bqds的石墨化和结晶度比较高。

采用xrd考察了hl-bqds和hl-bqds-cy7的晶型，图3中(a)和(b)分别为hl-bqds和hl-bqds-cy7的xrd图，从图中可以看到在2θ＝23.43°的位置均有一处明显的宽衍射峰，其对应碳结构镜面为(002)，图中没有其它石墨的特征衍射峰。两图相比几乎一样也说明了cy7的修饰并没有改变hl-bqds的结构形态。

采用xps表征了hl-bqds的表面元素组成，如图4所示，hl-bqds主要由c、n、o三种元素组成，所占比例分别为57.31％、4.33％和31.67％；在532.7ev位置出现很强的o1s特征峰，在285.1ev位置出现次强的c1s特征峰，在399.1ev位置出现弱的n1s特征峰。

利用傅立叶转换红外光谱仪表征hl-bqds表面官能团的组成，如图5所示，曲线a,b,c分别为cy7、hl-bqds和hl-bqds-cy7的红外谱图。图中3410cm^-1处峰对应-o-h/n-h伸缩振动峰，可以看到hl-bqds-cy7比hl-bqds有明显的增强，说明cy7通过酰胺键与hl-bqds进行共价偶联，这与实验原理是相符的；2848cm^-1处对应c-h的伸缩振动，1634cm^-1对应c＝c和c＝n弯曲振动，1360-1020cm^-1对应c-o及c-n，hl-bqds-cy7比hl-bqds吸收有明显增强，同时1190cm^-1处附近宽峰吸收增大，为磺酸基特征吸收峰，说明了cy7成功修饰在hl-bqds上。

下面通实验数据考察hl-bqds-cy7的光学性质。

为考察hl-bqds和hl-bqds-cy7的光学性质，首先对hl-bqds和hl-bqds-cy7的紫外-可见吸收光谱进行了考察，如图6所示，在紫外-可见吸收光谱中，279nm处有明显的吸收峰，此为hl-bqds中c＝o的π-π*电子跃迁形成。通过共价偶联修饰上cy7的hl-bqds-cy7，在750nm处有一个明显的吸收峰，此为cy7的特征吸收峰，进一步说明cy7成功偶联在了hl-bqds表面。

随后对体系发生fret的可行性进行了研究，结果如图7所示，在hl-bqds的荧光光谱中，图中曲线1、2分别为hl-bqds的荧光激发和发射光谱，曲线3为cy7的吸收图谱；在最佳激发波长405nm的激发下，出现最大发射峰为678nm，cy7-nhs及cy7-nh3⁺的紫外-可见吸收光谱与h-bqds有较大重叠，这说明它们可以是一对荧光共振能量转移(fret)的供体和受体。

hl-bqds共价偶联cy7后，荧光发射谱图如图8所示，在670nm处呈现hl-bqds的发射峰，在780nm处呈现cy7的发射峰，且随着cy7加入量的增加hl-bqds的荧光强度逐渐降低，而cy7的荧光强度逐渐升高。说明hl-bqds与cy7偶联成功，并通过fret形成了双发射的近红外比率荧光探针。

下面通过实验数据结果探讨hl-bqds-cy7纳米探针比率荧光检测onoo^-：

将一定量的hl-bqds-cy7溶液与不同浓度的onoo^-溶液混合，考察了探针对onoo^-的响应情况，结果如图9和图10所示。图9中随onoo^-浓度的增加，探针在780nm处的荧光强度降低，而在670nm处的荧光强度升高。如图10所示，其在两波长下荧光强度比值的对数值与onoo^-的浓度在0.02-15μmol/l范围内呈现出良好的线性关系。线性回归方程为：

log(f670/f780)＝0.05788conoo-+0.4474，r²＝0.995。

检测限为8.5nmol/l(s/n＝3)。

下面通过实验考察hl-bqds-cy7纳米探针的特异性。

实验考察了hl-bqds-cy7纳米探针对onoo-的特异性，结果如图11所示，从图中可以看出，相对于空白对照组，在hl-bqds-cy7溶液中分别加入浓度均为15μmol/l的不同生物活性分子，仅onoo^-组的荧光比值发生变化，其它活性氧小分子几乎没有变化，这结果表明hl-bqds-cy7纳米探针对检测onoo^-具有高的特异性。

下面通过实验结果考察hl-bqds-cy7纳米探针的细胞毒性：

为了考察hl-bqds及hl-bqds-cy7纳米探针在生物体中应用的可能性，实验利用raw264.7细胞采用mtt法分析法，对hl-bqds及hl-bqds-cy7纳米探针的细胞毒性进行了研究，结果如图12所示。从图中可见，hl-bqds及hl-bqds-cy7浓度在40μg/ml时，细胞存活率约99％，其浓度从40μg/ml增加至200μg/ml时，细胞存活率从99％下降至83％，显示出良好的生物相容性，可用于活细胞及体内生物分子的成像。

下面通过实验数据说明纳米探针用于细胞成像。

1、亚细胞器共定位成像

由于内源性过氧亚硝酸盐产生于活细胞的线粒体内，因此需要通过细胞共定位实验确定纳米探针能够精准进入细胞线粒体。将raw264.7细胞孵育20h后，然后分别加入hl-bqds-cy7纳米探针和溶酶体、细胞核、线粒体定位试剂，并继续孵育8h；hl-bqds-cy7纳米探针在405nm激光激发下，收集在650-700nm范围内的荧光(探针通道)，溶酶体和线粒体定位剂激发波长为533nm，收集在560-650nm范围内的荧光(定位剂通道)。细胞核定位剂激发波长为488nm，收集在500-550nm范围内的荧光(定位剂通道)。从图13中可以看出，hl-bqds-cy7纳米探针具有良好的线粒体靶向性(共定位系数为0.89)，而溶酶体和细胞核共定位系数仅为0.56和0.58。

2、活细胞中外源性onoo^-的比率成像

实验考察了细胞中外源性onoo^-成像情况，将合适密度的raw264.7细胞接种在35mm共聚焦成像皿中，孵育20h后加入hl-bqds-cy7纳米探针，继续孵育6h。以sin-1作为onoo^-供体，msb作为o2^-·供体，noc-18作为no供体，在空白对照组a中加入50μlpbs；b组加入终浓度为100μmol/l的sin-1；c组加入终浓度为1mmol/lsin-1；d组加入终浓度为1mmol/lsin-1及100μmol/l二甲胺四环素(minocycline)抑制剂；e组加入终浓度为100μmol/lmsb；f组加入终浓度为500μmol/lnoc-18。继续孵育2h后对细胞进行双通道成像，结果如图14所示。与空白对照组a相比，b组在加入100μmol/lsin-1后，780nm通道的荧光降低，670nm通道的荧光升高；c组在加入1mmol/lsin-1后，780nm通道的荧光几乎消失，670nm通道的荧光明显增强；d组在加入1mmol/lsin-1的同时加入了抑制剂minocycline，其两个通道的荧光强度几乎与a组相同，表明minocycline完全抑制了onoo^-的生成。在e和f组中，由于分别加入的o2^-·和no供体不能生成onoo^-，因此，两个通道的荧光强度也与a组相同。这些实验结果证明了hl-bqds-cy7纳米探针可以在活细胞中特异性识别onoo^-，并用于onoo^-成像。

为了探究hl-bqds-cy7纳米探针在活细胞内检测onoo^-的动力学范围，将合适密度的raw264.7细胞分别接种在5个35mm共聚焦成像皿中，孵育20h后各加入hl-bqds-cy7纳米探针，然后在5个皿中分别加入50mlpbs、100μmol/l、300μmol/l、600μmol/l和1mmol/l的sin-1后。继续孵育2h后对各组细胞进行双通道成像，结果如图15所示，从图中可以看出，随着sin-1浓度的增加，780nm通道的荧光逐渐减弱，670nm通道的荧光逐渐增强，如图16；两通道荧光强度比值的对数值与sin-1浓度在0-1000μmol/l的范围内呈现良好的线性关系(图14c).其线性回归方程为：

log(f670/f780)＝4.453×10^-4csin-1+0.1765，r²＝0.9464。

3、活细胞中内源性onoo^-的比率成像

考察活细胞中内源性onoo^-成像情况，实验采用脂多糖(lps)、γ-干扰素(inf-γ)和pma刺激细胞，诱导产生onoo^-。将合适密度的raw264.7细胞分别接种在a,b,c,d等4个35mm共聚焦成像皿中，孵育20h后各加入hl-bqds-cy7纳米探针，然后在a组中加入50mlpbs，其它三组中均加入50ng/mlinf-γ和1μg/mllps，并孵育4h。然后在空白组a中加入4μlpbs；b组中加入25nmol/lpma和2μlpbs；c组加入25nmol/lpma和100μmol/l1400w；d组加入25nmol/lpma和100μmol/lapocynin。继续孵育0.5h后对各组细胞进行双通道成像，结果如图18所示。与空白对照组a相比，b组在加入pma后，780nm通道的荧光降低，670nm通道的荧光升高；而受pma刺激的巨噬细胞中onoo^-的形成可以通过一氧化氮合酶(inos)和nadph氧化酶(nox)来调节。在c、d组中分别加入它们的抑制剂1400w(抑制inos的生成)和apocynin(抑制nox的生成)后，其两个通道的荧光强度几乎与a组相同。

4、单个活细胞中内源性onoo^-的实时比率成像

实验采用发明的探针实时成像跟踪了单个活细胞中内源性onoo^-的产生。将raw264.7细胞接种于35mm共聚焦成像皿中，培育至合适密度后加入hl-bqds-cy7纳米探针，并孵育6h。然后加入50ng/mlinf-γ及1μg/mllps，继续孵育4h。随后加入25nmol/lpma后，分别在孵育0、5、10、20、30、40min时，在共聚焦显微成像系统上对单个细胞进行成像，结果如图19所示，从图中可见，随着孵育时间的增加，780nm通道的细胞荧光强度逐渐降低，而670nm通道的细胞荧光强度逐渐升高，如图20所示。两通道细胞荧光强度比值的对数值与孵育时间在0-40min内呈现良好的线性关系，如图21所示。其线性回归方程为：

log(f670/f780)＝0.01383t(min)+0.08668，r²＝0.9995。

该结果证明hl-bqds-cy7纳米探针可精确跟踪单细胞中内源性onoo^-的产生，并发现在0-40min时间内内源性onoo^-的产生量的线性增加。

下面通过实验数据说明纳米探针用于活体比率成像。

纳米探针在活体中的荧光稳定性：

为了实现纳米探针用于活体中onoo^-的比率成像，首先考察了纳米探针在活体内的荧光稳定性。取雄性裸鼠两只(10周，体重约20g/只)，一只腹腔注射生理盐水(150μl)，一只腹腔注射hl-bqds-cy7纳米探针(3mg/ml，150μl)，用异氟烷将其麻醉，然后在小动物成像系统上，在注射hl-bqds-cy7后0.5、1.5和4h时，以650nm为激发波长，分别收集700±30nm和790±30nm发射通道的荧光，结果如图22所示，从图中可见双通道中的荧光强度，在4h内保持稳定，表明该纳米探针适合于活体中onoo^-的比率成像长。

原位实时比率成像跟踪活体中onoo^-的产生：

实验采用apap作为诱导onoo^-产生的试剂，探究了hl-bqds-cy7纳米探针用于原位实时比率成像跟踪活体中onoo^-产生的可行性。在雄性裸鼠腹腔膈膜内注射hl-bqds-cy7纳米探针(3mg/ml，150μl)，30min后注射药物apap(给药量为500mg/kg)。用异氟烷将其麻醉，然后在小动物成像系统上，于注射apap后10、30、50和70min时，以650nm为激发波长，分别收集700±30nm和790±30nm发射通道的荧光，结果如图23所示，从图中可见，随注射apap进入体内后时间的延长，700±30nm通道的荧光强度逐渐升高，而790±30nm通道的荧光强度逐渐降低，如图24所示。两个通道荧光强度的比值(i700/i790)随着时间的延长而逐渐增加,但50min后增长速度减缓，如图25所示。上述结果证明了hl-bqds-cy7纳米探针可以用于原位比率成像实时监测体内onoo^-的产生，并可能用于追踪与onoo^-相关疾病的体内发生过程。

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