一种荧光金纳米团簇-聚合物空心微球及其制备方法与流程

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种荧光金纳米团簇-聚合物空心微球及其制备方法。

背景技术：

自然界中，许多物质如细胞、植物纤维、病毒等，由于具有中空腔体等多尺度多层次纳米结构和组成，因而具有独特的性能。具有类似结构的人造体系，如空心微球等，由于其特殊的结构和形貌引起了广泛的关注。空心微球结构材料具有低密度、高比表面积的特性，而且其空心部分可容纳大量的客体分子（liux,zhoup,huangy,etal.hierarchicalproteinosomesforprogrammedreleaseofmultiplecomponents[j].angewandtechemieinternationaledition,2016,55(25):7095-7100.）。空心微球这种基于两亲性构筑基元形成的微观“包裹”效应的特殊性质，使得空心微球结构材料作为一种新型功能材料有着广阔的应用前景（zhoup,liux,wug,etal.programmablemodulationofmembranepermeabilityofproteinosomeuponmultiplestimuliresponses[j].acsmacroletters,2016,5(8):961-966.）。它们可以广泛应用于药物、荧光染料、酶、蛋白质、dna等的可控运输和释放体系，还可以用做轻质填料、高选择性催化剂或催化剂载体，而且在人造细胞、疾病诊断等方而也将具有极其重要的应用价值（zhoup,wus,liux,etal.multifunctionalandprogrammablemodulatedinterfacereactionsonproteinosomes[j].acsappliedmaterials&interfaces,2018,10(44):38565-38573.）。

区别于两亲性聚合物构筑基元，金纳米团簇的出现以其尺寸小、无毒、生物相容性好、近红外成像等特性被广泛应用于生物活性小分子检测、细胞标记和成像方面。通过以纳米金为核，引入配体，该型荧光金纳米团簇具有生物相容性好，结构稳定，易于荧光成像等优点。

本发明选用荧光金纳米团簇-聚合物作为构筑基元，代替传统的两亲性聚合物单元，可以免去内部装填荧光染料或者表面荧光标记的繁琐路线，直接用于荧光成像。而且，制得的空心微球结构稳定，可以进行长时间显微成像观察，团簇表面同时富含的氨基酸配体，可以用于进一步的功能化修饰，赋予荧光金纳米团簇-聚合物空心微球更多的功能化。现有技术采用的是荧光单体标记的两亲性聚合物基元或内部填充荧光染料的空心微球，因此，本发明的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球的制备，无疑是一种新型的、有效的制备具有荧光特殊性质微球结构的方法。

技术实现要素：

为了克服现有技术中的问题，本发明提供了一种荧光金纳米团簇-聚合物空心微球。该空心微球可以免去内部装填荧光染料或者表面荧光标记的繁琐路线，直接用于荧光成像，在医药领域等方面展现出广阔的应用前景。

本发明还提供了上述荧光金纳米团簇-聚合物空心微球的制备方法，该合成方法简单，操作方便，可以通过改变加工条件来实现微球尺寸的调控。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种荧光金纳米团簇-聚合物空心微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）将四氯金酸溶液、谷胱甘肽溶液和水混合搅拌，然后加热至60~80℃反应12~24h，得谷胱甘肽配体保护的荧光金纳米团簇（auncs），记为化合物a；其中，四氯金酸（haucl4）和谷胱甘肽（gsm）的物质的量之比为（1~4）:3；

（2）将质量比为1:（0.5~4）的化合物a与聚n-异丙基丙烯酰胺（pnipaam）于室温下搅拌反应12~24h，得荧光金纳米团簇-聚n-异丙基丙烯酰胺（auncs-pnipaam）的耦合体，记为化合物b；

（3）向化合物b中加入乳化剂、助乳化剂和缓冲液，然后加入溶剂，震荡60~100s，即得。

优选的，步骤（1）中四氯金酸的浓度为20mmol/l，用量为1~2ml；谷胱甘肽的浓度为100mmol/l，用量为0.3~0.6ml；水的用量为5~10ml。

优选的，步骤（2）中化合物a的用量为10~20mg，聚n-异丙基丙烯酰胺的用量为10~40mg。

优选的，步骤（2）中的聚n-异丙基丙烯酰胺的制备方法包括以下步骤：将2,2’-二硫二吡啶溶解在乙醇中，然后加入巯基乙醇，得混合物c；将混合物c溶解于二硫化碳和铁氰化钾的混合溶液中，得到raft试剂；然后将n-异丙基丙烯酰胺、raft试剂、光催化剂和乙腈混合，经紫外光照射8~12h，即得。进一步优选的，紫外光的波长为395nm。

具体的，步骤（2）中的聚n-异丙基丙烯酰胺的制备方法包括以下步骤：将6g的2,2’-二硫二吡啶溶解在30ml乙醇中，然后加入0.8g的巯基乙醇，得混合物c；将混合物c缓慢滴加到3ml二硫化碳和5g铁氰化钾的混合溶液中，搅拌使其充分溶解得到raft试剂；将300mgn-异丙基丙烯酰胺、3mgraft试剂和15μl光催化剂氯化三(2,2′-联吡啶)钌(ⅱ)，六水（阿拉丁售）混合，加到3ml乙腈中，经紫外光照射10h，即得。

优选的，步骤（3）中化合物b的用量为20~60μl、乳化剂的用量为2~15μl、助乳化剂的用量为2~10μl、缓冲液的用量为5~20μl、溶剂的用量为300~500μl。

优选的，步骤（3）中的乳化剂为tritonx-100、助乳化剂为正丁醇、缓冲液为磷酸盐缓冲液；进一步优选的，磷酸盐缓冲液的ph为8.0，浓度为0.1mol/l。

优选的，步骤（3）中的溶剂为异辛醇。

采用上述方法制备得到的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球。

上述荧光金纳米团簇-聚合物空心微球在生物材料中的应用，可以直接用于荧光成像和生物标记。

和现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明制备的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球具有红色荧光特殊性质，可以直接用于显微成像观察和生物标记；

2、本发明制备的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球具备生物相容性好，毒副作用低的优点，对生物体的填充降低各种不良反应；

3、本发明制备的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球是共价键交联的稳定结构，膜具备一定的强度和柔韧性，并且通过耦联不同分子量的聚合物进行膜透性调控；

4、本发明制备的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球可作为药物的载体，可装载药物、酶、蛋白质及dna等，通过显微成像观察直达病灶部位；

5、本发明的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球合成步骤简单，操作方便，可以通过改变加工条件来实现微球尺寸的调控，并且团簇表面的氨基酸配体可以进行多功能修饰，满足不同生物组织工程的需要。

附图说明

图1是实施例1制备的荧光金纳米团簇溶液的显微镜和荧光显微镜照片；

图2是实施例1制备的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球的显微镜照片；

图3是实施例1制备的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球的荧光显微镜照片；

图4是实施例1制备的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球的粒径分布柱状图；

图5是实施例2制备的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球的显微镜照片；

图6是实施例2制备的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球的荧光显微镜照片；

图7是实施例2制备的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球的粒径分布柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行进一步说明，但并不是对本发明的限制。

实施例1

本实施例的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）室温下，量取1ml、20mmol/l的haucl4溶液，0.3ml、100mmol/l的gsh溶液和8.7ml超纯水混合搅拌，并加热至70℃反应24h，制得谷胱甘肽配体保护的荧光金纳米团簇（液体），记为化合物a；化合物a的显微镜照片和荧光显微镜照片如图1所示（图1中左图为显微镜照片，右图为荧光显微镜照片）。图1可以明确看出荧光金纳米团簇水溶液明场下（图1中左图）为澄清透明溶液，而暗场下（图1中右图）经过紫外灯（365nm）照射后发出红色荧光。

（2）将10mg化合物a与20mgpnipaam于室温下搅拌反应24h，得荧光金纳米团簇-聚n-异丙基丙烯酰胺的耦合体，记为化合物b；

其中，pnipaam的制备方法包括以下步骤：将6g的2,2’-二硫二吡啶溶解在30ml乙醇中，然后加入0.8g的巯基乙醇，得混合物c；将混合物c缓慢滴加到3ml二硫化碳和5g铁氰化钾的混合溶液中，搅拌使其充分溶解得到raft试剂；将300mgn-异丙基丙烯酰胺、3mgraft试剂和15μl氯化三(2,2′-联吡啶)钌(ⅱ)，六水（阿拉丁售）混合，加到3ml乙腈中，经395nm紫外光照射10h，即得；

（3）量取40μl化合物b、5μltritonx-100、5μl正丁醇和10μl0.1mol/l的磷酸盐缓冲液并加入到容器中，然后向其添加500μl异辛醇，震荡100s，即得荧光金纳米团簇-聚合物空心微球。

本实施例制备得到的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球的显微镜照片如图2所示，图2可以看出制备得到的空心微球表面平滑，尺寸较均匀；荧光显微镜照片如图3所示，图3可以看出空心微球在荧光显微镜照射下，自身发出红色荧光；粒径分布曲线如图4所示，图4可以看出空心微球的尺寸分布较均匀，平均粒径约为39.3μm。

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于：

步骤（2）中，化合物a的用量为20mg，pnipaam的用量为10mg；

步骤（3）中，化合物b的用量为50μl，tritonx-100的用量为10μl，正丁醇的用量为10μl，磷酸盐缓冲液的用量为5μl，异辛醇的用量为400μl。

本实施例制备得到的荧光金纳米团簇-聚合物空心微球的显微镜照片如图5所示，图5可以看出制备得到的空心微球表面平滑，尺寸较均匀；荧光显微镜照片如图6所示，图6可以看出空心微球在荧光显微镜照射下，自身发出红色荧光；粒径分布曲线如图7所示，图7可以看出空心微球的尺寸分布较均匀，平均粒径约为18.9μm。

因此，实施例2（金纳米团簇与聚合物的量比为2:1）制备的空心微球尺寸小于实施例1（金纳米团簇与聚合物的量比为1:2）。由实施例1和实施例2可以看出，金纳米团簇的量越大，聚合物的用量越小，制备的空心微球尺寸就越小。

实施例3

本实施例与实施例1的不同之处在于：

步骤（1）中，haucl4溶液的用量为2ml，gsh溶液的用量为0.6ml，超纯水的用量为10ml，于80℃下搅拌反应12h；

步骤（2）中，将10mg化合物a与40mgpnipaam于室温下搅拌反应12h，其中，pnipaam的制备过程中，紫外光照为8h；

步骤（3）中，化合物b的用量为20μl、tritonx-100的用量为2μl、正丁醇的用量为2μl和磷酸盐缓冲液的用量为20μl，异辛醇的用量为300μl，震荡60s。

实施例4

本实施例与实施例1的不同之处在于：

步骤（1）中，超纯水的用量为5ml，于60℃下搅拌反应18h；

步骤（2）中，pnipaam的制备过程中，紫外光照为12h；

步骤（3）中，化合物b的用量为60μl、tritonx-100的用量为15μl、正丁醇的用量为8μl和磷酸盐缓冲液的用量为15μl，异辛醇的用量为400μl，震荡80s。

采用本发明的方法制备得到的空心微球，表面平滑，尺寸分布较均匀，稳定性良好，尤其是自身产生红色荧光的特性，可以免去内部装填荧光染料或者表面荧光标记的繁琐路线，有效降低在生物组织内部的毒性，增加在组织内部的作用时长，直接用于荧光成像和生物标记，大大提高工作效率。