专利名称：一种利用聚丙烯胺盐酸盐双层修饰细菌的方法、吸附剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及重金属水体污染修复领域，具体涉及一种在细菌菌体表面双层修饰聚烯丙基胺盐酸盐的方法，以及将修饰后的菌体制备成的细菌吸附剂及其应用，该吸附剂能够快速、高效地去除水体中重金属。
背景技术：
重金属污染是指由重金属或其化合物造成的环境污染。重金属污染主要表现在水污染中，主要来源工业污染，重金属污染与其他有机化合物的污染不同。不少有机化合物可以通过自然界本身物理的、化学的或生物的净化，使有害性降低或解除，而重金属不能被降解，而且具有富集性。
近年来，利用生物吸附法去除水污染中重金属引起极大关注。利用微生物材料作为重金属吸附剂具有来源丰富、成本低、操作简便、快速、能重复利用等优点。但是自然生物吸附剂的一个大缺陷是其吸附能力通常较低，而化学修饰是解决其吸附能力低的有效方法。然而文献报道多为将具有络合重金属能力的官能团物质单层连接或嫁接到微生物表面上，双层或多层修饰微生物未见报道，而且这些已报道的单层修饰方法虽然能提高其吸附能力，但是其对重金属的去除能力也不足以有效处理浓度200mg/L以上重金属污染废水。例如本课题组研究将聚烯丙基胺盐酸盐单层连接到细菌Pseudomonas sp. LK9上,其对Pb2+最大吸附量也仅达269. 9mg/g。本发明在已有研究的基础上，采用双层修饰微生物的方法，提供一种能显著提高处理重金属效果的微生物表面修饰方法。
发明内容
本发明克服现有技术的不足，首次提供了一种新的双层修饰细菌的方法以及由该方法制备得到的吸附剂和该吸附剂的应用方法，该方法能够显著提高细菌对重金属的去除能力。本发明操作简单、经济、安全，并能有效处理重金属污染废水。一种利用聚丙烯胺盐酸盐双层修饰细菌的方法，包括以下步骤I)配制聚烯丙基胺盐酸盐溶液，调节其pH为碱性，将细菌冻干粉加入到聚烯丙基胺盐酸盐溶液中，搅拌后加入戊二醛，继续搅拌，冷冻干燥，获得单层修饰的PAA菌体；2)单层修饰的PAA菌体，加入到含吡啶的氯仿溶液中，在搅拌下滴加4-溴丁酰氯，得到酰化菌体，最后将酰化菌体和氢氧化钾加入到聚烯丙基胺溶液中，搅拌，离心，用去离子水洗涤，冷冻干燥获得双层修饰的PAA菌体；所述的细菌为假单胞菌Pseudomonas sp. LK9，于2012年7月30日在中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心进行了专利保藏，保藏编号为CCTCC M2012302。步骤I)的具体过程为lg细菌冻干粉加入IOOmL pH为11的5g/L的聚烯丙基胺盐酸盐溶液，搅拌2h后，加入O. 1-0. 2mL25wt%的戊二醛，继续搅拌2h，洗涤，冷冻干燥至恒重，获得单层修饰的PAA菌体。
步骤2)中单层修饰的PAA菌体的添加量为10g/L氯仿；吡啶加入量为O. 25mL/g单层修饰的PAA菌体；4_溴丁酰氯加入量为O. 25mL/g单层修饰的PAA菌体；加入4-溴丁酰氯后常温搅拌12h ;聚烯丙基胺加入量为lg/g单层修饰的PAA菌体，KOH加入量为lg/g单层修饰的PAA菌体；加入聚烯丙基胺溶液后温度控制为80°C ;反应时间为8h。一种吸附重金属的微生物吸附剂，是将上述的方法修饰得到的产物冷冻干燥至恒重制备而成的。上述制备的吸附剂的应用方法处理废水中重金属Pb2+时废水pH值为2-7 ;优选为5-6 (见附图3)。上述的微生物吸附剂剂量为lg/L重金属废水；吸附时间为5_120min，优选为 60-120min (见附图 4)。处理废水的方法具体是首先调节重金属污染废水PH，往重金属污染废水中投加所述的微生物吸附剂，震荡后过滤或沉淀收集吸附剂，完成对重金属污染废水的处理。本发明所述的细菌为Pseudomonas ss. LK9,保藏编号为CCTCC M2012302;并已申请专利，申请号为:201210295180.1。本发明首次在微生物表面双层修饰具有大量络合重金属离子的官能团的聚合物，首先用戊二醛作为第一层交联剂，将聚烯丙基胺盐酸盐(PAA/HC1)与细菌表面氨基连接，再利用4-溴丁酰氯作为第二层的交联剂，与细菌表面第一层的氨基官能团酰化后，在碱性条件下，-C-Br再与聚烯丙基胺长链上的氨基反应，从而在细菌表面双层修饰PAA，使其表面带有大量氨基官能团，从而大大提高其对污染废水中重金属的去除能力。与传统的吸附剂相比，本发明的微生物吸附剂具有对重金属去除效果显著，如对重金属Pb2+的最大吸附量为483. 19mg/g, lg/L的该吸附剂剂量对300mg/L以下的重金属Pb2+去除率可达99%，对400mg/g的Pb2+去除率也可达96. 5%。本发明方法为微生物修饰方法提供一个双层或多层修饰的新思路，此外本发明吸附剂还有环保、制备过程简单等优点。
图1 为本发明吸附剂 LK9-G-PAA、LK9-G-PAA2、LK9-G-PAA-B-PAA 对重金属 Pb2+ 的去除效果对比图；图2为LK9-G-PAA-B-PAA对重金属Pb2+的去除率；图3为pH对本发明先后吸附剂LK9-G-PAA-B-PAA吸附重金属Pb2+影响关系图；图4为本发明吸附剂LK9-G-PAA-B-PAA对重金属Pb2+的吸附量与时间的关系 图5为本发明吸附剂LK9-G-PAA-B-PAA与LK9-G-PAA与无修饰LK9吸附剂处理不同浓度Pb2+的效果对比图。
具体实施例方式以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例11、PAA 多层修饰 Pseudomonas sp. LK9 的研究戊二醛作为交联剂多层修饰效果研究(I)首先用LB培养基大量培养植物内生菌Pseudomonas sp. LK912h，离心收集菌体，用去离子水洗涤2-3次，用冷冻干燥法获得植物内生菌Pseudomonas sp. LK9CCTCCM2012302冻干粉；(2)将 Ig 植物内生菌 Pseudomonas sp. LK9CCTCC M2012302 冻干粉加入到 IOOmLpH为11的5g/L的PAA/HC1溶液中，搅拌2h，加入O. 1-0. 2mL25wt%的戊二醛，继续搅拌2h，去离子水洗漆,冷冻干燥至恒重,从而完成对植物内生菌Pseudomonas sp. LK9的单层修饰；命名为 LK9-G-PAA ；(3)将上述得到的LK9-G-PAA菌体重复步骤(2)的过程，得到PAA双层修饰的植物内生菌 Pseudomonas sp. LK9 菌体，命名为 LK9-G-PAA2 ；(4)依次使用戊二醛、4-溴丁酰氯作为交联剂修饰效果研究 将步骤(2)制备的单层修饰的LK9-G-PAA菌体，加入到含有吡啶的氯仿溶液中，吡啶含量为0. 25mL/gLK9-G-PAA菌体，LK9-G-PAA菌体与氯仿的比例为IOg菌体/L氯仿，在搅拌下慢慢滴加0. 25mL/gLK9-G-PAA菌体的4-溴丁酰氯，常温下搅拌12h ;得到酰化菌体，最后将酰化菌体和lg/gLK9-G-PAA菌体的氢氧化钾加入到PAA浓度为10g/L的PAA碱性溶液中，每IOOmL该溶液中含有Ig菌体(以LK9-G-PAA菌体计)，80°C下搅拌8h，离心，去离子水洗涤，冷冻干燥获得双层PAA菌体。命名为LK9-G-PAA-B-PAA。 将上述两种吸附剂LK9-G-PAA2、LK9-G-PAA-B-PAA以lg/L的剂量用于吸附260mg/L的Pb2+，结果如附图1所示，仅用戊二醛为双层修饰的交联剂对Pb2+的去除率没有明显提高，而依次用戊二醛、4-溴丁酰氯作为交联剂双层修饰所得的吸附剂LK9-G-PAA-B-PAA，其对Pb2+去除率大大增加，而且lg/L的吸附剂剂量对于浓度低于300mg/L的Pb2+去除率可达到99% (见附图2)。2、吸附剂LK9-G-PAA-B-PAA对重金属Pb2+吸附研究(l)pH对本发明吸附剂吸附重金属Pb2+的影响配制浓度为100mg/L左右的Pb2+溶液，用0.1M的HNO3和0.1M的NaOH调节pH为2 7。将菌剂量为lg/L的本发明吸附剂LK9-G-PAA-B-PAA加入不同pH的重金属Pb2+溶液中，在27°C，吸附lh，然后用原子吸收光谱仪测定吸附后模拟废水中Pb2+的浓度。由此实验得Pb2+废水最优吸附pH为5-6 (见附图3)。(2 )本发明吸附剂LK9-G-PAA-B-PAA在不同时间条件下对Pb2+的吸附研究分别配制浓度为300mg/L的Pb2+溶液，用0.1M的HNO3和0.1M的NaOH调Pb2+节pH为5-6。将吸附剂剂量为lg/L的本发明吸附剂LK9-G-PAA-B-PAA加入重金属Pb2+溶液中，在27 °C下吸附5、10、20、30、45、60、120min，然后用原子吸收光谱仪测定吸附后模拟废水中Pb2+的浓度。由此实验可以得出，lg/L的剂量在60-120min内达到平衡(附图4)。(3)吸附剂LK9-G-PAA-B-PAA对Pb2+对重金属最大吸附量研究分别配制浓度为50、100、150、200、300、400、600mg/L 的 Pb2+溶液，用 0.1M 的 HNO3和0.1M的NaOH调节pH为5_6。将吸附剂剂量为lg/L的本发明吸附剂LK9-G-PAA-B-PAA、LK9-G-PAA分别加入不同浓度的重金属Pb2+溶液中，在27°C下吸附120min，然后用原子吸收光谱仪测定吸附后模拟废水中Pb2+的浓度。优化后本发明吸附剂LK9-G-PAA-B-PAA对重金属Pb2+的最大吸附量为483. 19mg/g，比未修饰的LK9吸附剂分别增加了 406. 23mg/g,比单层修饰的吸附剂LK9-G-PAA增大213. 29mg/g (见附图 5)。
权利要求
1.一种利用聚丙烯胺盐酸盐双层修饰细菌的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)配制聚烯丙基胺盐酸盐溶液，调节其pH为碱性，将细菌冻干粉加入到聚烯丙基胺盐酸盐溶液中，搅拌后加入戊二醛，继续搅拌，冷冻干燥，获得单层修饰的PAA菌体； 2)单层修饰的PAA菌体，加入到含吡啶的氯仿溶液中，在搅拌下滴加4-溴丁酰氯，得到酰化菌体，最后将酰化菌体和氢氧化钾加入到聚烯丙基胺溶液中，搅拌，离心，用去离子水洗涤，冷冻干燥获得双层修饰的PAA菌体； 所述的细菌为Pseudomonas sp. LK9，保藏编号为CCTCC M2012302。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)的具体过程为Ig细菌冻干粉加A IOOmLpH为11的5g/L的聚烯丙基胺盐酸盐溶液，搅拌2h后，加入0. 1-0. 2mL25wt%的戊二醛，继续搅拌2h，洗涤，冷冻干燥至恒重，获得单层修饰的PAA菌体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中单层修饰的PAA菌体的添加量为10g/L氯仿；吡啶加入量为0. 25mL/g单层修饰的PAA菌体；4-溴丁酰氯加入量为0.25mL/g单层修饰的PAA菌体；加入4-溴丁酰氯后常温搅拌12h ;聚烯丙基胺溶液的浓度为10g/L，酰化菌体的加入量以每IOOmL聚烯丙基胺溶液中含有Ig单层修饰的PAA菌体，KOH加入量为lg/g单层修饰的PAA菌体；加入聚烯丙基胺溶液后温度控制为80°C ;反应时间为8h。
4.一种吸附重金属的微生物吸附剂，其特征在于，将权利要求1-3任一项所述的方法修饰得到的产物冷冻干燥至恒重制备而成的。
5.权利要求4所述的制备的吸附剂的应用方法，其特征在于，处理废水中重金属Pb2+时废水PH值为2-7。
6.权利要求4所述的制备的吸附剂的应用方法，其特征在于，处理废水中重金属Pb2+时废水pH值为5-6。
7.根据权利要求4所述的吸附剂的应用方法，其特征在于，所述的微生物吸附剂剂量为lg/L重金属废水；吸附时间为5-120min。
全文摘要
本发明首次提供一种利用聚丙烯胺盐酸盐双层修饰细菌的方法、吸附剂及其应用方法。该方法依次采用戊二醛、4-溴丁酰氯作为交联剂，将聚烯丙基胺盐酸盐(PAA/HCl)双层连接到细菌表面，从而显著提高其对重金属的去除能力。按本发明方法修饰细菌LK9所得吸附剂LK9-G-PAA-B-PAA对重金属Pb2+的最大吸附量为483.19mg/g，比未修饰的LK9吸附剂增加了406.23mg/g，比单层修饰吸附剂LK9-G-PAA增大213.29mg/g，且1g/L的该吸附剂剂量对300mg/L以下的重金属Pb2+去除率可达99%。本发明吸附剂吸附能力显著，环保，对重金属污染水处理具有很大的应用潜力，且微生物修饰方法提供一个可双层或多层修饰微生物的新思路。
文档编号C02F1/28GK103013864SQ201210509358
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者罗胜联, 李晓洁, 陈亮, 陈觉梁, 万勇, 刘承斌 申请人:湖南大学