在本发明属于生物技术领域，涉及利用缓释载体对含酚废水进行富集，然后用底物缓释系统替代传统的游离底物系统进行高附加值的糖苷类化合物合成反应，变废为宝，实现含酚废水的绿色处理及其高值化利用的方法。
背景技术：
众所周知, 含酚废水是危害十分严重的有毒废水之一，对一切生物个体均有极高毒性并难以生物降解,可通过皮肤及粘膜的接触而侵入体内，从而引起组织损伤、坏死乃至使生物体中毒。含酚废水在1977年就被美国国家环保局列为129 种优先控制的污染物之一，也是我国当前水污染控制中重点解决的有害废水之一和急需解决的三废治理对象。常用的含酚废水处理技术有物理法、化学法及生化法。这些方法虽然可以起到一定的处理效果，但都存在着不足, 如物理法存在着二次污染的问题，化学法存在着不能回收酚、投资高、成本大的问题，生化法存在着不能处理高浓度废水的问题[1]。因此，有关含酚废水的处理问题尚未有真正有效的解决办法，还需进一步研究。探索合理有效地含酚废水处理方法是环境保护及综合利用必须解决的问题，在建设节约型社会发展循环经济的21 世纪具有十分重要的意义。
糖苷天然产物广泛存在于生物体内,由于具有特殊的生物活性而担负着重要的生物功能，目前在全球市场上流通的药剂中占有率超过了30%, 可见其对于维护人类生命和健康方面的重要性。然而在糖苷生物合成过程中，经常要用到对生物催化剂有毒的酚类化合物作为底物，这些化合物的存在会影响催化剂的活性，造成催化剂的活性下降甚至使催化剂丧失催化作用。因此，如何消除酚类化合物对生物催化剂的毒害作用成为糖苷合成的一个瓶颈，严重阻碍了糖苷生物合成工业的发展。
酚类化合物对生物催化剂的毒性主要通过降低细胞内巯基水平及升高活性氧水平改变细胞内氧化还原状态或与细胞原浆中的蛋白质发生化学反应使细胞变性而导致细胞衰退或死亡。通过底物缓释反应系统固定化使得反应体系中游离的底物浓度基本为零，酶或微生物的新陈代谢将不受任何影响，可以更好地催化合成目的产物；此外，把有毒底物固定在载体上，可以大大提高催化剂对有毒底物的耐受度，从而大大提高目的产物的产量；再者，待反应结束后，未反应的有毒底物依然固定在载体上，可以用于下一批次的反应，有效减少了有毒底物废水的排放，对环境的污染基本没有。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用底物缓释载体对含酚废水进行富集，然后以富集了酚类化合物的缓释载体作为底物生物合成糖苷类化合物，从而实现含酚废水的绿色处理和高值化利用。该方法具有废水处理能力大，处理程度高、变废为宝等优点，解决了含酚废水传统方法难以处理的问题，为大规模含酚废水的绿色处理及高值化利用奠定了基础。
本发明的整体技术构思是：利用固定化载体对含酚废水进行富集，然后用缓释载体替代传统的游离底物进行催化反应，该方法由下列工艺步骤组成：
（1）缓释载体的选择；
（2）含酚废水的富集；
（3）以富集了酚类化合物的缓释载体作为底物进行催化反应；
（4）高附加值糖苷化合物的分离纯化；
（5）缓释载体的重复使用。
本发明的具体工艺步骤及工艺条件是：
步骤（1）中缓释载体的选择：
根据含酚废水酚类化合物的理化性质选择合适的缓释载体，缓释载体为壳聚糖及其改性，纤维素及其衍生物，有机合成聚合物包括大孔吸附树脂、离子交换树脂、接枝聚合物和β-环糊精聚合，凝胶材料包括卡拉胶、聚乙烯醇、海藻酸钙凝胶、烯丙基葡聚糖树脂凝胶、微乳液凝胶和明胶，磁性微粒，无机材料包括硅胶，硅藻土，活性炭，CaCO3粉末，蛋壳，二氧化钛，陶瓷拉西环和膨润土基多孔粘土材料，丝素或甲壳素。
步骤（2）中含酚废水的富集：
对含酚废水富集过程中涉及的温度、溶液pH、搅拌转速、底物浓度及富集时间等条件进行优化，确定最佳的富集条件；富集方法为吸附法，共价结合法，交联法或包埋法。
步骤（3）中高附加值糖苷化合物合成：
取一定量的酶或微生物细胞加入到含有一定体积反应液的反应体系中，通过考察反应温度、体系pH、搅拌转速、装液量及反应时间等反应条件，确定最佳的反应条件。
催化反应为酶催化反应，细胞催化反应，微生物发酵催化反应或有机催化反应。
步骤（4）中的产物分离纯化：
采用缓释反应体系生产的产物应根据产物理化性质及分布状态采用洗脱、萃取、离交或蒸馏的方式进行产物分离纯化。
步骤（5）中缓释载体的回收及循环使用：
在催化反应结束后，利用过滤或离心的方法即可把缓释载体进行回收，回收的载体进入步骤（1）继续进行含酚废水富集，并再次作为底物投入催化反应体系中进行反应；如此重复循环，缓释载体的使用寿命可达50-300个周期。
本发明所取得的技术进步在于：
本发明是通过以缓释载体对含酚废水的富集，然后以缓释载体传统的游离底物作为反应物，生产高附加值的糖苷化合物，不但解决了传统含酚废水处理难、处理量小、处理成本高的问题，而且实现了含酚废水的高值化利用；利用本发明处理含酚废水的方法具有如下优点：
（1）利用缓释载体对含酚废水的富集，实现了不同浓度的含酚废水绿色处理；
（2）利用富集了酚类化合物的缓释载体作为底物催化合成高附加值的糖苷类化合物，实现了含酚废水的高值化利用；
（3）底物缓释反应系统既能绿色净化废水, 又能高值化利用废水中的酚类物质，变废为宝，真正实现社会效益、环境效益和经济效益三者的统一。
采用本发明进行含酚废水处理具有工艺步骤简单，环境友好，处理成本低，经济效益好等优点，具有重大应用意义。
本发明的方法涉及的缓释载体既可用公知的方法合成也可以是市场销售产品，富集方法即可用现有的负载方法也可根据经验采用的改良的方法。下面所列举的实施例只是为了更详细地说明本发明，但本发明不受它们的任何限定。
具体实施方式
实施例1、以大孔吸附树脂作为缓释载体对含酚废水进行富集，并以该缓释树脂为底物生物合成α-熊果苷。
（1）含酚废水的富集：
对苯二酚是含酚废水中的一个重要组成成份，根据其含有两个酚羟基的理化性质，选择大孔吸附树脂作为缓释载体。首先制得质量百分比浓度为1-10％的含酚废水溶液；然后往每100 ml废水溶液加入1-10 g预处理好的大孔吸附树脂如NKA-9、NKA-II、S-8、AB-8、D201、D3520、D4006、D4020、H1020、H103、H107、X-5、NKA-II、X-5、YWD01B、HPD100、HPD450、HPD600或HPD700在温度为10-40℃转速为100-150 r/min的摇床上固定化1-5 h；最后把吸附好的树脂用滤纸过滤，并用去离子水清洗树脂表面1-3次以洗净残留在树脂表面的废水，即制得吸附量为0.1-1 g对苯二酚/g树脂的缓释树脂微球。
（2）α-丁香酚葡萄糖苷的催化反应：
① 生物催化剂发酵液的制备
在4-羟苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷合成反应中，使用的菌种为野油菜黄单胞菌（Xanthomonascampestris）CGMCC NO.1243；挑取1环斜面保存的野油菜黄单胞菌，加入到体积为250 ml的液体培养基中，在温度为20-30℃，转速为100-200 r/min摇床中培养10-20 h后即制得菌体发酵液。
种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成：
蔗糖 10-40份，蛋白胨 1-5份，酵母粉 1-5份，硫酸镁 0.5-1份，磷酸氢二钾0.5-2份，氯化钠 0.5-2份和水 1000份。
② 催化合成反应
往250 ml锥形瓶中加入富集了对苯二酚的大孔吸附树脂和蔗糖，其中树脂的质量浓度为1-50 g树脂/l发酵液，蔗糖物质量浓度为10-1000 mmol/l；在反应温度为20-40 ℃，转速为100-180 r/min条件下反应24-72 h。在此反应条件下，固定化底物对苯二酚转化为α-熊果苷的转化率达90-95％，α-熊果苷的产量为2-100 g/l。
（3）α-熊果苷的分离纯化：
① 催化反应结束后，用滤纸过滤即可把大孔吸附树脂分离出来，然后用去离子水清洗树脂2-3次，洗净树脂表面残留的发酵液；
② 把经过①步骤的大孔吸附树脂用体积百分比浓度为1-90%的酒精进行洗脱，收集洗脱液；
③ 把经过②步骤的洗脱液进行真空浓缩，在浓缩到产品处于饱和状态时，放入温度为0-4℃条件下进行结晶，晶体经干燥后得到纯度为99.5％以上的α-熊果苷产品；真空浓缩温度为40-60℃，结晶时间为5-12 h。
（4）缓释载体的回收及循环使用：
在经过步骤（3）的大孔吸附树脂用去离子水洗涤2-3次，洗净树脂上残留的酒精，然后再次用于含酚废水的富集，并再次作为底物投入催化反应体系中进行反应；如此重复循环，树脂的使用寿命可达50-300个周期。
实施例2、以活性炭为缓释载体对含酚废水进行富集，并以该缓释树脂为底物生物合成α-丁香酚葡萄糖苷。
（1）含酚废水的富集：
丁香酚是含酚废水中的一个重要组成成份，根据丁香酚的理化性质选择合适的活性炭作为缓释载体。首先制得质量百分比浓度为1-10％的含酚废水溶液；然后往每100 ml废水溶液加入1-10 g预处理好的活性炭如木质活性炭、果壳活性炭、煤质活性炭、石油类活性炭或再生炭在温度为20-80 ℃转速为50-150 r/min的摇床上吸附0.1-5 h；最后把吸附好的活性炭用滤纸过滤，并用去离子水清洗活性炭表面1-3次以洗净残留在树脂表面的废水溶液，即制得吸附量为0.1-1 g丁香酚/g活性炭的缓释活性炭。
（2）α-丁香酚葡萄糖苷的催化反应：
① 生物催化剂菌体细胞的制备
在4-羟苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷合成反应中，使用的菌种为野油菜黄单胞菌（Xanthomonascampestris）CGMCC NO.1243；挑取1环斜面保存的野油菜黄单胞菌，加入到体积为250 ml的液体培养基中，在温度为20-30℃，转速为100-200 r/min摇床中培养10-20 h，离心发酵液得菌体细胞，再把菌体细胞加入到0.01-0.5 mol/l的磷酸缓冲溶液中即可制得菌悬液，菌悬液浓度为0.5-50 g菌体细胞/l磷酸缓冲溶液。
种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成：
蔗糖 10-40份，蛋白胨 1-5份，酵母粉 1-5份，硫酸镁 0.5-1份，磷酸氢二钾0.5-2份，氯化钠 0.5-2份和水 1000份。
② 催化合成反应
往250 ml锥形瓶中加入吸附了丁香酚的活性炭和麦芽糖，其中活性炭的质量浓度为1-50 g活性炭/l菌体细胞磷酸缓冲溶液，蔗糖物质量浓度为10-1000 mmol/l；在反应温度为20-40 ℃，转速为50-180 r/min条件下反应24-72 h。在此反应条件下，丁香酚转化为α-丁香酚葡萄糖苷的转化率达80-95％，α-丁香酚葡萄糖苷的产量为2-100 g/l。
（3）α-丁香酚葡萄糖苷的分离纯化：
① 催化反应结束后，用滤纸过滤即可把活性炭分离出来，然后用去离子水清洗活性炭2-3次，洗净活性炭表面残留的发酵液；
② 把经过①步骤的活性炭用体积百分比浓度为1-90%的酒精进行洗脱，收集洗脱液；
③ 把经过②步骤的洗脱液进行真空浓缩，在浓缩到产品处于饱和状态时，放入温度为0-4℃条件下进行结晶，晶体经干燥后得到纯度为99.5％以上的α-丁香酚葡萄糖苷产品；真空浓缩温度为40-60℃，结晶时间为5-12 h。
（4）缓释载体的回收及循环使用：
在经过步骤（3）的活性炭用去离子水洗涤2-3次，洗净活性炭上残留的酒精，然后再次用于废水的富集，并再次作为底物投入催化反应体系中进行反应；如此重复循环，活性炭的使用寿命可达1-300个周期。