一种固定化酶生物反应装置及其在处理养殖水体中亚硝酸盐的应用的制作方法

本发明属于水产养殖和环境保护领域，具体涉及一种固定化酶生物反应装置及其在处理养殖水体中亚硝酸盐的应用。

背景技术：

水污染是全世界广泛关注的问题。在人类生活的环境和食物中普遍存在着亚硝酸盐。近年来，亚硝酸盐养殖水体已引起环保领域和全球范围的重视，许多研究表明亚硝酸盐是亚硝酸胺的前体物，亚硝胺是一种强致癌物，可以诱发消化系统中的多种癌变，如胃癌、肠癌和肝癌。鉴于水产养殖水体亚硝酸盐超标，而正常养殖水体中亚硝酸盐一般不超过0.1mg/l为宜，当亚硝酸盐积累过高后，就会抑制鱼类血液的载氧能力，造成鱼类慢性中毒，导致鱼类摄食量降低、鳃组织出现病变，呼吸困难、骚动不安，严重时则发生暴发性死亡，寻找有效控制或者降解亚硝酸盐的方法势在必行。国内外亚硝酸盐水体处理方面已开展较多的研究。尤其大部分研究人员在酶法处理亚硝酸盐养殖水体研究中取得较大的进展，亚硝酸盐还原酶作为催化剂可将亚硝酸盐氧化还原为氮气。中国发明专利“水产养殖水体原位净化复合微生物膜及其使用方法(cn201310172159.7)”公开了一种水产养殖水体原位净化复合微生物膜及其使用方法，其技术方案要点是载体选择、菌液制备，微生物固定化等步骤，将复合微生物膜安装在养殖水体中，有益微生物开始活化繁衍。尽管该固定化微生物膜结构简单，但是复合微生物膜装置极易受到外界环境的影响，不利于大规模生产。

酶法处理亚硝酸盐目前也得到重视，例如中国发明专利“一种干酪乳杆菌鼠李糖亚种的亚硝酸盐还原酶的制备方法(cn201410437877.7)”和“一种蜡样芽孢杆菌及其在制备亚硝酸盐还原酶中的应用(cn201410390980.0)”均公开了一种制备亚硝酸盐还原酶的方法，得到的nir纯度高，nir为解决蔬菜发酵、肉制品和养殖水体等3个领域中含亚硝酸盐的问题提供了一种新方法。尽管nir制备条件简单，易于操作且可循环使用等优点，但是酶固定化和酶适应性问题从而导致不能工业化处理亚硝酸盐养殖水体。而固定化酶的形式中颗粒小球占绝大多数，但固定化小球法所制得小球包菌量低、体积小、易被冲刷等无法满足亚硝酸盐养殖水体的实际处理情况。

技术实现要素：

为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种固定化酶生物反应装置及其在处理养殖水体中亚硝酸盐的应用。采用聚氨酯泡沫悬浮体作为亚硝酸盐还原酶的固定化载体，将其用渔网进一步固定，多层类渔网式固定化酶聚氨酯泡沫悬浮体有序排列形成一套固定化酶生物反应装置，利用聚氨酯泡沫悬浮体固定亚硝酸盐还原酶成球从而帮助处理养殖水体中的亚硝酸盐。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种固定化酶生物反应装置，该装置为矩形箱体，包括左右两端面和前后上下四个箱壁，两端面分别设进水口和出水口，在装置内沿水流方向竖直设置若干固定化酶滤板，所述固定化酶滤板是由聚氨酯泡沫悬浮体通过网固定形成的滤板；所述固定化酶滤板之间设有阻隔层。

优选地，所述装置的上箱壁为可拆卸的透明玻璃板。

优选地，所述阻隔层为鹅卵石和植物枝叶(如竹枝叶、杂草树叶等)。

优选地，所述前后箱壁上设有内凹式卡槽，所述固定化酶滤板可拆卸式嵌入该卡槽内。

优选地，所述装置在处理养殖水体中亚硝酸盐的应用，具体是将包埋剂与亚硝酸盐还原酶粗酶液充分混匀，吸入到聚氨酯泡沫悬浮体中，待聚氨酯泡沫悬浮体吸附饱和后，置入饱和cacl2溶液中旋转1-5min，于0～4℃交联固化12～48h，用生理盐水冲洗两次，即得负载酶的聚氨酯泡沫悬浮体；再将含亚硝酸盐养殖水体通入上述装置。

优选地，所述的包埋剂为海藻酸钠(sa)或聚乙烯醇(pva)。

优选地，所述亚硝酸盐还原酶粗酶液的制备方法，包括如下步骤：

(1)将植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)的冻干粉置于mrs培养基中，于30℃～40℃静止培养18h～36h后，制成种子液；

(2)以1％～10％的体积百分比，将上述种子液接种至诱导培养基a中，于40℃静止诱导培养18h～24h，得诱导工作发酵剂；所述诱导培养基a配方为nano25μg/ml～20μg/ml的mrs培养基；

(3)以5％～15％体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基b中，于30℃～40℃静止诱导培养24h～36h，得含亚硝酸盐还原酶的培养液；所述诱导培养基b配方为：含诱导剂nano210μg/ml～50μg/ml的mrs培养基；

(4)将含亚硝酸盐的还原酶的培养液进行离心，用生理盐水清洗后离心，得含有亚硝酸盐还原酶的菌体；

(5)加入提酶缓冲液，使含亚硝酸盐还原酶的菌体浓度为150mg/ml～400mg/ml，加入溶菌酶(购自sigma-aldrich,shanghai，酶活：70000u/mg)10mg/ml，均匀破壁后1h～5h，破壁溶液经离心后的上清液为亚硝酸盐还原酶粗酶液。

优选地，所述的溶菌酶的浓度为10mg/ml～50mg/ml。

优选地，所述的提酶缓冲液含有胰蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为2μg/ml～10μg/ml和2.0μmol/ml～20.0μmol/ml。

所述的聚氨酯泡沫悬浮体是指可悬浮于液体中的聚氨酯泡沫微生物固定化载体(该名词可参见cn200910117393纳米凹凸棒土复合亲水性聚氨酯泡沫微生物固定化载体)，但不限于由聚氨酯泡沫为主要材料制备的小球体、砖体、不规则体。

本装置处理亚硝酸盐的原理如下：亚硝酸盐养殖水体经过前期的初级沉降以及预处理过程流入类渔网式固定化酶生物反应装置，与装置内的聚氨酯泡沫悬浮体内的亚硝酸盐还原酶以及起着一定固定作用的类渔网式固定化酶滤板充分接触反应以达到降解亚硝酸盐的效果。另外其中鹅卵石是利用其具有一定的重量可以防止植物枝叶被水冲走，植物枝叶可以阻隔废水中的大颗粒废弃物，同时可以减缓水流速度从而辅助降解亚硝酸盐养殖水体中的其他污染物。上方的玻璃板可以观察水的处理情况，同时方便抽出玻璃板，实现定期清理，更换植物枝叶的作用。

本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明所用的类渔网式固定化酶生物反应装置利用养殖水体自身水封创造了几近无氧的环境，使亚硝酸还原酶使用效率更高。

(2)本发明将亚硝酸盐还原酶固定在聚氨酯泡沫悬浮体上，能够直接高效的处理亚硝酸盐养殖水体，可以防止亚硝酸盐还原酶被废水冲散带走；包埋亚硝酸盐还原酶于悬浮体中可以使亚硝酸盐还原酶混合充分。

(3)聚氨泡沫悬浮体优异的物理机械性能、保温性能、耐老化性能等特点使制得的固定化酶小球具有机械强度好、稳定性强、体表面积大、包酶量多、无毒等特点。

(4)本发明采用自然界中原有的鹅卵石和植物枝叶，植物枝叶可以阻隔废水中的大颗粒废弃物，同时可以减缓水流速度从而辅助降解亚硝酸盐养殖水体中的其他污染物。与大型净水设备相比，一方面节省大量费用，另一方面具有操作简单，能耗低的特点。

本发明植物乳杆菌为植物乳杆菌dmdl9010(lactobacillusplantarumdmdl9010)，已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏编号为cgmccno.5172，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株已在中国专利cn102978134a中公开，属于现有技术。

附图说明

图1为聚氨泡沫悬浮体示意图。

图2为类渔网式固定化酶滤板示意图。

图3为固定化酶生物反应装置结构示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

如图1、2、3所示，本发明所述的固定化酶生物反应装置为矩形箱体，包括左右两端面和前后上下四个箱壁，两端面分别设进水口1和出水口2，在装置内沿水流方向竖直设置若干固定化酶滤板5，所述固定化酶滤板5之间设有鹅卵石和植物枝叶。所述装置的上箱壁为可拆卸的透明玻璃板。所述前后箱壁上设有内凹式卡槽，所述固定化酶滤板5可拆卸式嵌入该卡槽内。

所述的固定化酶滤板5由20～60个聚氨酯泡沫悬浮体3和长1m～5m、宽10cm～20cm矩形渔网组成；其连接关系是两层矩形渔网将聚氨酯泡沫悬浮体3纵横交错固定形成类渔网式固定化酶滤板5。

实施例2

某市的鱼塘废水中亚硝酸盐含量为0.25mg/l，经过初级沉降并进行预处理后流入类渔网式固定化酶生物反应装置，该反应装置处理池由100层类渔网式固定化酶滤板构成，单个类渔网式固定化酶滤板长6.00m、宽0.08m、高1.80m，有效作用面积为10.80m²，整个处理池总的有效作用面积为10800m²。在每两个类渔网式固定化酶滤板之间含有鹅卵石、杂草树叶层，整体可以起到辅助降解亚硝酸盐的作用。聚氨酯泡沫悬浮体上固定有从耐亚硝酸菌中提取的亚硝酸盐还原酶。

本例中所述的亚硝酸盐还原酶由以下步骤制得：(1)将植物乳杆菌dmdl9010的冻干粉置于mrs培养基中，于30℃～40℃静止培养24h后，制成种子液。(2)以6％的体积百分比，将上述种子液接种至诱导培养基a中，于40℃静止诱导培养24h,得诱导工作发酵剂；所述诱导培养基a配方为nano210μg/ml的mrs培养基；(3)以10％体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基b中，于37℃静止诱导培养24h，得含亚硝酸盐还原酶的培养液；所述诱导培养基b配方为：含诱导剂nano230μg/ml的mrs培养基；(4)将含亚硝酸盐的还原酶的培养液进行离心，用生理盐水清洗后离心，得含有亚硝酸盐还原酶的菌体；(5)加入提酶缓冲液，使含亚硝酸盐还原酶的菌体浓度为300mg/ml，加入溶菌酶(购自sigma-aldrich,shanghai，酶活：70000u/mg)10mg/ml，均匀破壁后4h，破壁溶液经离心后的上清液为亚硝酸盐还原酶粗酶液，经真空冷冻干燥得亚硝酸盐还原酶粗酶粉。所述的溶菌酶的浓度为40mg/ml。所述的提酶缓冲液含有胰蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为8μg/ml和10.0μmol/ml。

本例中所述的固定化酶聚氨酯泡沫悬浮体制备过程如下：将一定量包埋剂与亚硝酸盐还原酶粗酶液充分混匀，吸入到聚氨酯泡沫悬浮体中，待聚氨酯泡沫悬浮体吸附饱和后，置入饱和cacl2溶液中旋转1min即可，于冰箱内4℃交联固化24h，用生理盐水冲洗两次，即可得聚氨酯泡沫悬浮体固定化复合菌(如图1所示)，备用。所述的包埋剂包括但不限于海藻酸钠(sa)、聚乙烯醇(pva)等。经过处理后，亚硝酸盐含量降至0.07mg/l。

实施例3

某养鸭池塘废水中亚硝酸盐含量为0.20mg/l，经过初级沉降并进行预处理后流入类渔网式固定化酶生物反应装置，该反应装置处理池由60层类渔网式固定化酶滤板构成，单个类渔网式固定化酶滤板长5.00m、宽0.08m、高2.00m，有效作用面积为10.00m²，整个处理池总的有效作用面积为10000m²。在每两个类渔网式固定化酶滤板之间含有聚氨酯泡沫悬浮体、鹅卵石、杂草树叶层，整体可以起到辅助降解亚硝酸盐的作用。聚氨酯泡沫悬浮体上固定有从耐亚硝酸菌中提取的亚硝酸盐还原酶。

本例中所述的亚硝酸盐还原酶由以下步骤制得：(1)将植物乳杆菌dmdl9010的冻干粉置于mrs培养基中，于37℃静止培养24h后，制成种子液。(2)以8％的体积百分比，将上述种子液接种至诱导培养基a中，于37℃静止诱导培养24h,得诱导工作发酵剂；所述诱导培养基a配方为nano28μg/ml的mrs培养基；(3)以6％体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基b中，于37℃静止诱导培养24h，得含亚硝酸盐还原酶的培养液；所述诱导培养基b配方为：含诱导剂nano234μg/ml的mrs培养基；(4)将含亚硝酸盐的还原酶的培养液进行离心，用生理盐水清洗后离心，得含有亚硝酸盐还原酶的菌体；(5)加入提酶缓冲液，使含亚硝酸盐还原酶的菌体浓度为300mg/ml，加入溶菌酶10mg/ml，均匀破壁后3h，破壁溶液经离心后的上清液为亚硝酸盐还原酶粗酶液，经真空冷冻干燥得亚硝酸盐还原酶粗酶粉。所述的溶菌酶的浓度为40mg/ml。所述的提酶缓冲液含有胰蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为9μg/ml和12.0μmol/ml。

本例中所述的固定化酶聚氨酯泡沫悬浮体制备过程如下：将一定量包埋剂与亚硝酸盐还原酶粗酶液充分混匀，吸入到聚氨酯泡沫悬浮体中，待聚氨酯泡沫悬浮体吸附饱和后，置入饱和cacl2溶液中旋转1min即可，于冰箱内4℃交联固化24h，用生理盐水冲洗两次，即可得聚氨酯泡沫悬浮体固定化复合菌(如图1所示)，备用。所述的包埋剂包括但不限于海藻酸钠(sa)、聚乙烯醇(pva)等。经过处理后，亚硝酸盐含量降至0.08mg/l。