促进生物反应的屏障的制作方法

专利名称：促进生物反应的屏障的制作方法
技术领域：
本发明涉及进行生物反应的系统、装置和方法。本发明特别涉及疏水性、水不混溶性或者亲脂性屏障在样品分离、纯化、修饰、和分析过程中的用途。
背景技术：
有成本效益的、易于使用的用于分析生物样品的系统、方法和装置是非常需要 的。许多可商购的系统需要花费几万至几十万美元，且具有许多活动部件，使其趋于失 灵。由于这种系统的成本和复杂性，其使用通常局限于具有支持其运行和维持的人员及 业务的临床实验室。由 Abbott Architect、Siemens Centaur、Roche Elecsys 等所代表的一类充分集成的 自动化分析仪进行免疫测定。由 Abbott m2000、Roche COBAS，bioMerieux NucliSENS
等所代表的另一类模块分析仪进行核酸测定。这些系统的复杂性大部分是进行测定中所 涉及的分离步骤的结果。模块系统也常用于研究实验室中。免疫测定分离可以通过平板洗涤器如Titertek MAP-C2、BioTek ELx50、Tecan PW 96/384等进行。核酸分离通过如下系统进行， 如 Applied Biosystems PRISM 6100> Invitrogen iPrep、 Thermo Scientific KingFisher、 Promega Maxwell 等。特别关注的是可获得低成本可靠的分析仪，因为其涉及世界范围内疾病的诊断 和管理。这个问题由与HIV感染管理相关的问题生动地说明。存在许多技术可以检测 HIV相关的核酸或者蛋白质水平。这种检测对于感染HIV患者护理的管理非常重要。然 而，这些系统的成本和复杂性阻止了其广泛应用。发明概述本发明涉及进行生物反应的系统、装置和方法。本发明特别涉及疏水性、水或 醇不混溶性或者亲脂性屏障在样品分离、纯化、修饰和分析过程中的用途。在一些实施方案中，本发明提供了生物样品纯化和/或分析装置，包括多个 样品处理室，其包含用于生物分子或者细胞纯化、修饰、分析和/或检测的试剂；以及 在两或多个室之间(例如分隔两或多个室)的亲脂性物质。在一些实施方案中，所述亲 脂性物质是蜡。在一些实施方案中，所述蜡是相变蜡，其可以取液体或者固体形式的预 定温度。例如，在一些实施方案中，所述蜡在贮存或者运输温度下取固体形式而在反应温度(例如室温)取液体形式。在一些实施方案中，所述亲脂性物质是油。在一些实施 方案中，有两个反应室。在一些实施方案中，有三个反应室。在一些实施方案中，有四 个反应室。在一些实施方案中，有五个反应室。在一些实施方案中，有六个或者更多个 反应室(例如7、8、9、10、11、……、20个、……)。在一些实施方案中，所述亲脂 性材料提供了两或多个室之间毗邻的屏障(即样品从第一个室直接进入所述亲脂性材料 以及直接穿过所述亲脂性材料进入第二个室)。在其它实施方案中，在所述亲脂性材料和 一或多个室之间存在空气、液体或者其它材料。在这种实施方案中，所述亲脂性材料以 这样的位置放置，从而使要处理的样品或者生物分子在某点间穿过该亲脂性材料从第一 个室转运至第二个室。 在一些实施方案中，所有或者部分反应室专用于样品纯化。例如，一或多个 反应室含有导致发生样品纯化现象包括但不限于细胞分解、生物分子捕获、生物分子分 离，以及细胞培养、纯化和/或分析的试剂。在一些实施方案中，所有或者部分反应室 专用于样品修饰。例如，一或多个反应室含有导致发生生物分子(例如核酸、蛋白质、 脂质等)或者细胞修饰现象包括但不限于扩增、连接、分裂、标记、延伸、降解、与配 体结合、低聚反应、转染、转化、转基因、分裂、分化及类似等的试剂。在一些实施方 案中，所有或者部分反应室专用于样品分析。例如，一或多个反应室含有使得可以对感 兴趣的生物分子或者细胞进行检测或者其它类型的分析的试剂或者其它成分。在一些实 施方案中，所述反应室含有可以产生颜色、荧光信号、发光信号或者其它可检测特性的 试剂。在一些实施方案中，将所述反应室配置为通过信号读出器(例如颜色读出器、荧 光读出器、发光读出器、人眼等)来优化信号检测。一或多个反应室可用于多种不同任 务，包括纯化、修饰、分析和/或检测。本发明不受所述反应室的配置和与彼此分离的方式所限。所述反应室每个都可 以与另一个是相同大小和形状，或者不同大小或形状。可以使用各种不同的配置。在 一些实施方案中，所述处理室是孔且所述亲脂性屏障位于所述孔的上面或者下面，从而 由一个室向另一个室转移的任何材料必须通过向上或向下以及越过移动来穿过亲脂性材 料。在一些实施方案中，所述室通过亲脂性材料的存在而形成。例如，在一些实施方案 中，将亲脂性材料在一或多个通道中(例如在玻璃、塑料或者陶瓷管中)沿一或多个点沉 积以在所述一或多个通道中区域之间形成屏障。所述通道可以是任何尺寸，包括小尺寸 的如毛细管或者微流体槽。在一些实施方案中，将所述室和屏障进行配置，从而使感兴 趣的样品或者生物分子必须穿过线性系列反应室。然而，在其它实施方案中，第一个反 应室中的样品或者生物分子可任选地跳过一个或多个其它室。在一些实施方案中，将所 述室放置在装置中，该装置具有配置好的大小或者形状以适合现有的实验设备(例如自 动化机械臂、平板支托物(例如96-孔)、热循环仪、荧光检测仪等)。在一些实施方案 中，通道用于分隔反应室，其中所有或者部分通道含有亲脂性材料。例如，在一些实施 方案中，将所述装置配置为与96孔或者384孔平板类似，具有连接两个更多孔的通道。 在一些实施方案中，两个室之间的路径含有空气、水或者其它流体，其中所述样品在进 入或者离开所述亲脂性材料之前和/或之后穿过所述空气、水或者其它流体。在一些实施方案中，反应室是含有亲水性溶液的微孔或者微管，而亲脂性物质 在部分所述室或者在单独的室中被置于溶液的上面或者下面。
在一些实施方案中，所述装置包括传送机制，可以将所希望的材料从一个反应 室中经过亲脂性材料转移至另一个反应室中。例如，在一些实施方案中，在一个反应室 中感兴趣的生物分子与磁性颗粒如磁珠结合。通过应用磁场(例如来自磁体)使得磁性 颗粒从第一个室经过亲脂性屏障移动至第二个室，从而使感兴趣的生物分子从一个室移 动到另一室。在其它实施方案中，形成电场以使用电荷将生物分子或者与所述生物分子 结合的成分(例如配体、珠、电荷标记等)从一个反应室移动至另一反应室。在一些实 施方案中，使用离心 力将感兴趣的生物分子从一个室经过亲脂性屏障移至另一室。在一 些实施方案中，使用来自真空或者抽吸的压力在室之间移动材料。本发明不受传送机制 的限制。在一些实施方案中，所述装置包括蒸汽屏障(vapor barrier)以防止或者减少在处 理或者使用期间的液体损失。在一些实施方案中，所述装置由互相叠放在一起的多个薄 层材料组成。例如，在一些实施方案中，所述薄层包含夹在塑料层之间的铝箔层。在一些实施方案中，本发明的装置以系统(例如试剂盒)形式提供，其包含可以 进行样品采集、样品处理、样品处置、数据收集、数据分析以及数据提示的一或多种其 它成分。这些成分可以是单独的装置或者可以集成在单一的多成分装置中。这些成分 可包括但不限于医学装置、环境样品处理装置、蛋白质纯化装置、核酸纯化装置、计算 机、软件等。所述系统或者装置的一或多个成分可以是自动化的。在一些实施方案中， 所述系统的一或多个成分被配置为无自动化运行。例如，在非自动化系统中，提供手持 磁体将样品从一个室移动至另一室，使用加热模块(heat block)或者水浴产生所希望的反 应温度，使用手持荧光检测仪检测信号，或者通过肉眼观测信号。本发明的系统和装置可用于多种样品。例如，在一些实施方案中，样品是生物 或者环境样品。生物样品可得自动物(包括人)，并涵盖液体、固体、组织以及气体。 生物样品包括血液产品如血浆、血清等，以及脑脊液、痰液、支气管洗涤液(bronchial washing)、支气管抽吸液(bronchial aspirates)、尿液、淋巴液，以及呼吸道、肠道和泌 尿生殖道的各种外分泌物，眼泪、唾液、乳汁、白细胞、骨髓瘤、生物液如细胞培养上 清、组织(固定或者未固定的)、细胞(固定或者未固定)等。环境样品包括但不限于环 境材料，如表面物质、土壤、水以及工业样品。附图描述

图1示出本发明的一些实施方案的用于样品纯化和PCR的药筒(cartridge)。图 Ia示出原型药筒。图Ib示出液体蜡通道的图样。图2示出本发明一些实施方案的用于样品纯化的药筒。图3示出用于构建本发明一些实施方案药筒的箔层压板(foil laminate)的层。图4示出用于本发明一些实施方案中的箔层压板药筒的图样。图5示出(a)永磁体相对于两个不混溶流体的位置，以及(b)在χ和y方向作用 于颗粒上的磁力的表面图。图6示出使用落重法(weight drop method)评估表面张力的实验安排。图7示出在基于管的微流体系统中夹层测定各个阶段的图示。图8示出FLl高度对应Log(生物素浓度)的图示。图9示出由流式细胞计量仪记录的事件对应于前向散射、侧向散射和FLl高度的图示。图10示出链霉抗生物素蛋白包被的磁性颗粒从一个毛细管向另一毛细管的移动 及随后与生物素反应的图示。图Ila示出在移动穿过含有荧光染料的油之后链霉抗生物素蛋白包被颗粒的信 号。图lib示出在移动穿过含有荧光染料的油以及随后在PBS缓冲液中搅动该颗粒之后 链霉抗生 物素蛋白包被颗粒的信号。图12示出在本发明一些实施方案中使用的两室小透明容器(cuvette)的示意图。图13示出在本发明一些实施方案中使用的两室小透明容器的示意图。图14示出使用不混溶相过滤(IPF)方法对来自血浆的HIV-I进行的qRT_PCR 相对IogltlHIV-I病毒拷贝数绘制的一式两份运行的4种不同RNA浓度的Ct值的标准曲线。图15示出对比IPF和人工纯化方法的Bland-Altman图实心黑色方块示出两种
方法之间的差异，实线(y =-0.00772)示出两种方法之间的平均差异，虚线示出平均值 +2和-2标准差(SD)。图16示出通过来自尿液样品衣原体qPCR的IPF量化。图17示出通过来自尿液样品淋病qPCR的IPF量化。图18示出对比衣原体的IPF和人工纯化方法的Bhnd-Altrmn图。图19示出对比淋病的IPF和人工纯化方法的Bhnd-Altrmn图。图20示出对来自25 μ L WB的前病毒DNA的IPF PCR。图21示出对比IPF和人工纯化方法的Bland-Altman图。定义为了便于理解本发明的揭示，术语定义如下。如本文所用，术语“亲脂性材料”是指在水、醇或者其它亲水性或者水成液体 中基本上不混溶的任何物质。在一些实施方案中，本发明的亲脂性材料对于干扰特定生 物过程如核扩增或者生物分子检测的物质具有低溶解性。在一些实施方案中，本发明的 亲脂性材料具有低蒸汽压。亲脂性物质趋于通过范德华力与其自身以及与其它物质相互 作用。它们具有很小能力乃至没有能力形成氢键。亲脂性物质典型具有大o/w(油/水) 分配系数。术语“不溶于水”以及“疏水性”材料在本说明书中可同义使用。该术语包括 在水中几乎不溶并在挥发性亲脂性溶剂如二氯甲烷以及非挥发性亲水性溶剂特别是N-甲 基吡咯烷酮(NMP)中可自由溶解的聚合物。“水混溶性”或者“亲水性”材料是指可以用至少等量部分的水稀释而不分离 的有机液体。“水不混溶性”或者“亲脂性”材料的性质是其不能用至少等量部分的水稀释 而不分离。“纯化的多肽”或者“纯化的蛋白质”或者“纯化的核酸”是指感兴趣的多 肽或核酸或者其片段，其基本上没有与所述感兴趣的多肽或者多核苷酸天然结合的细胞 成分，例如含有低于大约50%、优选低于大约70%、以及更优选低于大约90%的所述成 分。
术语“分离的”是指将所述材料从其原始环境(例如如果其是天然发生的，则 为天然环境)中取出。例如，存在于活动物体内的天然发生的多核苷酸或者多肽不是分 离的，但是与一些或者所有天然系统中共存的材料分开的相同多核苷酸或者DNA或者多 肽则是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或者多肽可以是 组合物的一部分，且在所述载体或者组合物不是其天然环境的一部分的情况下仍是分离 的。“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，并包括下文描述的所有多肽。多肽的基本结构为本领域熟知且已经在本领域的众多教科书及其它出版物中有描述。在此背 景下，该术语在本文是指包含两个或更多个在线性链中通过肽键彼此连接的氨基酸的任 何肽或者蛋白质。如本文所用，该术语既是指短链通常在本领域也称作肽、寡肽和寡聚 体，也是指长链通常在本领域称作蛋白质，其有许多类型。应意识到多肽常含有除了通常称作20个天然发生氨基酸的20个氨基酸之外的 氨基酸，且许多氨基酸、包括末端氨基酸在给定的多肽中可以是修饰的，所述修饰或者 通过天然过程如加工及其它翻译后修饰进行，也可以通过本领域熟知的化学修饰技术进 行。尽管在多肽中天然发生的一般修饰太多以至于不能在此详尽地列出，但是其在基 础教科书中和在更详细的专著中以及在众多研究文献中有很好的描述，并且为本领域 技术人员所熟知。在可以出现于本发明多肽中的已知修饰中，用于举例提及的有乙酰 化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血红素部分的共价附着、核苷 酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共 价附着、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联形成、胱氨酸形成、焦谷氨 酸形成、甲酰化、Y-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化 (myrisoylation),氧化、蛋白酶解处理、磷酸化、异戊二烯化、外消旋作用、硒化、硫酸 化、转移-RNA介导向蛋白质添加氨基酸，如精氨酰化，以及泛素化。这些修饰为本领域技术人员熟知，且已经在科学文献中有详细描述。一些 特别常见的修饰例如糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的Y-羧化、羟基化以 及ADP-核糖基化在大部分基础教科书中描述，例如Proteins—Structure and Molecular Properties, 2.sup.nd Ed., T.E.Creighton, W.H.Freeman and Company, New York (1993)。 在此问题上也有许多详细的综述可用，如例如Wold，F.，Posttranslational Protein Modifications Perspectives and Prospects, pg.1—12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C.Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983)、Seifter et al.，Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth.Enzymol.182 : 626-646 (1990)以及 Rattan et al.， Protein synthesis Posttranslational Modifications and Aging, Ann N.Y.Acad. Sci.663 48-62(1992)所述。应意识到且为本领域熟知及如上所述，多肽不总是完全线性的。例如，作为泛 素化的结果，多肽可以是分支的，且其可以是有或者没有分支的环状，通常是作为翻译 后修饰的结果，包括天然处理结果以及非天然发生的人工操控带来的结果。环状的、分 支的以及分支环状的多肽也可以通过非翻译天然过程合成以及通过完全合成方法合成。修饰可以在多肽的任何部位发生，包括肽主链、氨基酸侧链以及氨基或者羧基 末端。事实上，通过共价修饰封闭多肽中氨基或者羧基基团或者二者在天然发生的和合成的多肽中是常见的。例如，在大肠杆菌中产生的多肽的氨基末端残基在蛋白酶解处理 之前几乎总是N-甲酰甲硫氨酸。在多肽中发生的修饰通常与其如何产生相关。例如对于通过在宿主中表达克隆 的基因而产生的多肽而言，修饰的性质和程度大部分取决于宿主细胞翻译后修饰能力以 及在多肽氨基酸序列中存在的修饰信号。例如，众所周知，通常在细菌宿主如大肠杆菌 中不发生糖基化。因此，当需要糖基化时，多肽应在糖基化宿主、一般为真核细胞中表 达。昆虫细胞通常进行与哺乳动物细胞相同的翻译后糖基化，且因此昆虫细胞表达系统 已经被开发以有效表达具有糖基化天然模式的哺乳动物蛋白质。相似的考虑适用于其它 修饰。 应意识到相同类型的修饰可以以相同或者不同程度存在于给定多肽的几个部 位。给定多肽也可以含有许多类型的修饰。通常，如本文所用，术语多肽涵盖了所有这些修饰，特别是通过在宿主细胞中 表达多核苷酸而合成的多肽中存在的那些修饰。术语“成熟”多肽是指已经经历适于所述多肽和起源细胞的完全的翻译后修饰 的多肽。特定多肽的“片段”是指这样的氨基酸序列，其包含衍生自该特定多肽的至少 大约3-5个氨基酸，更优选至少大约8-10个氨基酸以及更优选至少大约15-20个氨基酸。术语“免疫学可鉴别”是指也存在于且为指定多肽所特有的表位和多肽的存 在。免疫学相同性可以通过抗体结合和/或结合竞争确定。表位的独特性也可以通过计 算机在已知数据库如GenBank检索编码表位的多核苷酸序列以及通过与其它已知蛋白质 进行氨基酸序列对比而确定。如本文所用，“表位”是指多肽或者蛋白质的抗原决定簇。可以想象，表位在 对该表位是独特的空间构象中可包含三个氨基酸。通常，表位由至少5个这种氨基酸组 成，而更通常是由至少8-10个氨基酸组成。检验空间构象的方法为本领域已知，包括例 如X射线结晶学和二维核磁共振。“构象表位”是这样的表位，其包含在免疫学可识别结构中氨基酸的特定并列 (juxtaposition)，这种氨基酸以毗邻或者非毗邻顺序存在于同一多肽上或者存在于不同多 肽上。当多肽由于所述多肽中含有的特定表位的抗体识别能力而与抗体结合时，则所 述多肽与抗体是“免疫学反应性的”。免疫学反应性可以通过抗体结合确定，更特别是 可通过抗体结合动力学和/或通过使用已知多肽作为竞争剂的结合竞争而确定，所述已 知多肽含有抗体所针对的表位。确定多肽是否与抗体是免疫学反应性的方法为本领域已 知。如本文所用，术语“含有感兴趣表位的免疫原性多肽”是指天然发生的感兴趣 多肽或者其片段，以及通过其它方式制备的多肽，例如通过化学合成或者在重组生物体 中多肽的表达。“纯化的产物”是指这样的产物制备物，其已经与所述产物正常相关联的细胞 组成部分及与可以存在于感兴趣的样品中的其它类型细胞分离。
如本文所用，“分析物”是测试样品中可能存在的待检测的物质，包括感兴趣 的生物分子、小分子、病原体等。分析物可包括蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸靶等。 分析物可在如血液、血浆或者血清、尿液等体液中是可溶的。分析物可以在组织中，在 细胞表面或者在细胞内。分析物可以在分散于体液如血液、尿液、乳房抽吸液中的细胞 上或其内，或者作为活组织检查的样品而获得。如本文所用，“特异性结合成员”是指特异性结合对的成员。即两个不同的分 子，其中一个分子通过化学或者物理方式特异性结合另一分子。因此，在通常的免疫测 定的抗原与抗体特异性结合对之外，其它特异性结合对可包括生物素和抗生物素蛋白、 碳水化合物和凝集素、互补核苷酸序列、效应物和受体分子、辅因子和酶、酶抑制剂、 以及酶等。此外，特异性结合对可包括是原始特异性结合成员的类似物的成员，例如分 析物-类似物。免疫反应性特异性结合成员包括抗原、抗原片段、抗体以及抗体片段、 其单克隆和多克隆及复合物，包括通过重组DNA分子所形成的那些。特异性结合成员包括“特异性结合分子”。“特异性结合分子”意指任何特异 性结合成员，特别是免疫反应性特异性结合成员。如此，术语“特异性结合分子”涵 盖抗体分子(得自多克隆和单克隆制备物)以及如下杂种 (嵌合)抗体分子(见例如 Winter, etal，Nature 349 293-299 (1991)和美国专利 No.4,816,567) ； F(ab' )jPF(ab) 片段；Fv 分子(非共价异源二聚体，见例如 Inbar，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69 2659-2662(1972)和 Ehrlich，et al., Biochem.19 4091-4096(1980))；单链Fv分子(sFv) (见例如 Huston，et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 5879-5883(1988))；人源化抗体分 子(见例如 Riechmann，etal., Nature 332 323-327 (1988)，Verhoeyan, et al., Science 239 1534-1536(1988)以及1994年9月21日公开的英国专利出版物No.GB2,276,169)； 以及得自这种分子的任何功能片段，其中这种片段保留亲代抗体分子的免疫学结合性 质。如本文所用，术语“半抗原”是指部分抗原或者非蛋白质结合成员，其能结合 抗体，但是除非其与载体蛋白(carrierprotein)结合否则不能激发抗体形成。如本文所用，“捕获试剂”是指未标记的特异性结合成员，其特异于夹层测定 中的分析物、特异于竞争测定中的指示试剂或者分析物，或者特异于辅助特异性结合成 员，其自身如在间接测定中一样特异于分析物。所述捕获试剂在进行所述测定之前或 者期间可以直接或者间接结合于固相材料，从而使得可以从检测样品中分离固定的复合 物。“指示试剂”包含“产生信号的化合物”(“标记”)，其能够生成以及产生可 通过外部方式检测的可测量信号。在一些实施方案中，所述指示试剂与特异性结合成员 缀合(附着)。除了是特异性结合对的抗体成员之外，所述指示试剂也可以是任何特异性 结合对的成员，包括半抗原-抗-半抗原系统如生物素或者抗生物素、抗生物素蛋白或者 生物素、碳水化合物或者凝集素、互补核苷酸序列、效应物或者受体分子、酶辅因子和 酶、酶抑制剂或者酶等。免疫反应性特异性结合成员可以是抗体、抗原、或者抗体/抗 原复合物，其在夹层测定中能结合感兴趣的多肽、在竞争测定中能结合捕获试剂或者在 间接测定中能结合辅助特异性结合成员。当描述探针和探针测定时，可以使用术语“报 道分子”。报道分子包含如上文所述的产生信号的化合物，其与特异性结合对的特异性结合成员缀合，如咔唑或者金刚烷。预期的各种“产生信号的化合物”(标记)包括产色原(chromagen)，催化剂如 酶，发光化合物如荧光素和罗丹明，化学发光化合物如二氧环乙烷(dioxetane)、吖啶鐺 (acridinium)、菲啶鐺(phenanthridinium)以及鲁米诺，放射性元素和直接观测标记。酶
的例子包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶及类似等。特定标记的选择 不是关键的，但是其应能够由其自身或者与一或多种其它物质一起产生信号。“固相”(“固体支持物”)为本领域已知的那些，包括反应盘的孔壁、试管、 聚苯乙烯珠、磁性或者非磁性珠、硝化纤维条、膜、微粒如乳胶颗粒等。所述“固相” 不是关键的，可以由本领域技术人员选择。因此，乳胶颗粒、微粒、磁性或者非磁性 珠、膜、塑料管、微滴定孔壁、玻璃或者硅芯片均是合适的例子。预期到并且在本发明 范围内的是，所述固相也可包含任何合适的多孔材料。如本文所用，术语“检测”可以描述对可检测地标记的组合物进行的一般性的 揭示或者识别的行为作用或者特异性的观测。术语“多核苷酸”是指核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、修饰的RNA 或者DNA、或者RNA或DNA模拟物的聚合物。因此，这个术语包括由天然发生的核碱 基、糖和共价核苷酸间(主链)键组成的多核苷酸，以及具有起相似作用的非天然发生部 分的多核苷酸。这种修饰的或者取代的多核苷酸为本领域所熟知，且对于本发明的目的 而言被称作“类似物”。如本文所用，术语“核酸分子”是指任何含有核酸的分子，包括但不限于DNA 或者RNA。该术语涵盖了包括DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列，包括但不 限于4-乙酰-胞嘧啶、8-羟基-Ν6-甲基腺苷、氮杂环丙基-胞嘧啶、假异胞嘧啶、 5_(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧 啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、Ν6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺 嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基 腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、Ν6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟 嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫 苷(β-D-mannosylqueosine)、5，-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基 硫-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、氧基丁氧苷 (oxybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿 嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、 假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤。术语“基因”是指核酸(例如DNA)序列，其包含产 生多肽、前体或者RNA(例 如rRNA、tRNA)所必需的编码序列。多肽可以由全长编码序列或者由所述编码序列的任 何部分编码，只要保留所希望的其全长或者片段的活性或者功能性质(例如酶活性、配 体结合、信号转导、免疫原性等)即可。该术语也涵盖结构基因的编码区和在5’和3’ 末端分别与该端距离大约Ikb或更多邻近编码区的序列，由此所述基因相应于全长mRNA 的长度。位于编码区5’端并在mRNA上出现的序列被称作5’非翻译序列。位于编 码区3’端或者下游并在mRNA上出现的序列被称作3’非翻译序列。术语“基因”涵 盖了基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或者克隆含有由称作“内含子”或者“间插区”或者“间插序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是基因被转录到核 RNAChnRNA)内的节段；内含子可含有调节元件如增强子。内含子从核或原始转录物中 被除去或者“剪除”，因此内含子在信使RNA(mRNA)转录物中缺失。mRNA在翻译期 间给定新生多肽中氨基酸的序列或者顺序。术语“核酸扩增试剂”包括用于扩增反应的常规试剂，包括但不限于具有聚合 酶活性的一或多种酶、酶辅因子(如镁或者烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD))、盐、缓冲 液、脱氧核苷三磷酸(dNTP ；例如脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸 以及脱氧胸苷三磷酸)以及调节聚合酶活性或者引物特异性的其它试剂。
如本文所用，术语“互补”或者“互补性”用于描述根据碱基配对规则相关联 的多核苷酸(即核苷酸如寡核苷酸或者靶核酸的序列)。互补性可以是“部分的”，其中 根据碱基配对规则仅一些核酸碱基匹配。或者，核酸之间可以是“完全”或者“全部” 互补性。核酸链之间的互补性程度对于核酸链之间杂交的效率和强度具有显著作用。这 在扩增反应以及依赖于核酸之间结合的检测方法中是特别重要的。术语“同源性”是指相同性的程度。可以有部分同源性或者完全同源性。部 分相同的序列是与另一序列低于100%相同。如本文所用，术语“杂交”用于描述互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即核 酸之间结合的强度)受这样的因素影响，即核酸之间互补性的程度、所涉及条件的严格 性、形成杂交体的Tm，以及核酸中G C比率。如本文所用，术语“Tm”用于描述“解链温度”。解链温度是在此温度下双 链核酸分子群变成一半解离为单链的温度。计算核酸Tm的公式为本领域熟知。如标准 参考所示，当核酸在IM NaCl水溶液中时，对Tm值的简便估计可以通过如下公式计算 Tm = 81.5+0.41 (% G+C)(见例如 Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)。其它参考包括更精密的计算，其在对Tm的计算中 考虑到结构以及序列特性。如本文所用，术语“严格性”用于描述温度、离子强度和其它化合物的存在的 条件，在此条件下进行核酸杂交。在“高严格性”条件下，核酸碱基配对将仅在具有高 频率互补碱基序列的核酸片段之间发生。因此，当希望杂交或者退火到一起的核酸彼此 不完全互补时，通常需要“弱”或者“低”严格性条件。术语“野生型”是指具有分离自天然发生来源的基因或者基因产物的特性的基 因或者基因产物。野生型基因是在群体中最常观测到的，并因此被专称作基因的“正 常”或者“野生型”形式。相反，术语“修饰的”或者“突变体”是指当与野生型基 因或者基因产物对比时在序列和/或功能性质(即改变的特性)中呈现修饰的基因或者基 因产物。注意的是天然发生的突变体可以是分离的；这些通过这样的事实鉴别即当与 野生型基因或者基因产物相比时其具有改变的特性。如本文所用，术语“寡核苷酸”定义为包含两或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖 核苷酸的分子，优选至少5个核苷酸、更优选至少大约10-15个核苷酸以及更优选至少大 约15-30个核苷酸或者更长。精确大小取决于许多因素，这些因素又继而取决于寡核苷 酸的最终功能或者用途。寡核苷酸可以以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆 转录或其组合。
由于单核苷酸以如下方式反应产生寡核苷酸，即一个单核苷酸戊糖环的5’磷酸 通过磷酸二酯键在一个方向与其相邻的3’氧原子附着，如果其5’磷酸未与单核苷酸戊 糖环的3’氧原子连接，则将寡核苷酸的末端称作“5’末端”，如果其3’氧原子未与 随后的单核苷酸戊糖环的5’磷酸连接，则将寡核苷酸的末端称作“3’末端”。如本文 所用，即使核酸序列位于较大的寡核苷酸的内部，也可以称其具有5’和3’末端。当 以5’至3’方向沿着核酸链行进时，如果沿核酸链的第一个区域的3’末端在第二个区 域的5’末端之前，则称第一个区域在另一区域的上游。当两个不同的非重叠的寡核苷酸退火至相同线性互补核酸序列的不同区域并且 一个寡核苷酸的3’末端朝向另一个的5’末端时，前者可以称作“上游”寡核苷酸， 后者称作“下游”寡核苷酸。术语“引物”是指这样的寡核苷酸，当将其置于引物延伸起始的条件下时能发 挥作为合成的起始点的作用。寡核苷酸“引物”可在如纯化的限制性消化中天然发生， 或者可以合成产生。
发明详述本发明涉及进行生物反应的系统、装置和方法。本发明特别涉及亲脂性屏障在 样品分离、纯化、修饰和分析过程中的用途。如果需要，本发明的系统、装置和方法可以配置为便宜且易于使用的样品纯化 和/或修饰和/或分析和/或检测系统。例如，本文描述的本发明的实施方案提供了 经济的方法用于广泛的生物分子检测、分析和鉴定。这些系统、装置和方法具有许多用 途。为了举例说明本发明的方面和益处，下文提供了其在核酸和蛋白质分析、特别是监 测HIV感染和状态中的应用。本发明不限于这些举例说明性的实施方案。在一些实施方 案中，本发明的系统、装置和方法与现有复杂昂贵的样品分离、纯化、修饰和分析设备 一起应用。例如，在一些实施方案中，本发明的方法用于在使用传统设备(例如热循环 仪、质谱分析仪、NMR装置等)修饰和/或分析之前进行样品分离(例如核酸或者多肽 纯化)。有三千五百万成年人和儿童忍受HIV/AIDS，其中两千两百万在撒哈拉沙漠以南 非洲。在非洲一般的诊所治疗大约400名患者，而运输的问题导致诊所数目增加而不是 大型中心机构的增长。因此，需要超过100,000台病毒负荷测量仪器。目前可利用的病 毒负荷测定的主要局限包括所需仪器的成本、复杂耗时的程序，导致需要高度培训的人 员及需要试剂的低温运输。可负担的简便HIV病毒负荷测定的开发是在发展中国家改善AIDS患者护理质 量的关键步骤。这需要将通常在中心实验室进行的自复杂诊断程序自动化成小的床旁 (POC)装置；这个能力可以准许卫生保健工作人员和患者即使在最远程情况下也获得重 要健康相关信息。所需的HIV病毒负荷测定应优选在床旁给予答复，但是将其从远程中 心实验室转移至距患者较近的社区医院实验室将改善结果。这种装置将以短的周转时间 和可负担的成本进行HIV的分离、扩增和检测。短时是关键，因为这样将减少门诊需要 的机器数量以及缩短患者在门诊花费的时间，从而降低实际成本。当在中心实验室及外出到现场(out in the field)进行HIV病毒负荷测定时必须克
服许多挑战。大的实验室使用自动化或者半自动化机器人系统来进行大体积HIV病毒负荷测定。然而，样品处理是这些检测的典型地最麻烦部分。目前，样品处理程序包括许 多步骤，通常需要离心和提取步骤。这些方法通常也不足以纯化靶核酸。其通常在反应 混合物中遗留抑制性或者干扰物质，引起扩增反应的抑制以及导致假阴性结果。目前样 品处理技术的人工操作性质也可导致标本交叉污染，其可导致假阳性结果。已经进行可观的尝试试图使样品制备过程自动化，因为这样可以更广泛使用 PCR或者其它核分析技术。然而，现有的自动化高通量系统进行多个提取和纯化步骤， 且仍需要某些人工制备，包括样品和试剂装载以及废弃物去除。因此，需要高度培训的 技术人员来进行测定和维护仪器。自动化系统非常昂贵，因为其使用复杂的机械臂来转 移溶液或者磁性颗粒以及使用精确仪器来对液体进行移液。自动化系统的成本通常难以 适合较小的实验室，尤其是在资源有限的那些实验室。交叉污染也是一个问题，因为其 应用扩增技术。临床实验室通常使用单独的室进行试剂制备、样品制备、扩增和扩增后 分析。由于这些原因，尽管已自动化，病毒负荷检测在临床实验室改进修正案(CLIA)中 仍被认为是高复杂性测试。迄今为止，对于免除CLIA的状况(CLIA-waived status)还没 有合格的核酸测试(NAT)系统，大部分是由于使样品制备和试剂处理自动化中的困难所 致。进行现场使用或者接近患者的NAT涉及甚至更多挑战，尤其是因为其不可避免 地由经验较少的使用者在非实验室环境中进行。目前已经开发了如下系统用于在现场部 署 NAT。Cepheid(Sunnyvale, CA)的GeneXpert系统是最早的基于PCR的仪器之一，其
集成了样品制备、扩增和检测。可抛弃性的单次测试GeneXpert样品制备药筒(cartridge) 由四个功能部件组成盖子、筒体、阀门体组件以及小体积PCR反应管。筒体内部分为 许多各种大小和功能的室，一些室含有冻干的试剂珠，并且每个在底部均具有一个开口 (port)用于流体流入和流出。所述室围绕中心的注射桶成放射状排列。阀门体组件位于 筒体下面，是细胞分解和DNA纯化部位，在软件控制下，仪器上的旋转阀使得阀门体组 件移动，从而使流体可以从合适的室内吸出或者分配至其中，用于根据程序化测定方案 来进行混合、稀释和洗涤。反应管突出于筒体外，接受制备的样品并连接PCR反应器以 进行靶分析物的扩增和检测。为了在GeneXpert系统上进行测试，操作者打开筒盖，将 液体样品装载入样品室内。当操作者关闭盖时，所述药筒在整个检测程序和生物毒害清 除中被持久密封，消除样品交叉污染的任何风险。通过在药筒下直接产生的超声搅动阀 门体组件中的微小玻璃珠而使细胞分解。提取的DNA流入含有固定化DNA探针的微流 体通道中，DNA作为细胞碎片流经所述探针。之后结合的DNA被从其附着部位释放并 洗脱以进行PCR扩增。由 IQuum Inc (Allston，MA)开发的另一系统是 Liat Molecular Analyzer，基于其 专有的lab-in-a-tube(Liat)技术平台。所述Liat试管使用柔性试管作为样品容器，并在 试管节段中含有预先包装的所有测定试剂。单位剂量试剂和内部对照物可以通过使用可 剥离的封条以用于测定的顺序分别地置于一系列试管节段中。所述可剥离的封条通过塑 料试管的热焊接形成。通过对邻近每个封条的试管节段施加压力，所述封条可爆开而释 放试剂。在Liat分析仪中，多个样品处理器模块与Liar试管排列在一起。每个模块由 执行器(actuator)和夹具组成，其位置可被控制以操纵试管内的测试样品。可收回的磁体附着于一个模块以操纵磁珠。当将试管装载入分析仪中时，所述执行器和夹具相继挤压 试管以使试剂和对照物从一个节段移动到另一个。相似地，通过同步执行器与夹具的动 作，可以在试管内进行各种样品处理过程。这些过程包括调节节段中的液体体积；释放 试剂至相邻节段；混合试剂与样品；在给定温度搅动并温育反应混合物；以及洗涤及从 节段中除去废弃物。废弃物移向盖子中的废弃物室，而纯化的样品移向该管的更下层。 在最下面的室内，释放的DNA被扩增。用于现场使用的其它商业化实时PCR装置包括Idaho Technology Inc. (Salt Lake City)提供的 Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device、 Lawrence Livermore National Laboratory (Livermore, CA)提供的 Hand-HeldAdvanced Nucleic Acid Analyzer, 以及Smiths Detection (Pine Brook，NJ)提供的Bio-Seeq检测仪。然而，这些装置不具有
自动化样品制备和试剂处理功能。上述系统是在正确方向上的步骤。然而，GeneXpert在操作上仍具有一定复杂性，并需要经培训的技术人员操作。由于其需要使用者现场移液，因此需要精确测量仪 器，这进一步增加了该系统成本。尽管Liar MolecularAnalyzer不包括在现场测量精确液 体体积，但是由于需要复杂机械系统以精确移动流体而成本较高。Liat试管难以生产， 使得质量控制较难。所述试管难以贮存且具有渗漏问题。小量的分子如蛋白质和化学试剂的受控移动和输送代表了微流体技术中的一个 现有的挑战，且对于开发POC装置如HIV病毒负荷装置有关键重要性。大多数微流体系 统依赖于流体运动以使分子溶液从一个部位移向另一部位，结果这些系统非必须地消耗 溶剂和材料且涉及控制流体流动的复杂机械系统。本发明的实施方案提供了另外的方法 解决此问题，该方法使用磁性微粒作为载体使分子从一个反应介质移至下一介质并从该 系统中去除了所有的流体流。其中磁性颗粒由磁力操纵的这种方法使得可以进行复杂的 化学反应，如以低成本在密封药筒中进行的病毒负荷测试。由于该反应中的驱动力是磁 场，因此该系统可以是自动化的，使得可以构建便携可靠系统进行病毒负荷测试而无污 染问题。虽然当前系统举例用于HIV病毒RNA的样品纯化，但是该平台可轻易地扩展 至其它核酸测试和免疫测定，以及其它感兴趣的生物分子或者非生物分子的检测。本发明的实施方案提供了用于在单一仪器中进行样品纯化和分析测定的装置。 在一个举例的实施方案中(见例如实施例1)，其包括使用磁性颗粒作为固相以捕获 RNA,随后纯化及释放RNA以进行扩增和检测。常规装置通过交换与固相接触的溶液而进行测定。所述固相可以是微滴定孔、 微粒或者包装的柱。即使当固相是顺磁性颗粒(PMP)时，也典型在单一容器中通过磁性 捕获微粒并交换溶液来进行测定。本发明的实施方案使用多个室容纳测试样品和基于水 或者水_醇混合物洗涤缓冲液以及进行分析的缓冲液。室内的基于水的溶液由与该溶液 不混溶的亲脂性材料(例如蜡或者油)分隔。在一些实施方案中，使用蜡材料和孔进行 举例说明。不同孔中的蜡彼此连接形成蜡通道(图1)。所述蜡可以是固化的以便于贮存 和运输。在测定期间，使蜡熔化并将PMP拖入蜡中，并通过将其从一个室穿过蜡移至另 一室。磁场用于产生移动PMP及使其穿过基于水的溶液与蜡之间界面所需要的力。最 大的力用于移动颗粒经过该界面并使用柔性顶部平板以使磁体接近该界面并降低产生所 述力所需的磁体的强度。
移动PMP而非液体消除了在自动化处理器中对泵和抽吸器的需要以及对培训技 术人员等分液体的需要。蜡的使用消除了对在床旁分析仪中使用的单次使用测试药筒中 室之间阀门的需求。通过减少从一个孔转至(carryover)下一孔的液体量也减少了从一个 室转至下一室的抑制剂的量。由于用于移动颗粒的力是磁力，因此该系统可以是完全密 闭的，显著降低了污染风险，污染是灵敏性测定如PCR的主要问题。I.装置 如上所述，本发明提供了产生和使用低成本装置进行样品制备和分析的能力。 在一些实施方案中，所述装置是单次使用或者多次使用和可抛弃性的。在一些实施方案 中，所述装置使用塑料(或者其它材料)药筒，其包含多个样品处理(例如样品制备和/ 或分析)孔。每个孔包含用于样品制备或者分析的试剂。试剂的性质依赖于所使用的特 定样品及分析方法。在一些实施方案中，所述药筒由化学惰性且提供适当机械强度的任 何材料组成。在一些实施方案中，所述药筒使用箔层压板构造，其包含用作蒸汽屏障目 的的铝层以及与试剂接触的惰性聚合物层。在涉及RNA纯化和分析的实施方案中(例如 病毒检测或者荷载测定)，优选所述药筒是无RNA和RNAse的。本领域已知的灭菌方法 可用于在使用之前对所述药筒进行灭菌。本发明实施方案的药筒用分隔样品处理室的材料覆盖。在一些实施方案中，所 述材料是亲脂性材料，其具有相变特性且与样品制备和分析的试剂以及样品中可干扰扩 增和检测的物质不混溶。在一些实施方案中，所述材料是蜡。在一些实施方案中，所 述蜡在室温是液体。在其它实施方案中，所述蜡在室温是固体而在适于反应的温度是液 体。在其它实施方案中，所述亲脂性材料是油。所述亲脂性材料可以在使用温度、大小 排阻、稳定性等方面加以选择以最适用于感兴趣的特定分子。在一些实施方案中，所述亲脂性材料分隔样品处理室。在其它实施方案中，所 述亲脂性材料位于室之间，但是在室之间不形成物理屏障。在这种实施方案中，样品在 穿过所述亲脂性材料之前或者之后可以穿过空气或者其它试剂。本发明不限于特定的亲脂性材料。在一些实施方案中，亲脂性材料在水和醇中 不混溶，在水中呈现出低溶解性(例如ppm)，是化学惰性的，具有与测定处理相适合的 熔点和沸点(例如全氟化己烷(perfluorohexame)具有56 °C的bp)，具有与水不同的比重 (例如在水中漂浮或者下沉)，具有低膨胀系数，以及在50°C长期稳定(例如几周、几个 月或者几年)。可用于本发明实施方案中的可商购亲脂性材料包括但不限于Chill-OutH蜡(MJ Research)，石蜡蜡如IGI 1070A,微晶蜡如IGI Micosere 5788A，大豆和棕榈蜡如IGI R2322A，蜡烛蜡如IGI 6036A，热固性蜡如IGI Astorstat75，热熔性胶粘剂，无规聚丙烯
和聚烯烃化合物，石油蜡以及牙科用蜡。在其它实施方案中，使用天然蜡如动物蜡(例如蜂蜡、羊毛脂或者)牛脂，植物 蜡(例如巴西棕榈蜡、大戟蜡和大豆蜡)或者矿物质蜡如化石或者泥土(例如地蜡或者褐 煤蜡)或者石油蜡(例如石蜡或者微晶蜡)。在其它实施方案中，使用合成的(人造)蜡 如乙烯(ethylenic)聚合物(例如聚乙烯或者多元醇醚-酯)、氯化萘或者碳氢化合物类型 蜡(例如 Fischer-Tropsch)。在一些实施方案中，使用油如矿物质油、石蜡油、硅油、氟硅氧烷、氟代烃油(例如来自3M的Fluorinert FC-40)、全氟化碳液(例如来自F2Chemicals的Flutec Fluids)、全氟萘烷(例如来自 Aldrich 的 P9900，FlutecPP6, FluoroMed APF-140HP)、全 氟全氢化菲(perfluoroperhydrophenanthrene)(例如 FluoroMed APF-2I5M)或者全氟化辛基 溴(perfluorooctylbromide)(例如 FluoroMed APF-PF0B)。其它的屏障材料包括但不限于1，4-二恶烷、乙腈、乙酸乙酯、叔丁醇、环己 酮、二氯甲烷、叔戊醇、叔丁基甲基醚、丁基乙酸酯、己醇、硝基苯、甲苯、辛醇、辛 烷、碳酸丙烯酯以及环丁砜(见例如 Chin et al.，Biotechnology and Bioengineering 44 140(1994)，以其全部内容援引加入本文)。
在进一步实施方案中，使用离子性液体(例如BMIM[PF6]、BMIM[Tf2N]和
0MA[TGN]，其中BMIM-双(三氟甲烷磺酰基)亚胺，PF6 = 1-η_ 丁基-3-甲基咪唑 六氟磷酸酯/盐，TfN2 =双(三氟甲基磺酰基)亚胺，以及OMA =甲基三辛基铵)作 为屏障材料。在其它实施方案中，使用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐/酯EC0ENG 21M、 1-乙基-3-羟基甲基批啶鐺硫酸乙酉旨(l-Ethy:i-3-hydroxymethylpyridinium ethylsulfate)、丁基甲基吡咯烷鐺双(三氟甲基磺酰基)亚胺(Butylmethylpyrrolidinium bis (trifluoromethylsulfonyl) imide)、EC0ENG 212 或者 ECOENG 111IP (均可从 Solvent Innovations获得)作为屏障材料。所述装置的不同隔间中提供的试剂可以是进行样品制备和分析的任何试剂。例 子包括但不限于细胞裂解缓冲液、洗涤缓冲液、亲和性试剂、洗脱缓冲液以及用于生 物测定的反应成分。本发明的装置适于纯化各种生物分子，包括但不限于核酸(例如 RNA,基因组DNA、寡核苷酸等)、蛋白质(例如肽、肽片段、寡聚蛋白质、蛋白质复合 物、膜蛋白等)以及抗体。本发明的装置适于进行任何数目的生物测定，包括但不限于 RNA或者DNA扩增(例如PCR、TMA、NASBA)、核酸检测(例如杂交测定)以及免 疫测定。在一些实施方案中，所述装置包括将样品从该装置的一个隔间转运至下一隔间 的部件。在一些实施方案中，样品与磁珠结合，转运部件是磁体。在其它实施方案中， 转运部件产生电流以转运样品。在进一步实施方案中，使用离心力转运样品，转运部件 产生这种力(例如通过移动该装置产生)。在其它实施方案中，使用比重大于水的流体， 从而该流体不用机械干预而流动。在一些实施方案中，所述装置包括检测部件以检测标记的或者另外存在的生物 样品或者测定产物。例子包括但不限于分光光度计、质谱分析仪、NMR、显微镜等。在 一些实施方案中，从该装置的最后隔间直接对产物读数(例如使用用于分光术的窗)。在 其它实施方案中，从所述装置取出产物(例如使用该装置的自动化部件)进行检测。本发明的实施方案进一步提供了这样的装置，其包含由亲脂性材料“壁”分隔 的反应物的流动室(例如垂直柱)，所述“壁”防止反应物混合但是允许微粒通过(例如 由磁体转运的磁性颗粒)。在一些实施方案中，所述装置及其应用是自动化的。自动化系统包括样品纯化 和分析装置、移动样品通过该装置的转运部件，以及足够或者用于过程自动化的任何其 它必需部件(例如预处理试剂和样品转运或者分析后检测或者进一步分析部件)。在使用磁性转运的一些实施方案中，转运部件包含在该装置的室之间移动的磁体。在其它实施 方案中，所述装置相对于静止磁体或者其它转运装置而移动。II.方法如上所述，本发明提供了样品制备和分析装置及使用所述装置的方法。A.样品根据本发明揭示的方法，可以检测怀疑含有待纯化和/或分析的预期材 料的任 何样品。在一些实施方案中，所述样品是生物样品。这种样品可以是细胞(例如怀疑 感染了病毒的细胞)、组织(例如活组织检查样品)、血液、尿液、精液，或者其一部分 (例如血浆、血清、尿液上清、尿液细胞沉淀或者前列腺细胞)，其可以得自患者或者其 它生物材料来源，例如尸检组织样品或者法医学材料。在将样品与装置接触之前或者作为装置或者自动化系统的一个部件，样品可以 被处理以分离或者富集样品的所希望分子。使用标准实验室实践的各种技术可用于此目 的，如例如离心、免疫捕获、细胞裂解以及核酸靶捕获。在其它实施方案中，本发明实施方案的方法用于纯化和/或分析完整细胞(例如 原核细胞或者真核细胞)。B.纯化方法在一些实施方案中，本发明的装置用于样品制备和纯化。可以利用任何合适的 纯化方法，包括但不限于靶捕获、洗涤、沉淀等等。在一些实施方案中，样品纯化完全 在所述装置中进行，且不需要任何额外的纯化步骤。纯化可以在一或多个反应室中进 行。这样将降低纯化的复杂性以及减少成本。本领域技术人员意识到具体的纯化方法取 决于靶生物样品的性质。C.修饰/分析/检测纯化的样品可以通过使用任何合适方法检测，包括但不限于本文揭示的那些方 法。下文举例描述了针对生物分子如核酸和蛋白质的示例技术。根据希望或者需要，其 它技术可用于生物分子或者非生物分子。i.核酸检测核酸修饰/分析/检测方法的例子包括但不限于核酸测序、核酸杂交以及核酸扩 增。用于举例说明的非限制性核酸测序技术的例子包括但不限于链终止子(Sanger)测序 和染料终止子测序。本领域技术人员将意识到由于RNA在细胞中较不稳定且更易于受核 酸酶攻击，因此实验上RNA在测序之前通常被逆转录为DNA。用于举例说明的非限制 性核酸杂交技术的例子包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列以及Southern或者Northern 印迹。核酸可以在检测之前或者在检测同时被扩增。用于举例说明的非限制性核酸扩增技术的例子包括但不限于聚合酶链反应 (PCR) >逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链反应 (LCR)、链置换扩增(SDA)以及基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域技术人员将意 识到某些扩增技术(例如PCR)需要在扩增前将RNA逆转录为DNA (例如RT-PCR)，而 其它扩增技术直接扩增RNA (例如TMA和NASBA)。聚合酶链反应(美国专利Νο.4,683,195、4,683,202、4,800,159 和 4,965,188， 每个专利均以其全部内容援引加入本文)，通常称作PCR，其使用多次循环的变性、引物对与相反链退火以及引物延伸，使得靶核酸序列的拷贝数呈指数增长。在称作 RT-PCR的变化中，逆转录酶(RT)用于从mRNA中产生互补DNA(cDNA)，然后通过 PCR扩增该cDNA产生DNA的多个拷贝。关于其它各种PCR的变化，见例如美国专 利 No.4,683,195、4,683,202 和 4,800,159 ； Mullisetal, Meth.Enzymol.155 335(1987)以 及Murakawa etal.，DNA 7 287 (1988)所述，所述每个文献均以其全部内容援引加入本 文。
转录介导的扩增(美国专利No.5,480,784和5,399,491，所述文献均以其全部内容 援引加入本文)，通常称作TMA，其在基本恒定的温度、离子浓度以及pH条件下自催化 地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自催化地产生另外的拷贝。 见例如美国专利No.5,399,491和5,824,518，所述文献均以其全部内容援引加入本文。在 U.S.公开号20060046^5 (在此以其全部内容援引加入)中所描述的变化中，TMA任选结 合使用封闭部分、终止部分及其它修饰部分以改善TMA过程的灵敏性和精确性。
连接酶链反应(Weiss，R.，Science 254 1四2 (1991)，在此以其全部内容援引 加入)，通常称作LCR，其使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。在 热变性、杂交和连接的重复循环中，DNA寡核苷酸通过DNA连接酶共价连接，产生可检 测的双链连接的寡核苷酸产物。
链置换扩增(Walker,G.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 392-396 (1992)； 美国专利No.5,270,184和5,455,166，所述文献在此以其全部内容援引加入)，通常称作 SDA,其使用引物对序列与靶序列的相反链退火、在存在dNTP α S的条件下引物延伸循 环以产生双链半硫代磷酸化(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，内切核酸酶介导半修 饰的限制性内切核酸酶识别位点的切口，以及聚合酶介导的从切口的3’末端的引物延伸 以置换现有链及产生用于下一循环引物退火、切口和链置换的链，导致产物呈几何级数 扩增。嗜热SDA(tSDA)在基本相同的方法中在较高温度使用嗜热内切核酸酶和聚合酶 (EP Pat.No.O 684 315)。
其它扩增方法包括例如基于核酸序列的扩增(美国专利No.5,130,238，在此 以其全部内容援引加入)，通常称作NASBA;其使用RNA复制酶扩增探针分子自身 (Lizardi etal.，BioTechnol.6 1197(1988)，在此以其全部内容援引加入)，通常称作复制酶；基于转录的扩增方法(Kwoh etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 1173(1989))； 以及自动维持序列扩增(Guatelli et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 1874 (1990)，所 述文献在此均以其全部内容援引加入)。对于已知扩增方法的进一步论述见Persing， David H., “ In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques " in Diagnostic Medical Microbiology Principles and Applications (Persing et al., Eds.), pp.51-87 (American Society for Microbiology, Washington, DC (1993))。
未扩增的或者扩增的靶核酸可以通过任何常规方式检测。例如，靶mRNA可以 通过与可检测地标记的探针杂交及测量所得杂交体而进行检测。用于举例说明的非限制 性检测方法的例子如下文描述。
一种用于举例说明的检测方法是杂交保护测定(HPA)，其涉及将化学发光寡核 苷酸探针(例如吖啶鐺酯(acridinium ester，AE)标记的探针)与靶序列杂交，选择性水 解在未杂交探针上呈现的化学发光标记，以及在光度计中测量从剩余探针中产生的化学发光。见例如美国专利 No.5,283,174 和 Norman C.Nelson et al.，Nonisotopic Probing, Blotting, and Sequencing, ch. 17 (Larry J.Kricka ed., 2d ed.1995,所述文献在此均以其全部内容援引加入本文)。
另一用于举例说明的检测方法提供了对扩增过程的实时定量评估。对扩增过程 的“实时”评估涉及在扩增反应期间持续或者定期确定反应混合物中扩增子的量，以及 使用所确定的值计算样品中最初存在的靶序列的量。基于实时扩增的确定样品中最初存 在的靶序列的量的许多方法是本领域熟知的。这些方法包括在美国专利No.6,303,305和 6,Ml,205中揭示的方法，所述文献在此以其全部内容援引加入。不基于实时扩增的确定 样品中最初存在的靶序列的数量的另一方法在美国专利No.5,710,0 中揭示，所述文献在 此以其全部内容援引加入。
扩增产物可以通过使用各种自身杂交(self-hybridizing)探针实时检测，大多数 所述探针具有茎-环结构。这种自身杂交探针被标记，从而其发射出可不同地检测的信 号，这取决于探针是自身杂交状态还是经与靶序列杂交改变的状态。通 过非限制性例 子，“分子火炬(moleculartorch)”是一类自身杂交探针，其包含自身互补性的独特区域 (称作“靶结合结构域”和“靶闭合结构域(closing domain) ”)，其通过结合区(例如非 核苷酸接头)连接起来且其在预定的杂交测定条件下彼此杂交。在优选的实施方案中， 分子火炬在靶结合结构域中含有单链碱基区，其长度为1至大约20个碱基且易于在链置 换条件下与存在于扩增反应中的靶序列接近而杂交。在链置换条件下，分子火炬的可以 完全或者部分互补的两个互补区域的杂交是有优势的，除非存在靶序列，其将结合靶结 合结构域中存在的单链区域并置换所有或者部分靶闭合结构域。分子火炬的靶结合结构 域和靶闭合结构域包含可检测的标记或者一对相互作用标记(例如发光剂/猝灭剂)，所 述标记经定位使得当该分子火炬自身杂交时与该分子火炬与靶序列杂交时产生不同的信 号，从而可以在存在未杂交的分子火炬的条件下检测出检测样品中的探针靶双链体。 分子火炬和许多类型的相互作用标记对是已知的(例如美国专利No.6,534,274，所述文献 在此以其全部内容援引加入)。
另一具有自身互补性的检测探针的例子是“分子信标”(见美国专利 No.5,925,517和6,150,097，所述文献在此以其全部内容援引加入)。分子信标包括这样的 核酸分子，其具有靶互补序列、在扩增反应中不存在靶序列时使探针保持在密闭构象的 亲和性对(或者核酸臂)、以及当探针处于密闭构象中时相互作用的标记对。靶序列与靶 互补序列的杂交分开亲和性对的成员，从而使探针转变为开放构象。向开放构象的转变 可以检测，这是因为标记对的相互作用降低，所述标记对可以是如荧光团与猝灭剂(例 如 DABCYL 与 EDANS)。
其它自身杂交探针也为本领域技术人员熟知。非限制性例子，具有相互作用标 记的探针结合对(例如见美国专利No.5,928,862，在此以其全部内容援引加入)可适用于 本文所揭示的组合物和方法中。也可以使用用于检测单核苷酸多态性6NP)的探针系 统。其它检测系统包括“分子开关”(例如见U.S.Publ.No.200500似638，在此以其全部内 容援引加入)。其它探针如那些包含插入染料和/或荧光染料的探针也可用于在本文揭示 的方法中检测扩增产物(例如见美国专利No.5,814,447，在此以其全部内容援引加入)。
在一些实施方案中，检测方法是定性的(例如特定核酸的存在与否)。在其它实施方案中，其是定量的(例如病毒负荷)。
ii.蛋白质检测
蛋白质检测方法的例子包括但不限于酶测定、直接观测以及免疫测定。在一些 实施方案中，免疫测定使用针对纯化蛋白质的抗体。这种抗体可以是多克隆或者单克隆 的、嵌合的、人源化的、单链或者Fab片段，其可以被标记或者未标记，所有这些均通过 使用熟知方法和标准实验室技术产生。见例如Burns，ed.，Immunochemical Protocols, 3rd ed.， Humana Press (2005) ； Harlow and Lane, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ； Kozbor et al，Immunology Today 4 72(1983) ； Kohler andMilstein, Nature 256 : 495 (1975)。在一些实施方案中，使用可商购的抗体。
D.数据分析
在一些实施方案中，在纯化和检测之后，使用基于计算机的分析程序将由检测 测定所产生的原始数据(例如指定靶分子的存在、不存在或者量)翻译成提供给临床医生 或者研究人员的预测值的数据。在一些实施方案中，将软件程序集成进自动化装置中。 在其它实施方案中，其位于远程。临床医生可以使用任何合适方式存取数据。因此，在 一些优选的实施方案中，本发明提供了进一步的益处，即不太可能经过遗传学或者分子 生物学培训的临床医生不需要理解原始数据。数据以其最有用的形式直接呈现给临床医 生。然后临床医生可以立即使用该信息优化对对象的护理。
能向和从进行测定的实验室、信息提供、医务人员和对象接受、处理和传送信 息的任何方法均可以使用。例如，在本发明的一些实施方案中，样品(例如活组织检查 或者血清或者尿液样品)得自对象并呈递给服务机构(例如医疗机构的临床实验室，基因 组谱分析公司(genomic profiling business)等)，其位于世界上任何地方(例如在与所述对 象居住地或者信息的最终使用地不同的地区)以产生原始数据。当样品包含组织或者其 它生物样品时，对象可以去医疗中心以获得样品并送至谱分析中心，或者对象可以自己 收集样品(如尿样)并直接送至谱分析中心。当样品包括先前确定的生物学信息时，所 述信息可以通过对象直接送至谱分析服务机构(例如含有所述信息的信息卡可以由计算 机扫描并用电子通讯系统将数据传输至谱分析中心的计算机)。一旦谱分析服务机构接收 后，样品被处理并产生对象所需的特异于诊断或预后信息的谱(即表达数据)。
然后将谱数据制备成适合治疗性临床医生解读的格式。例如，不是提供原始数 据，而是制备格式可以代表对对象的诊断或风险评估(例如病毒载荷水平)，连同特定治 疗选项的建议一起。数据可以通过任何合适方法展示给临床医生。例如，在一些实施方 案中，谱分析服务机构生成一份报告，报告可以打印给临床医生(例如在床旁)或者在计 算机监视器上展示给临床医生。
在一些实施方案中，首先在床旁或者在地区性机构分析信息。然后将原始数据 输送至中心处理机构做进一步分析和/或将该原始数据转变成可为临床医生或者患者所 用的信息。中心处理机构提供数据分析的隐私性(所有数据均在统一安全方案下贮存在 中心机构中)、速度和一致性的优势。然后中心处理机构可在治疗对象后控制数据结局 (fate) 0例如，使用电子通讯系统，中心处理机构可以为临床医生、对象或者研究人员提 供数据。
在一些实施方案中，对象能够使用电子通讯系统直接存取数据。所述对象基于结果可以选择进一步介入或者咨询。在一些实施方案中，所述数据用于研究用途。 例如，数据可用于进一步优化作为疾病特定状况或阶段的有用指示的标记的包含或者清 除。
E.组合物与试剂盒
在一些实施方案中，本发明的系统和/或装置以含有进行纯化和分析必需的所 有成分(例如预加载在装置中)来交付。在其它实施方案中，另外的反应成分可以在分 隔的容器中提供，所述容器包装在一起形成试剂盒。
任何这些组合物，单独或者与本文揭示的或者本领域熟知的其它组合物组合， 可以以试剂盒形式提供。试剂盒可进一步包含合适的对照物和/或检测试剂。可用于本 发明所述任何方法中的任一种或多种试剂均可提供在所述试剂盒中。
实验
如下实施例是提供用来证明和举例说明本文所揭示的组合物和方法的某些优选 的实施方案和方面，但是不应被理解为限制本发明的范围。
实施例1
这个实施例描述了使用磁力移动顺磁性微粒以捕获RNA，随后纯化以及释放 RNA用来扩增和检测。其还显示了液体蜡的使用，作为例证的亲脂性材料，以及作为各 个室之间的阀门，其允许顺磁性微粒移动同时在各个洗涤缓冲液之间形成屏障。
(a)药筒的制作
通过加工无菌清洁的圆底聚苯乙烯96孔平板制备进行测定用的单个药筒(图 la)。使用符合FDA的光面(plain back) 1/16〃聚丙烯薄板来制成蜡通道。为了制作蜡 通道，将准备用于低表面能基材的9495LE丙烯粘性传送带(adhesive transfer tape) (3M， St.Paul, MN)粘在切割成适当规格的长方形塑料片两侧。从塑料片碾压(mill out)出长方 形通道。碾压过程也切削胶带。鉴于聚丙烯的不良热传导性和低熔点，在加工时要特别 小心。在通道的加工期间形成的毛边使用刀片除去。顶板也是用聚丙烯薄板制成。在 顶板上穿几个小孔以用于导入流体。
聚丙烯用于制成顶板和通道是由于其极佳的化学抗性。饱和的烯链对大多数油 和溶剂以及基于水的化合物、肥皂和中等酸和碱产生抗性。很少数具有聚丙烯强度性质 的其它材料达到匹配聚丙烯的化学抗性。聚丙烯坚硬的、高度光滑的表面使其对于担心 会干扰药筒的流动灭菌的环境是理想的优选在检测期间维持无RNA环境。虽然商购 的塑料平板是用Y射线照射来灭菌，开发了可以在实验室容易进行的对塑料部分进行灭 菌的方案。在对所述平板进行加工之前，将待用于测试的孔用粘性带密封。在加工完成 后，使用如下方案洗涤所述药筒
a.用水洗涤两次
b.用100 %乙醇洗涤两次
c.用 RNaseZap RNase 净化溶液(Ambion，Austin, TX)洗涤
d.用水洗涤两次。
在完成洗涤之后，将药筒在50°C干燥过夜。
RNA纯化测定
使用400 μ L 含有 IO6 个拷贝 /mL Armored RNA (Abbott Molecular, DesPlaines,IL)的血浆样品进行测定。使用Armored RNA而不是裸RNA作为检测样品是因为其对核 糖核酸酶具抗性且易于通过RNA拷贝数量化。其也是非感染性的，这使其易于操作。
为了从血浆样品纯化RNA，使用MagMAXViral RNA Isolation试剂盒(Ambion， Austin, TX)。在这种方法中，使用基于硫氰酸胍溶液的传统方法破坏细胞。这同时释 放病毒RNA及使样品基质中的核酸酶失活。然后所述RNA在存在离液剂和醇的条件下 结合二氧化硅包被的磁珠。然后将该珠在水性低盐缓冲液中洗涤和洗脱。
裂解/结合溶液和珠混合物的制备在表1所示裂解/结合溶液浓缩物中加入载 体RNA并简单混合。随后加入100%异丙醇。为了制备珠混合物，对每个反应将10 μ L RNA结合珠与10 μ L裂解增强剂混合。该珠经涡旋之后分成等份。
表1 :为制备裂解缓冲液加入的试剂体积
权利要求
1.生物样品处理装置，其包括a)两或更多个包含样品处理试剂的样品处理室；以及b)在至少两个所述两或更多个样品处理室之间的水和醇不混溶性、疏水性或者亲脂 性材料，由此当样品在第一和第二处理室之间移动时移动穿过所述材料。
2.权利要求1的装置，其具有由所述材料分隔的三或更多个样品处理室。
3.权利要求1的装置，其具有由所述材料分隔的四或更多个样品处理室。
4.权利要求1的装置，其具有由所述材料分隔的五或更多个样品处理室。
5.权利要求1的装置，其中每个所述样品处理室均包含样品纯化试剂。
6.权利要求1的装置，其中所述样品处理室选自由以下组成的组包含样品纯化试 剂的样品纯化室，包含样品分析试剂的样品分析室以及样品纯化室和样品分析室的混合 物。
7.权利要求1的装置，其中所述亲脂性物质是蜡。
8.权利要求1的装置，其中所述亲脂性物质是油。
9.权利要求1的装置，其进一步包含安置的磁体以使磁性颗粒从所述样品纯化室移动 到所述样品分析室。
10.权利要求1的装置，其中所述装置包括蒸汽屏障。
11.权利要求1的装置，其中所述装置包括夹在塑料层之间的铝箔层。
12.—种系统，其包含a)生物样品处理装置，其包括两或更多个包含样品处理试剂的样品处理室，以及 在所述至少两个所述样品处理室之间的水和醇不混溶性、疏水性或者亲脂性材料；以及b)配置为在所述样品处理室之间转运至少部分样品的样品转运部件。
13.权利要求12的系统，其中所述样品转运部件包括磁体。
14.权利要求12的系统，其进一步包括样品检测部件。
15.—种处理生物样品的方法，包括a)将样品置于第一室内，所述第一室包含第一处理试剂以产生经处理的样品；b)使所述经处理的样品移动穿过水和醇不混溶性、疏水性或者亲脂性屏障至第二室；c)在所述第二室内用第二处理试剂处理所述经处理的样品，产生经进一步处理的样品 O
16.权利要求15的方法，其中所述第一和/或第二处理试剂是纯化试剂。
17.权利要求16的方法，其中所述第一试剂是捕获试剂，所述第二试剂是洗涤试剂。
18.权利要求16的方法，其中所述第一试剂是纯化试剂，所述第二试剂是分析试剂。
19.权利要求15的方法，其中所述纯化的样品包含与磁性颗粒结合的所述生物分子。
20.权利要求19的方法，其中所述移动包括使用磁体从所述第一室拖动所述磁性颗粒 进入所述屏障，然后进入所述第二室。
21.权利要求15的方法，其中所述生物分子是完整细胞、RNA、DNA或者蛋白质。
22.权利要求15的方法，其中将所述纯化的样品在移至所述第二室之前移动至一或多 个其它室。
23.权利要求22的方法，其中所述一或多个其它室包含洗涤试剂。
24.权利要求15的方法，其中所述第二处理试剂包含核酸扩增试剂。
25.权利要求15的方法，其中所述第二处理试剂包含核酸检测试剂。
26.权利要求15的方法，其中所述第二处理试剂包含多肽检测试剂。
全文摘要
本发明涉及进行生物反应的系统、装置和方法。本发明特别涉及亲脂性、水不混溶性、或者疏水性屏障在样品分离、纯化、修饰和分析过程中的用途。
文档编号B01L7/00GK102027367SQ200980115366
公开日2011年4月20日 申请日期2009年2月27日 优先权日2008年2月29日
发明者D·M·凯尔索, S·库纳尔, Z·帕尔皮亚 申请人:西北大学