一种赭曲霉毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种赭曲霉毒素的适配体亲和柱及其制备方法和用途。属食品安全检测领域。

背景技术：

赭曲霉毒素a(ochratoxina)简称ota，是曲霉属和青霉属的一些菌种的有毒代谢产物，属真菌毒素之一。自然界中产生赭曲霉毒素a的真菌种类繁多,但以纯绿青霉(penicilliumverrucosum)、赭曲霉(aspergillusochraceus)和碳黑曲霉(a.carbonarius)三种菌为主,其中赭曲霉是稻谷感染的常见菌。赭曲霉毒素能引起肾脏的严重病变、肝脏的急性功能障碍、脂肪变性、透明变性及局部性坏死，而且还有致畸性、致突变性、免疫抑制和致癌性。1993年国际癌症研究中心已将赭曲霉毒素a列为可能的人类致癌物。赭曲霉毒素广泛的存在于谷类、大豆、绿豆、花生、香料、干果、动物肾脏、血液、咖啡、牛奶、白酒、啤酒、葡萄酒、巧克力、奶制品和调味品中。赭曲霉毒素a的测定已经引起广泛的关注。

目前赭曲霉毒素的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法（hplc）、酶联免疫吸附法（elisa）等。

其中薄层层析法是最早使用也是最广泛使用的检测赭曲霉毒素的方法，其优点是适合于没有经过专门培训的人员操作,且成本低,无需价格昂贵的仪器,。但是薄层层析法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需检测周期较长，容易受到杂质的干扰。测定时用目测半定量,主观影响较大,灵敏度不高等,已远远不能满足现代检测要求。

酶联免疫吸附试验（elisa）检测方法检测特异、快速、灵敏度高、并且成本较低。成本低的特点,适用于基层机构大量样品的筛选和普查,可以大大节省时间和费用,因此越来越受到基层检验单位的欢迎。elisa方法的主要问题是容易造成假阳性。因此主要用于基层的筛查检测。

高效液相色谱法(hplc)具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点,是目前常用于食品中毒素检测的方法。但因其对样品中毒素纯度的要求较高,导致检测成本高、周期长,无法满足大批量样品快速筛选的需要,所以使用受到限制。今年来发展起来的免疫亲和柱-高效液相色谱（iac-hplc)）将免疫亲和纯化技术与高效液相色谱相结合。使hplc的使用更加广泛。免疫亲和柱作为一种新的净化技术,在真菌毒素的分析检测中应用越来越广泛。它是将特异性抗体结合到活化的固相载体上填充而成。当样品提取液通过柱子时,其中的抗原与抗体结合,其他杂质则通过水溶液洗掉,再用有机溶剂将抗原即毒素洗脱下来,从而使样品中的毒素得以净化。

免疫亲和柱具有操作简单，特异性高的优点。但是由于抗体获得困难，免疫亲和柱通常比较昂贵。并且由于抗体本身是一种蛋白质，其活性受到周围环境的影响。保存不当或者操作不当很容易造成抗体失活从而影响免疫亲和柱的效率。

适配体是一段核酸序列，通常为dna或者rna序列。单链的核酸序列可以形成二级结构，从而能与靶点特异性结合。通过多次的富集和筛选，能够筛选到与靶点有高亲和力的特异性适配体。herman等描述了核酸适配体的结合特异性，[science287,820-825].核酸适配体相对于抗体来说更稳定，不易受到环境的影响，并且核酸适配体可以化学合成，保证序列的准确性。[song.trendsanaly.chem2008.27(2)]。

核酸适配体被应用于小分子的检测，在专利cn103808701a中描述了一种基于赭曲霉毒素a的核酸适配体荧光嵌合染料检测赭曲霉毒素a的方法，利用赭曲霉毒素a的核酸适配体与互补序列形成一个检测元件，利用嵌合染料作为报告分子检测样本中的赭曲霉毒素a。在专利cn102735704a中，描绘了一种赭曲霉毒素a的电化学传感器，利用赭曲霉毒素a的适配体包被在裸金电极上，制备电化学传感器，用于检测赭曲霉毒素a。在专利cn105372213a中，描述了一种利用赭曲霉毒素a适配体检测方法，将赭曲霉毒素a的适配体用上转发光材料标记，利用上转发光材料的荧光能量转移特性进行检测。

基于核酸适配体的检测方法很多，但是净化和纯化方法较少。在专利cn104399283中，描述了一种黄曲霉毒素b1的适配体亲和柱。该专利利用环氧基活化的琼脂糖微球，将黄曲霉毒素b1的适配体偶联，制备成亲和柱。实现黄曲霉毒素的分离。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种赭曲霉毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途

在本发明中，我们利用selex系统，从适配体文库中筛选出来一条高特异性、高亲和力的的新的赭曲霉毒素a的dna适配体。适配体修饰后与n-羟基琥珀酰亚胺活化的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到赭曲霉毒素a的特异性载体。载体装柱后就形成了高亲和力的赭曲霉毒素a适配体亲和柱

该亲和柱操作简便，纯化赭曲霉毒素a毒素效率高。能耐受有机溶剂，并且可以重复使用。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的赭曲霉毒素a毒素。用于高效液相色谱检测和荧光仪检测。

具体操作如下：

本发明最大的优势就是利用了核酸适配体的特性，通过多轮的富集、洗涤、扩增等步骤，筛选出针对赭曲霉毒素a的特异性适配体。通过序列测定得到适配体的序列

核酸适配体相对于抗体来说，具有适应环境广泛，能够耐受高温、能耐受有机溶剂并且操作方便等优点。最主要的，适配体在制备过程中不需要经过动物体内的过程，而是通过化学合成来获得。因此，生产周期短，并且可以通过合成条件保证序列的准确性

以核酸适配体为基础制备的亲和柱具有特异性好，赭曲霉毒素a毒素结合量大，纯化效率高的特点。

赭曲霉毒素a适配体亲和柱及其制备方法说明如下

1.载体活化

选择n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）修饰的琼脂糖载体sepharose4b，进行活化

取1gn-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖，加入用50ml1mm的hcl，溶胀30min后，凝胶用100ml1mmhcl洗涤6次，再用100ml超纯水洗涤

2.将活化好的琼脂糖凝胶sepharose4b用偶联缓冲液（0.1m的nahco3，0.8mnacl，ph8.2）洗涤3次。加入20mol/l的氨基修饰的赭曲霉毒素a适配体，室温偶联8小时

3.将偶联好的赭曲霉毒素a适配体-琼脂糖载体用20mm，ph7.4的磷酸缓冲液pbs洗涤3次

4.封闭

将偶联好的赭曲霉毒素a适配体-琼脂糖载体中加入100mmol/l的tris.clph8.0，室温反应2小时

5.将封闭好的赭曲霉毒素a适配体-琼脂糖载体用20mm，ph7.4的磷酸缓冲液pbs洗涤3次

6.装柱

将赭曲霉毒素a—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的赭曲霉毒素a亲和柱。层析柱的结构如附图1所示。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.本发明充分的利用了核酸适配体的优点，通过多轮的筛选和富集。得到了高特异性高亲和力的赭曲霉毒素a核酸适配体。该适配体能够特异性的结合样本中的赭曲霉毒素a，降低了抗体亲和柱经常遇到的交叉反应性。亲和柱效率大幅度提高

核酸适配体不受操作环境和有机溶剂的影响，尤其适合真菌毒素类的脂溶性物质的纯化。相比较，由于免疫亲和柱中的抗体不耐有机溶剂，有机溶剂常常会造成抗体的失活而使亲和柱效率降低

此外，由于有机溶剂导致抗体失活，因此免疫亲和柱通常为一次性使用。而核酸适配体亲和柱可以耐受有机溶剂，可以重复使用多次，大幅度降低了使用成本

2.本发明使用的核酸适配体可以通过化学合成法获得，可以保证序列的正确性。大幅度降低了不同批次间的变异。而相对来说，不同批次的抗体来自于不同的小鼠或者兔子，导致抗体间质量变异较大，使亲和柱质量存在差别

3.使用本发明纯化赭曲霉毒素a操作简便，几步就可以得到纯度较高的赭曲霉毒素a。更方便操作者使用

4.使用本发明的产品得到的赭曲霉毒素a纯度很高，后续不用再做别的纯化处理就可以直接用于高效液相色谱检测或者荧光检测。节省了操作者的时间和费用。

附图说明

图1：赭曲霉毒素a适配体亲和柱结构组份示意图

a：进样口塞；b：活塞适配器；c：稳定箍；d：上筛板；e：柱体；f：载体填料；g：下筛板；h：出样口堵头

图2：赭曲霉毒素a适配体亲和柱外观结构图

a：进样口塞；b：活塞适配器；c：稳定箍；d：上筛板；e：柱体；f：载体填料；g：下筛板；h：出样口堵头

图3：玉米样品中加入赭曲霉毒素a标准品的液相色谱检测图

图4：饲料样品中加入赭曲霉毒素a标准品的液相色谱检测图。

具体实施方式

实施例1：利用氨基修饰的赭曲霉毒素a适配体制备亲和柱

本发明制备赭曲霉毒素a适配体亲和柱的一个优选的实施方案如下：

1.选择n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）修饰的琼脂糖载体sepharose4b，进行活化

2.取1gn-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖，加入用50ml1mm的hcl，溶胀30min后，凝胶用100ml1mmhcl洗涤6次，再用100ml超纯水洗涤

3.将活化好的琼脂糖凝胶sepharose4b用偶联缓冲液（0.1m的nahco3，0.8mnacl，ph8.2）洗涤3次。加入20mol/l的氨基修饰的赭曲霉毒素a适配体，室温偶联8小时

4.将偶联好的赭曲霉毒素a适配体-琼脂糖载体用20mm，ph7.4的磷酸缓冲液pbs洗涤3次

5.封闭

将偶联好的赭曲霉毒素a适配体-琼脂糖载体中加入100mmol/l的tris.clph8.0，室温反应2小时

6.将封闭好的赭曲霉毒素a适配体-琼脂糖载体用20mm，ph7.4的磷酸缓冲液pbs洗涤3次

7.将赭曲霉毒素a—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的赭曲霉毒素a亲和纯化柱

8.装柱

将交联后的赭曲霉毒素a-琼脂糖凝胶用10毫升20mmpbsph7.4重悬，然后装入空的亲和纯化柱柱体中

1)取空的柱体，加入下方筛板，加入1mlpbs，使其自然流干

2)加下方出样口堵头，在柱体中加入1ml上述处理后的赭曲霉毒素a适配体-琼脂糖凝胶载体，静止5分钟，使载体自然沉降

3)加入上方筛板，按压筛板，使其到达载体上方

4)加入活塞适配器，适配器有一个压紧作用，使上方筛板紧贴载体

5)从下方将稳定箍套在柱体上，使其紧贴进样口

6)拔掉出样口堵头，用注射器取5mlpbs，将注射器接在进样口上，缓慢的将pbs注入亲和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液体注入亲和柱

7)套上出样口堵头，套上进样口塞，将制备好的赭曲霉毒素a适配体亲和柱放入4℃保存。

实施例2：利用生物素修饰的赭曲霉毒素a适配体制备亲和柱

本发明制备赭曲霉毒素a适配体亲和柱的一个优选的实施方案如下：

1.取1ml链霉亲和素（sa）修饰的琼脂糖凝胶sepharose4b，用10ml超纯水洗涤3次

2.将（sa）修饰的琼脂糖凝胶sepharose4b用偶联缓冲液（0.02m的pbs，0.8mnacl，ph7.4）洗涤3次。加入20mol/l的生物素修饰的赭曲霉毒素a适配体，室温偶联4小时

3.将偶联好的赭曲霉毒素a适配体-琼脂糖载体用20mm，ph7.4的磷酸缓冲液pbs洗涤3次

4.装柱

将赭曲霉毒素a—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的赭曲霉毒素a亲和纯化柱

1)取空的柱体，加入下方筛板，加入1mlpbs，使其自然流干

2)加下方出样口堵头，在柱体中加入1ml上述处理后的赭曲霉毒素a适配体-琼脂糖凝胶载体，静止5分钟，使载体自然沉降

3)加入上方筛板，按压筛板，使其到达载体上方

4)加入活塞适配器，适配器一个压紧作用，使上方筛板紧贴载体

5)从下方将稳定箍套在柱体上，使其紧贴进样口

6)拔掉出样口堵头，用注射器取5mlpbs，将注射器接在进样口上，缓慢的将pbs注入亲和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液体注入亲和柱

7)套上出样口堵头，套上进样口塞，将制备好的赭曲霉毒素a适配体亲和柱放入4℃保存。

实施例3：利用赭曲霉毒素a适配体亲和柱纯化和检测玉米样品中的赭曲霉毒素a

本实施例利用正常的玉米样本定量加入赭曲霉毒素a的标准品，然后用赭曲霉毒素a适配体亲和柱进行纯化，纯化后用高效液相色谱检测。测定回收率

1.玉米样品处理

按照每克样品5ng的标准，在粉碎后的玉米样品中添加赭曲霉毒素a标准品；

1)提取

----20g±0.01g样品（固体样品需粉碎，并过2mm分样筛），5g氯化钠于三角瓶中，加入100ml的80%甲醇；

----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；

----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；

----取10ml滤液加入40ml去离子水稀释，混匀；

----用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；

----取25ml上样液过赭曲霉毒素a适配体亲和柱净化；

稀释倍数：1

2)净化

----将赭曲霉毒素a适配体亲和柱连接于10.0ml一次性注射器下。准确移取相应的样品提取液注入一次性注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接调节开关，使液体以1～2滴/秒的速度流出；

---待液体排干，用10ml去离子水淋洗免疫亲和柱两次，流速2~3滴/秒；

----待液体排干后，更换新针筒，上样2ml洗脱液（2%乙酸甲醇溶液），用试管接洗脱液，流速1滴/秒，收集洗脱液并定容至2ml；

----洗脱液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于hplc分析

2.洗脱产物用高效液相色谱hplc检测

高效液相色谱检测结果见表1，色谱图见附图3：

从检测结果可以看出，在1g的粉碎后玉米样品中加入5ng的赭曲霉毒素a，用本发明的适配体亲和柱可以回受到4.726ng。回收率为99.5%。

实施例4：利用赭曲霉毒素a适配体亲和柱纯化和检测饲料样品中的赭曲霉毒素a

按照每克样品50ng的标准，在猪配合饲料样品中添加赭曲霉毒素a标准品；

1.前处理

1)25g±0.01g样品（固体样品需粉碎，并过2mm分样筛）加入5g氯化钠与125ml提取液（70%甲醇-水溶液）混匀；

2)高速均质（≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液；

3)取10ml滤液加入20ml蒸馏水稀释（稀释后的液体ph值应保证在6~8之间，可用1m“naoh”或“hcl”进行调节），再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；

4)取15ml上样液过赭曲霉毒素a适配体亲和柱净化

2.净化

1)将赭曲霉毒素a适配体亲和柱连接于10.0ml一次性注射器下。按照前处理要求，准确移取相应体积的样品提取液注入一次性注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接调节开关，使液体以1～2滴/秒的速度流出；

2)待液体排干后，用蒸馏水或去离子水洗涤2次，每次10ml；

3)待液体排干后，上样1ml甲醇，流速1滴/秒，收集洗脱液并定容至1ml；

4)洗脱液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于hplc分析。；

5)检测结果见下表

色谱图见附图4。

实施例5：赭曲霉毒素a适配体亲和柱重复使用柱容量的变化

本实施例利用定量的赭曲霉毒素a的标准品，然后用赭曲霉毒素a适配体亲和柱进行纯化。亲和柱上的赭曲霉毒素a用有机溶剂洗脱后，用高效液相色谱检测其浓度。亲和柱重新平衡后重复上样和洗脱，测定洗脱的赭曲霉毒素a浓度。主要目的是测试赭曲霉毒素a适配体亲和柱的重复使用性

1.配制1ug/ml的赭曲霉毒素a标准品

2.取出赭曲霉毒素a适配体亲和柱，打开进样口塞，进样口与注射器针筒连接，注射器接入到气控操作架上

3.打开出样口塞，用10mmol/lpbsph7.4洗涤亲和柱3次，每次10毫升，调节气孔操作架气泵压力，使液体以3滴/秒的流速流出

4.取100ul上述配制的赭曲霉毒素a标准品，总量0.1ug，加入亲和柱柱中，调节流量至1-2滴/秒。直至样品全部流出亲和柱

5.用蒸馏水洗涤纯化柱3次，每次5毫升

6.加入1ml甲醇，收集洗脱产物

7.洗脱产物用高效液相色谱hplc检测

8.亲和柱用超纯水洗涤3次，每次10ml，然后用10mmol/lpbsph7.4洗涤亲和柱3次，每次10毫升

9.再次上样100ul赭曲霉毒素a标准品，总量1ug

10.按照上述操作洗涤及洗脱，洗脱产物用高效液相色谱检测其浓度

11.再重复步骤8.9.10三次。检测洗脱产物的浓度

12.计算总共5次的赭曲霉毒素a适配体亲和柱纯化的回收率

高效液相色谱检测结果见表4：

从上述结果可以看出，赭曲霉毒素a适配体亲和柱重复使用5次后，其结合能力没有明显的降低。

赭曲霉毒素a适配体序列

5’-gatttttgtccgatgctccctttacgccacccacacccgatc-3