本发明涉及食品检测技术领域，具体是一种食品中赭曲霉毒素A的检测试剂盒。
背景技术：
赭曲霉毒素是由赭曲霉（Aspergillusochraceors）、疣孢青霉（Pmiciliumvermculosutm）、纯绿青霉（Peniciliumviridicatum）和其他几种青霉属真菌产生的次级代谢产物。赭曲霉毒素为异香豆素类系列衍生物，包括A、B、C等7种结构类似的化合物。其中赭曲霉毒素A毒性最大，可损害动物的肝脏和肾脏，且具有致畸、致癌和致突变作用，被认为与人类巴尔干肾病发生有关。国际癌症研究机构（International Agency for Researchon Cancer，IARC）将赭曲霉毒素A定位为2B类致癌物。赭曲霉毒素A常污染小麦、玉米、谷类、咖啡以及葡萄等农作物。因此，建立灵敏、快速的检测方法是有效防治赭曲霉毒素A的重要技术前提。
目前，对赭曲霉毒素A检测方法主要是色谱技术，包括薄层色谱，气相色谱，高效液相色谱，液相色谱-质谱联用等。通常，色谱法用于食品中痕量真菌检测存在灵敏度不够的问题，液-质联用法虽然灵敏度高、快速，但设备昂贵、应具有专门操作技术人员才能进行检测，技术要求高，不宜大众化和普及。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种低成本、灵敏、准确、快速的食品中赭曲霉毒素A的检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种食品中赭曲霉毒素A的检测试剂盒，包括：多孔包被板、缓冲液、赭曲霉毒素A标准品、抗赭曲霉毒素A抗体、铕标记的兔抗鼠抗体、洗涤液、发光液；所述的发光液为含有2～2.4g/L聚乙二醇600、0.16～0.18wt.%吐温-20、0.9～1.2g/L 4-碘苯硼酸、0.18～0.2g/L对碘苯酚、22～24ml/L二甲基甲酰胺、12～14g/L聚乙烯吡咯烷酮、3～5g/L乙二胺四乙酸、100～120万单位/L硫酸庆大霉素、0.5～0.55g/L过氧化氢脲、pH值9.2～9.4的0.12～0.15mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
作为本发明进一步的方案：所述的发光液为含有2.2g/L聚乙二醇600、0.18wt.%吐温-20、1g/L 4-碘苯硼酸、0.185g/L对碘苯酚、23ml/L二甲基甲酰胺、13g/L聚乙烯吡咯烷酮、4g/L乙二胺四乙酸、110万单位/L硫酸庆大霉素、0.52g/L过氧化氢脲、pH值9.3的0.14mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
作为本发明进一步的方案：所述的多孔包被板上包被有赭曲霉毒素A-甲状腺蛋白，所述的赭曲霉毒素A-甲状腺蛋白的合成步骤为：准确称取赭曲霉毒素A 324mg溶解在2mL的N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌下逐滴加入γ-氨基丁酸溶液，搅拌反应3小时，调节反应液pH值在9.8～10.2；离心除掉沉淀物。将上述反应逐滴加入甲状腺蛋白溶液中，再加入N-羟基琥珀酰亚胺23mg，N,N-二环己基碳二亚胺45.4mg，4℃反应过夜，离心除去沉淀，取上清液用磷酸缓冲液透析3天，每天更换3次透析液，将所得产物低压冻干，于-20℃保存备用。
作为本发明进一步的方案：所述的甲状腺蛋白溶液是由320mg甲状腺蛋白溶解于5mL生理盐水而得。
作为本发明进一步的方案：所述的多孔包被板为96孔包被板。
作为本发明进一步的方案：所述的赭曲霉毒素A标准品的浓度为0ng/mL，0.01ng/mL，0.025ng/mL，0.05ng/mL，0.1ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，2.5ng/mL，5ng/mL，10ng/mL。
作为本发明进一步的方案：所述的缓冲液为含10mmol/L的NaCl、0.25wt.%甲状腺蛋白、20μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.05mL/L的吐温-80、0.08wt.%盐酸大庆霉素、pH值7.8的60mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
作为本发明进一步的方案：所述的洗涤液为含15.6mmol/L的NaCl、0.25mL/L的吐温-80、0.16wt.%盐酸大庆霉素、pH值7.8的60mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
利用所述的食品中赭曲霉毒素A的检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：取包被有赭曲霉毒素A-甲状腺蛋白的多孔包被板，加入50µL处理好的样品、赭曲霉毒素A标准品到各自的微孔中，加入50µL以缓冲液稀释的抗赭曲霉毒素A抗体， 37℃振荡45～50min，洗涤液洗2～3次，加以缓冲液稀释的100µL的铕标记的兔抗鼠抗体， 37℃振荡30～40min，洗涤液洗4～5次，加200µL发光液振荡5min后测量荧光强度，从标准曲线计算样品中的赭曲霉毒素A含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明不需要昂贵的仪器，样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，一种食品中赭曲霉毒素A的检测试剂盒，包括：多孔包被板、缓冲液、赭曲霉毒素A标准品、抗赭曲霉毒素A抗体、铕标记的兔抗鼠抗体、洗涤液、发光液；发光液为含有2～2.4g/L聚乙二醇600、0.16～0.18wt.%吐温-20、0.9～1.2g/L 4-碘苯硼酸、0.18～0.2g/L对碘苯酚、22～24ml/L二甲基甲酰胺、12～14g/L聚乙烯吡咯烷酮、3～5g/L乙二胺四乙酸、100～120万单位/L硫酸庆大霉素、0.5～0.55g/L过氧化氢脲、pH值9.2～9.4的0.12～0.15mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
1、免疫原与包被原制备
免疫原（赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白）的合成：准确称取赭曲霉毒素A 324mg溶解在2mL的N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌下逐滴加入γ-氨基丁酸溶液，搅拌反应3小时，调节反应液pH值在10左右。离心除掉沉淀物。将上述反应逐滴加入牛血清白蛋白溶液中（320mg牛血清白蛋白溶解于5mL生理盐水），再加入N-羟基琥珀酰亚胺23mg，N,N-二环己基碳二亚胺45.4mg，4℃反应过夜，离心除去沉淀，取上清液用磷酸缓冲液透析3天，每天更换3次透析液，将所得产物低压冻干，于-20℃保存备用。
包被原（赭曲霉毒素A-甲状腺蛋白）的合成：在上述反应中，将牛血清白蛋白换成甲状腺蛋白后，得到反应偶联物赭曲霉毒素A-甲状腺蛋白，该偶联物作为TR-FIA检测时作为包被原使用。
2、兔抗鼠抗体的制备
用Balb/C小鼠IgG免疫健康新西兰大白兔，制备高效价的兔抗鼠IgG高免血清，采用饱和硫酸铵沉淀法对血清进行粗提，经G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠抗体。
3、样品预处理方法
称取2.0±0.05g均质后的组织样品，加入8mL的3wt.%的三氯乙酸溶液，涡旋5min，室温4000r/min离心10min；取出2mL上清液至另一个离心管中，用1mol/L的NaOH调pH值至7.0～7.5之间。取调pH值后的液体用样本复溶液1：4稀释，混匀30s；取50mL用于检测分析。
4、制备试剂盒
4.1铕标记的兔抗鼠抗体的制备
取溶解于50mmol/L、pH值7.2～7.3的磷酸盐缓冲液的5g/L兔抗鼠抗体1～2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.14～0.15mmol/L的NaCl、40～45mmol/L的碳酸钠-碳酸氢钠、pH值8.0～8.4的缓冲液。A270收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量，用上述洗脱液稀释兔抗鼠抗体至2g/L。取500～1000μL稀释后的兔抗鼠抗体加入含0.25～0.3mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28℃磁力搅拌反应24小时。反应液经用pH值7.4～7.6的60～62mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱（1×40cm）层析，A270监测收集蛋白峰，稀释分装，得铕标记的兔抗鼠抗体，备用。
4.2 包被板固相抗原制备
将赭曲霉毒素A-甲状腺蛋白用50mmol/L的碳酸钠-碳酸氢钠、pH值9.2～9.4的缓冲液稀释至1mg/L的包被液，96孔包被板各孔加100μL，4℃放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，加150μL含2.5g/L甲状腺蛋白的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。
4.3 试剂的配制
（1）赭曲霉毒素A标准品溶液配制：将赭曲霉毒素A标准品，稀释成为0ng/mL，0.01ng/mL，0.025ng/mL，0.05ng/mL，0.1ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，2.5ng/mL，5ng/mL，10ng/mL系列浓度，稀释液为0.1mol/L、pH值7.5的磷酸盐缓冲液；
（2）缓冲液：含有10mmol/L的NaCl、0.25wt.%甲状腺蛋白、20μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.05mL/L的吐温-80、0.08wt.%盐酸大庆霉素、pH值7.8的60mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；
（3）洗涤液为：含有15.6mmol/L的NaCl、0.25mL/L的吐温-80、0.16wt.%盐酸大庆霉素、pH值7.8的60mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；
（4）发光液为：含有2～2.4g/L聚乙二醇600、0.16～0.18wt.%吐温-20、0.9～1.2g/L 4-碘苯硼酸、0.18～0.2g/L对碘苯酚、22～24ml/L二甲基甲酰胺、12～14g/L聚乙烯吡咯烷酮、3～5g/L乙二胺四乙酸、100～120万单位/L硫酸庆大霉素、0.5～0.55g/L过氧化氢脲、pH值9.2～9.4的0.12～0.15mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
4.4 试剂盒提供的试剂
基于上述制备的试剂，本发明用于检测赭曲霉毒素A的时间分辨荧光免疫分析试剂盒包括如下材料：
（1）96孔酶标板×1块；
（2）赭曲霉毒素A标准品1mg/mL/瓶；
（3）抗赭曲霉毒素A抗体冻干品，用时用0.5mL蒸馏水溶解；
（4）铕标记的兔抗鼠抗体冻干品，用时用0.5mL蒸馏水溶解；
（5）发光液：15mL；
（6）10×洗涤液：30mL；
（7）缓冲液：30mL。
4.5 测定之前注意事项：
A.使用之前将所有试剂回升至室温(18～30℃)；
B.使用之后立即将所有试剂放回2～8℃；
C.如果样品量大建议使用多通道移液器；
D.在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔；
E.取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2～8℃。
4.6 具体检测步骤如下：
取包被有赭曲霉毒素A-甲状腺蛋白的多孔包被板，加入50µL处理好的样品、赭曲霉毒素A标准品到各自的微孔中，加入50µL以缓冲液稀释的抗赭曲霉毒素A抗体， 37℃振荡45～50min，洗涤液洗2～3次，加以缓冲液稀释的100µL的铕标记的兔抗鼠抗体， 37℃振荡30～40min，洗涤液洗4～5次，加200µL发光液振荡5min后测量荧光强度，从标准曲线计算样品中的赭曲霉毒素A含量。
本发明不需要昂贵的仪器，样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。