一种谷物中赭曲霉毒素A的检测方法与流程

本发明涉及农产质量安全检测
技术领域：
，具体地说涉及一种谷物中赭曲霉毒素A的检测方法。
背景技术：
：赭曲霉毒素(ochratoxins)是由曲霉属和青霉属等产毒菌株产生的一组结构类似的有毒代谢物质。赭曲霉毒素包括7种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A(ochratoxinsA，OTA)毒性最强，分布最广。赭曲霉毒素A是一种可溶于极性有机溶剂和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水，赭曲霉毒素A的化学名称为7-(L-β-苯基丙氨基-羰基)-羧基-5-氯代-8-羟基-3,4-二氢化-3R-甲基异氧杂奈邻酮(香豆素)，分子式为C2OH18ClNO6。动物毒性试验表明，赭曲霉毒素A具有免疫抑制毒性、神经毒性、致畸性及致癌性。1993年，国际癌症研究中心已将赭曲霉毒素A列为可能的人类致癌物。因此世界各国均重视对赭曲霉毒素A的检测和控制，制定了相关的限量标准。我国在2011年最新颁布的国家食品安全标准《食品中真菌毒素限量》规定了谷物及其制品中赭曲霉毒素A的最高限量值为5μg/kg。目前，对于赭曲霉毒素A的分析方法主要包括液相色谱串联质谱法，高效液相色谱法和酶联免疫法。国内外对于谷物中赭曲霉毒素A检测的前处理方法主要是免疫亲和柱法，因其选择性高，特异性强，样品回收率较高，准确度高，但缺点是成本太高。为评价我国谷物中赭曲霉毒素A的污染情况，当前急需建立一种简单、快捷、灵敏、成本较低的谷物中赭曲霉毒素A的快速定量检测方法。技术实现要素：本发明的目的在于：提供一种谷物中赭曲霉毒素A的检测方法，该方法为：先对样品进行提取净化，净化液经高效液相色谱串联质谱技术(LC/MS/MS)检测，最后通过基质标准曲线定量测定样品中赭曲霉毒素A的含量。该方法适用于检测小麦和玉米中赭曲霉毒素A。具体的说，本发明的一种谷物赭曲霉毒素A的检测方法，包括如下步骤：一种谷物中赭曲霉毒素A的液相色谱串联质谱检测方法，具体步骤如下：(1)样品提纯将乙腈与水按体积比4:1混合配制成乙腈溶液，按体积质量比(mL/g)5:1加入谷物样品粉末中，置于摇床中180rpm振荡30min后，2500rpm离心5min收集上清液；将5mL乙腈溶液通过氨基固相萃取柱(500ng,6mL.安谱公司)，弃淋洗液；取5mL上清液过氨基固相萃取柱，弃过柱液；再取5mL乙腈溶液过柱淋洗两次，弃淋洗液；将乙腈与甲酸按体积比17:3配制成色谱乙腈-甲酸溶液，取10mL乙腈-甲酸溶液加入氨基固相萃取柱，洗脱富集在柱上的赭曲霉毒素A，收集洗脱液于干净的玻璃试管中，氮气吹干；取吹干后的残渣用甲醇溶解，过0.22μm的滤膜(SCAA-104，上海安谱科学仪器有限公司)，滤液即为样品提纯液；(2)取浓度依次为0.5、1、5、10、20μg/L的赭曲霉毒素A标准溶液，分别进行高效液相色谱串联质谱检测，获得赭曲霉毒素A标准曲线；(1)(3)对步骤(1)获得的样品提纯液进行高效液相色谱串联质谱检测，检测结果带入步骤(2)获得的标准曲线进行比对，以外标法测得样品中赭曲霉素A的浓度，在依据公式(1)计算样品中赭曲霉毒素A的含量；式(1)中：X——样品中赭曲霉素A含量，单位为微克每克，μg/g；C——待测液中赭曲霉素A的浓度，单位为微克每毫升，μg/mL；V——定容体积，单位为毫升，mL；M——样品称样量，单位为克，g。进一步，本发明所述谷物中赭曲霉毒素A的液相色谱串联质谱检测方法，所述高效液相色谱串联质谱检测具体是指：(1)色谱条件：a)色谱柱：WatersT-3色谱柱(4.6×150mm,5μm)；b)进样量：2μL；c)柱温：40℃；d)流速：0.4mL/min；e)流动相和洗脱时间：流动相A：含5mmol/L乙酸铵的水溶液；流动相B：甲醇；采用线性梯度洗脱：90％A，10％B初始，0-3min，A为90％-10％，B为10％-90％，3-5min，A为10％，B为90％；5-7min,，A为10％-90％，B为10％-90％；平衡3min，总共单次样品运行时间10min；(2)质谱条件：离子化模式为电喷雾电离正离子模式(ESI+)；多反应监测(MRM)；离子源温度500℃；驻留时间100ms；雾化气压50psi；辅助气压50psi；喷雾电压5500V；碰撞室射出电压6V；赭曲霉毒素A质谱条件参数如表1所示：表1赭曲霉毒素A质谱条件参数注*：定量离子。进一步，如本发明所述谷物中赭曲霉毒素A的液相色谱串联质谱检测方法中，所述谷物为小麦或玉米。进一步，如本发明所述谷物中赭曲霉毒素A的液相色谱串联质谱检测方法中，所述谷物样品粉末是指过0.5mm孔筛后的谷物样品粉末。本发明的一种谷物中赭曲霉素A的检测方法可应用于小麦和玉米等谷物中赭曲霉素A的提取、净化和检测。与其他检测方法相比具有简单、快捷、灵敏准确的特点，可适用于大批量样品的检测。同时本发明解决了传统的赭曲霉素A采用免疫亲和柱检测成本高的问题。本方法的建立使小麦和玉米等谷物中赭曲霉素A的含量得以准确测定，能为农产品质量安全风险评估提供准确的分析方法。附图说明图1为小麦、玉米空白样品离子色谱图。图2为浓度为2g/L的OTA标准品离子色谱图。图3为小麦空白基质标准曲线。图4为玉米空白基质标准曲线。图5为OTA样品色谱图。具体实施方式实施例中所用的高效液相色谱串联质谱为日本岛津20ADXR液相色谱系统串联美国AB3500质谱。实施例1建立标准曲线(1)按GB/T25220-2010的方法对从市场购买的小麦样品和玉米样品进行检测，取OTA未检出的小麦和玉米(如图1所示，其中图1A为小麦空白样品，图1B为玉米空白样品)作为空白样品；将乙腈与水按体积比4:1混合配制成乙腈溶液，按体积质量比(mL/g)5:1分别加入空白样品粉末(磨碎过0.5mm孔筛)中，摇床180rpm振荡30min后，2500rpm离心5min收集上清液；将5mL乙腈溶液通过氨基固相萃取柱(500ng,6mL.安谱公司)，弃淋洗液；取5mL上清液过氨基固相萃取柱，弃过柱液；再取5mL乙腈溶液过柱淋洗两次，弃淋洗液；将乙腈与甲酸按体积比17:3配制成色谱乙腈-甲酸溶液，取10mL乙腈-甲酸溶液加入氨基固相萃取柱，洗脱富集在柱上的赭曲霉毒素A，收集洗脱液于干净的玻璃试管中，氮气吹干；取吹干后的残渣用甲醇溶解，过0.22μm的滤膜(SCAA-104，上海安谱科学仪器有限公司)，滤液即为样品提纯液(空白基质)；(2)取2g/L赭曲霉素A标准母液(OTA标准品离子色谱图如图2所示)置于棕色小瓶中，用乙腈稀释成浓度为50μg/L的标准储备液；分别用步骤(1)中的空白小麦和玉米基质稀释上述标准储备液，分别配成0.5、1、5、10、20μg/L的赭曲霉毒素A标准溶液，再分别进行高效液相色谱串联质谱检测获得标准曲线，小麦和玉米的空白基质标准曲线分别如图3、4所示。具体高效液相色谱串联质谱检测方法为：进样量2μL，柱温40℃。高效液相色谱分离的条件为：色谱柱为WatersT-3色谱柱(4.6×150mm,5μm)，流动相：A为水(含5mmol/L乙酸铵)，B为甲醇，采用线性梯度洗脱：洗脱时间：90％A，10％B初始，0-3min，A为90％-10％，B为10％-90％，3-5min，A为10％，B为90％；5-7min,，A为10％-90％，B为10％-90％；平衡3min，总共单次样品运行时间10min。串联质谱检测条件为：电喷雾电离正离子模式(ESI+)；多反应监测(MRM)；离子源温度500℃；驻留时间100ms；雾化气压50psi；辅助气压50psi；喷雾电压5500V；碰撞室射出电压6V；赭曲霉毒素A质谱条件参数如表1所示：表1赭曲霉毒素A质谱条件参数注*：定量离子。赭曲霉毒素A线性方程、检出限和定量限如表2所示:表2赭曲霉毒素A线性方程、检出限和定量限采用基质加标法建立标准曲线，在相应的线性范围内，赭曲霉素A在不同的基质中均线性良好，相关系数(R)≥0.99。灵敏度：将标准品溶液用基质梯度稀释的方法测定方法的灵敏度，方法的定量为0.5μg/L，检出限为0.25μg/L。回收率：采用基质加标法对方法的回收率进行考察，高、中、低(1、2、5μg/kg)三个浓度3个平行的添加回收率范围为81.2-102.6％，相对标准偏差(RSD)为3.41-4.26％。精密度：赭曲霉素A在小麦和玉米基质中的日内精密度相对标准偏差(RSD)为1.71-3.53％，日间精密度相对标准偏差(RSD)为0.69-1.58％，重复性：赭曲霉素A在小麦和玉米基质中的重复性相对标准偏差(RSD)为3.72-4.56％。实施例2样品检测1、制备样品提纯液取市场采集的小麦和玉米样品，分别按下述操作过程进行分析检测：(1)取小麦和玉米样品，粉碎后过筛(样品经粉碎机粉碎至能完全通过0.5mm筛为止)，置于4℃冰箱内保存待用；(2)将样品取出恢复至室温后，取5g样品粉末置于150mL三角瓶中，加入25mL乙腈-水80:20(v/v)的溶液，摇床180r/min震荡30min后，2500rpm离心5min，取上清液；(3)将5mL乙腈-水80:20(v/v)通过氨基固相萃取柱，弃淋洗液；(4)取5mL上清液通过氨基固相萃取柱，弃过柱液，分别取5mL乙腈-水80:20(v/v)的溶液过柱淋洗，弃淋洗液；(5)将色谱乙腈和甲酸按体积比85:15(v/v)混合后，准确取10mL混合液加入氨基固相萃取柱进行洗脱，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，氮气吹干；(6)吹干后残渣用1mL甲醇溶液溶解，过0.22μm的滤膜后，过滤液待进样分析。(2)对本实施例中获得的样品(玉米样品1、玉米样品2、小麦样品1、小麦样品2)提纯液进行液相色谱串联质谱检测，OTA样品色谱图如图5所示，其中，图5A为玉米样品1检测结果，图5B为玉米样品2检测结果，图5C为小麦样品1检测结果，图5D为小麦样品2检测结果；再将检测结果带入实施例1获得的标准曲线进行比对，以外标法测得样品中赭曲霉素A的浓度，在依据公式(1)计算样品中赭曲霉毒素A的含量；式(1)中：X——样品中赭曲霉素A含量，单位为微克每克，μg/g；C——待测液中赭曲霉素A的浓度，单位为微克每毫升，μg/mL；V——定容体积，单位为毫升，mL；M——样品称样量，单位为克，g。本实施例中不同样品中赭曲霉毒素A的检测结果见表3:表3不同样品中赭曲霉毒素A的检测结果名称浓度(ug/kg)玉米1玉米2小麦1小麦2赭曲霉素A4.521.891.01-aa低于检出限同时，为了验证方法的精密度及准确性，采用国标GB/T25220-2010测定谷物中赭曲霉毒素A，通过本方法所得到的赭曲霉毒素A含量与国标方法得到的含量偏差≤5％，证明方法准确可靠。并且本方法使用的氨基固相萃取柱价格远低于国标方法的免疫亲和柱，极大的节省了成本。本发明的保护范围并不限于实施例中所作的描述，不偏离本发明方案中心的修改都属于本发明的保护范围。当前第1页1 2 3