引导分子药物缀合物的连续制造的制作方法

抗体药物缀合物(adc)包含附接至生物活性(例如细胞毒性)物质的抗体。作为治疗剂，adc组合了抗体的卓越的特异性(其能够区分健康组织和患病组织)与细胞毒性药物的细胞杀伤能力。换言之，抗体例如用于将细胞毒性物质直接转运至患病的细胞，例如癌细胞，并在细胞内将其释放。这样，使健康细胞在很大程度上免于传统化学疗法产生的毒性副作用。

详细而言，adc由三个不同的组分组成：抗体、活性物质(例如，药物，诸如细胞毒性的活性成分，也称为毒性基团)，和连接抗体与活性物质的接头。抗体识别并结合某些蛋白分子，例如肿瘤细胞表面的肿瘤标志物。这个结合过程触发如下的机制，其将adc转运到细胞内，在细胞内活性物质与抗体分离，并可以例如经由阻断重要的细胞功能而作用于细胞，从而导致程序性细胞死亡(凋亡)。可选地，抗体识别并结合所述蛋白分子，例如肿瘤细胞表面上的肿瘤标志物，并且活性物质作用于肿瘤细胞。

使用adc的疗法的成功的关键是，缀合物在通过体内时不丢失其缀合的活性物质，并且直到其在患病细胞之内后才将它释放。此外，抗体必须特异性地靶向患病细胞。因此，期望经由接头偶联生物活性物质的过程对抗体的影响尽可能小，并在规模放大和制造期间产生相当的adc。

因此，由于对adc的需求正在增长，所以容易规模放大，但尤其考虑上文提及的adc系统的细节的、更灵活的生产方法将是有利的。

因此，本发明的目的是提供更灵活的生产方法，其在各种处理条件下都是可靠、稳健且可重现的，并且易于规模放大并且不影响抗体。

这一目的经由提供用于连续、病原体减少地处理引导分子(例如肽或蛋白或核酸和接头的缀合物)的修饰单元(37)而实现，所述修饰单元包括如下组件：

-至少一个含有在缓冲溶液中的引导分子的储液器(1)和/或至少一个用于含有在缓冲溶液中的引导分子的产物流的入口，

-至少一个含有在溶液中的接头的储液器(2)，

-至少一个混合装置(3)，

-至少两个阀(7,8)，一个用于引导分子的计量加入，且一个用于接头分子的计量加入，

-至少一个用于包含引导分子-接头复合物的产物流的出口和/或用于容纳引导分子-接头复合物的储液器(5)，

-进一步包括至少一个停留时间装置，以确保限定的停留时间，即确保在混合后，引导分子和接头分子总是在连续处理中度过相似的时间量。

这个修饰单元实现接头与引导分子的连续附接，例如肽或蛋白或核酸的缀合物，同时保持引导分子的优异稳定性。这一发现是令人惊讶的，不希望受理论束缚，这是因为与分批处理相比，预期引导分子将与连续处理中存在的大表面积产生负面相互作用。所述大表面积是由相对小的管道和相对小的混合装置产生的，且预期随着表面积的增加，较大比例的引导分子也将与所述较大表面积相互作用，这将对引导分子的质量，特别是聚集状态，产生负面影响。

此外，这个单元非常容易规模放大到生产规模，即增加产物的总量，例如，adcg/每周的量。之所以是这样，是因为，为了实现更大的产物量，仅仅必须提供更多的起始材料，并且整个处理的持续时间将增加。但是，既没有必要建立更大的生产设备/设施，验证另一个生产设备/设施，也没有必要进行如对生物制品所需的广泛的可比性研究。

还应理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，且并不意在进行限制。如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一”("a","an")，和“该”("the")包括复数指代物，除非上下文另有明确指明。因此，例如，提及“一个装置”包括两个或更多个此类装置的组合。

如本文所用，术语“引导分子”是指能够发现特定靶标和/或与特定靶标相互作用的实体。

引导分子的实例是肽、蛋白和核酸，诸如dna和rna分子，包括rnai分子。

如本文所用，术语“肽”是指长度相对短(例如小于50个氨基酸)的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是线性或分支的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可被非氨基酸中断。这个术语还涵盖已被修饰的氨基酸聚合物；例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，诸如与标记组分缀合，所述标记组分诸如但不限于荧光标志物、颗粒、生物素、珠粒、蛋白、放射性标记、化学发光标签、生物发光标签等。

如本文所用，术语“蛋白”是指氨基酸的多肽。该术语涵盖可以是全长、野生型或其片段的蛋白。蛋白可以是人的，非人的，以及相应的天然存在的氨基酸的人工或化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。此外，还涵盖其中特定氨基酸被交换，例如以实现活性物质的“位点特异性缀合”的蛋白。

如本文所用，术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的类似物的核酸，其具有与参照核酸相似的结合特性，并且以类似于天然存在的核苷酸的方式被代谢。除非另外指明，否则具体的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。此外，还涵盖其中特定碱基对被交换，例如以实现活性物质的“位点特异性缀合”的核酸。

在优选的实施方案中，引导分子是抗体和/或抗原结合片段。

如本文所用，术语“抗体”是指结合分子，诸如免疫球蛋白或免疫球蛋白的免疫学活性部分，即，含有抗原结合位点的分子。

在一些实施方案中，抗体是糖基化的。

如本文所用，术语“抗体-药物-缀合物(adc)”是指包含至少一种抗体、至少一种药物和至少一种使抗体与药物连接的“接头”的复合物。如本文所用，术语“抗原结合抗体片段”或“抗原结合片段”是指仍包含抗体/免疫球蛋白的抗原结合结构域的抗体/免疫球蛋白的片段(例如igg的可变结构域)。抗体的“抗原结合结构域”通常包含抗体的一个或多个高变区。

如本文所用，术语“生物活性物质”、“活性物质”、“活性剂”、“药物”或“治疗剂”是指任何原子和/或分子、分子复合物或物质，其施用于生物体以用于诊断或治疗目的，包括疾病或感染的治疗、医学成像、监测、避孕、化妆品、营养品、药物和预防应用。

术语“药物”包括任何这样的原子和/或分子、分子复合物或物质，其经过化学修饰和/或可操作地附接至生物或生物相容性结构。术语“前药”是指药物，药物前体或修饰的药物，其直到在体内转化成其治疗活性或可利用的形式才是完全活性或可利用的。

如本文所用，术语“毒性基团”是指当施用于细胞时产生毒性作用的化学基团。

换言之，活性物质可以例如是原子，诸如放射性试剂(例如钍同位素)，或抗有丝分裂剂。

因此，本领域技术人员立即认识到，本文描述的用于抗体-药物-缀合物的方法和装置也适用于靶向的钍缀合物(ttc)。

如本文所用，术语“单元”或“单元操作”是指装置或装置的组合，其在引导分子诸如抗体和/或抗体药物缀合物的生产方法中进行一个处理步骤。换言之，为了提供最终的引导分子，即产物，所述产物将必须通过几个单元。

由于将接头附接至引导分子的步骤通常称为修饰，因此能够进行这种附接的装置称为修饰单元。

如本文所用，术语“连续的”是指以下事实：待处理的组分和/或产物流向单元(例如修饰单元)的输入，和经处理的组分和/或产物流从所述单元(例如修饰单元)的移出，不间断地进行。换言之，后续的单元操作可以在第一单元操作已完成对产物流的处理之前开始处理产物流。

如本文所用，术语“分批的”是指以下事实：通常单个生产周期或生产步骤以分批的方式不连续地操作，在开始下一生产步骤之前收集并汇集全部产物，或者在生产周期完成后取出全部产物。为了再次生产，则有必要开始单独的新产物周期/批次。

高度规范的药物生产需要在时间、技术和人员的方面的大量努力，以提供经清洗和灭菌的设施，从而确保无菌的产物。此外，为了在多用途系统中或在两个产物批次之间产物转换的情况下可靠地避免交叉污染，复杂的清洗验证是强制性的，这同样需要在时间和人员方面的巨大努力。因此，用于生产adc的连续处理是有利的。这种用于生产adc的连续处理还具有以下优点：与使用大体积的高效活性物质的批量操作相比，它能够经由具有小量反应体积的封闭系统更安全地处理高效活性物质(例如，毒性基团)。

如本文所用，术语“病原体减少”可与“微生物减少”和“病原体减少的”互换使用，并且是指病原体计数减少的状态，包括病毒计数减少，即可通过合适的减少病菌的方法达到的接近零的每面积或体积单位的病原体计数，其中该减少病菌的方法可以选自γ射线照射、β射线照射、高压灭菌、环氧乙烷(eto)处理、臭氧处理、“原位蒸汽”(sip)和/或原位热处理或使用消毒剂(如1mnaoh)处理或减少病菌的过滤。换言之，本文中术语“病原体减少”、“微生物减少”和“病菌减少”也指生物负荷受控的状态。

如本文所用，术语“产物流”是指通过本文所述的用于超滤和纯化的单元的包含引导分子的流体。换言之，在进入用于超滤和纯化的单元之前，产物流也可以称为进料，并且在离开用于超滤和纯化的单元后，产物流也可以称为保留物。

如本文所用，术语“储液器”是指储存容器，诸如缓冲袋(surgebag)，其包含处理中所需的组分，例如缓冲液、抗体、接头或活性物质。

如本文所用，术语“混合装置”是指用于使异质的物理系统更均质的设备或机器。为了实现充分混合，优选具有小空间的装置。

合适的混合装置的实例是t-部件、微叶片混合器和具有不同混合原理的静态混合器，例如狭缝或螺旋静态混合器。

如本文所用，术语“接头”是指与抗体和活性物质结合的分子。因此，术语“接头”描述了不可裂解和可裂解的接头以及螯合剂。

除上述优点外，令人惊讶地发现修饰单元促进产生稳定且一致的接头-抗体比率。这很重要，因为它促进产生稳定且一致的药物-抗体比率(dar)。只有每个抗体附接的生物活性物质的分子数稳定且一致，才确保相当的体内活性。

在一些实施方案中，本文所述的修饰单元包括超过两个阀。本领域技术人员知晓对于给定单元需要多少个阀。

如本文所用，术语“停留时间装置”是指确保限定的停留时间的装置，即，确保在混合后，引导分子和接头分子总是在连续处理中度过相似的时间量。这具有可以容易地确保所产生的引导分子-接头分子复合物的一致特性的效果。为了确定在给定停留时间装置中的停留时间分布，可以使用示踪剂实验。

但是，也可以经由选择合适的混合装置来实现所产生的引导分子-接头分子复合物的一致特性。

在一些实施方案中，停留时间装置选自：容器、管、直管、具有一个或多个凹陷的管、具有一个或多个孔口的管、具有一个或多个突起的管、圆管、非圆管(例如椭圆管)和/或盘管。在优选的实施方案中，产物流的每个部分在其已经通过混合装置之后通过停留时间装置。

在一些实施方案中，停留时间装置是塞流式反应器，即其中理想地流体在径向方向上而不在轴向方向上混合的装置。

如本文所用，术语“塞流式反应器”是指其中理想地流体在径向方向上而不在轴向方向上(向前或向后)混合的装置。当其在塞流式反应器中流动时，流体流的各部分的停留时间是其在反应器中位置的函数，即产物流在塞流式反应器中的停留时间很窄。换言之，理想地，流体流的任何部分与流体流的任何其他部分在塞流式反应器中度过相同的时间量，从而可靠地确保所产生的引导分子-接头分子复合物的一致特性。

在一些实施方案中，停留时间装置中的流动的特征在于雷诺数为0.1-10000，优选为5-1000，且最优选为8-300。雷诺数定义为：

其中

ρ是流体的密度(si单位：kg/m³)

u是流体相对于物体的速度(m/s)

l是特征线性尺寸(m)

μ是流体的动态粘度(pa·s或n·s/m²或kg/m·s)

ν是液体的运动粘度(m²/s)。

在优选的实施方案中，停留时间装置是盘绕流逆变器(cfi)或螺旋流逆变器(hfi)。

cfi作为用于连续低ph病毒灭活的工具，由klutz等人介绍(klutz,s等人，2015,journalofbiotechnology213,pp.120–130)。

螺旋流逆变器描述于欧洲专利申请中，其申请号为ep17208952。

可选地，可以使用连续搅拌釜式反应器代替cfi和/或hfi，或除cfi和/或hfi之外，还使用连续搅拌釜式反应器。

如果使用连续搅拌釜式反应器，则本文所述的修饰单元还包括流出物(outflow)。

在优选的实施方案中，修饰单元是一次性的和/或供单次使用的。这具有如下的优点：与依赖于不锈钢器材和复杂的清洗基础设施的传统设备相比，使用一次性器材可以容易得多地实现数量增加以提高产量/时间，例如因为用于不锈钢器材的清洗基础设施的数量也需要增加。

在一些实施方案中，本文所述的修饰单元还包括至少一个泵。

这个实施方案具有如下的优点：可以在不考虑重力或压力的情况下组装修饰单元。换言之，在没有泵的情况下，修饰单元必须设计为使得重力或压力导致产物流流经各个装置。特别地，经由采用泵，有助于使用cfi或hfi作为停留时间装置。

此外，优选修饰单元包括几个泵。这也将允许对至少两个阀的自动控制，且因此允许自动化处理。

在一些实施方案中，阀作为泵实现，即，本文的修饰单元包括至少两个泵，代替至少两个阀。

在进一步的实施方案中，本文所述的修饰单元包括至少一个废物出口。通常，在其中修饰单元产生所需的引导分子接头复合物的生产阶段之前，需要启动阶段。在这个启动阶段期间，可能已经产生了可被引导到废物出口的材料。因此，废物出口具有如下的作用，即例如引导分子接头复合物的质量属性的参数在狭窄范围内。

此外，废物出口通常提供丢弃部分生产流的可能性。如果诸如泵速等的处理参数不在给定的相关范围内，则这例如是期望的。在这种情况下，可以丢弃受范围外的参数影响的部分生产流。

在另一方面，本发明涉及用于连续、病原体减少地生产和/或处理引导分子药物缀合物(例如肽或蛋白或核酸与药物的缀合物)的模块化系统，其包括以下单元：

·至少一个如上所述的修饰单元，

·至少一个用于缀合的单元，其包括至少一个混合装置，至少一个停留时间装置和至少一个含有生物活性物质的储液器，

·至少一个用于浓缩和再缓冲的单元，其包括至少一个缓冲液储液器和至少一个超滤装置，

·至少一个用于浓缩和再缓冲的单元，其包括至少一个缓冲液储液器和至少一个渗滤装置，

·至少一个过滤器。

优选地，所述用于连续、病原体减少地生产和/或处理引导分子药物缀合物的模块化系统包括超过一个过滤器。

所述过滤器优选具有0.1μm-4μm的孔径，更优选0.5μm-2.5μm，且最优选0.2μm-2μm的孔径。

本领域技术人员知晓对于给定处理需要多少个用于浓缩和再缓冲的单元。此外，用于连续、病原体减少地生产和/或处理引导分子药物缀合物的模块化系统还可以包括以下单元：

·至少用于同时修饰和缀合的单元，其包括至少一个含有在缓冲溶液中的引导分子的储液器和/或至少一个用于含有在缓冲溶液中的引导分子的产物流的入口，至少一个含有接头溶液的储液器和至少一个含有生物活性物质的储液器，至少一个混合装置和至少一个停留时间装置，以确保限定的停留时间，即，确保在混合后，引导分子和接头分子总是在连续处理中度过相似的时间量，

·至少一个用于浓缩和再缓冲的单元，其包括至少一个缓冲液储液器和至少一个超滤装置，

·至少一个用于浓缩和再缓冲的单元，其包括至少一个缓冲液储液器和至少一个渗滤装置，

·至少一个过滤器。

应当注意，还可以提供至少一个含有生物活性物质和接头二者的储液器，来代替至少一个含有接头溶液的储液器和至少一个含有生物活性物质的储液器。在这个实施方案的优选实例中，将生物活性物质和接头偶联，随后将它们提供到所述至少一个含有生物活性物质和接头二者的储液器中。

优选地，所述用于连续、病原体减少地生产和/或处理引导分子药物缀合物的模块化系统包括超过一个过滤器。

所述过滤器优选具有0.1μm-4μm的孔径，更优选0.5μm-2.5μm，且最优选0.2μm-2μm的孔径。

如本文所用，术语“模块化系统”与术语“生产设备”可互换使用，并且是指两个或更多个单元，其被连接以制造产物，例如adc。

在优选的实施方案中，本文所述的模块化系统是封闭的模块化系统。

这种允许连续生产adc的模块化系统具有其代表封闭系统的巨大优点。因此，仅必须提供非常危险的活性生物物质，但此后不再处理。因此，尤其是职业安全性得到实质改善。

如本文所用，术语“封闭的”是指所述的模块化系统以流体流不暴露于室内环境的方式操作，从而使产物流的污染以及对潜在危险的活性生物物质的暴露最小化。可以从外部添加材料、物体、缓冲液等，但是其中，这种添加以避免流体流暴露于室内环境的方式进行。因此，可以使用无菌过滤器来提供对于环境中的污染物的有效屏障。封闭系统的实例包括配有一体化无菌连接装置的单次使用的无菌袋。此外，处理系统可以打开，但通过适合于或符合处理要求(无论是灭菌，无菌还是低生物负荷)的清洗、消毒和/或灭菌处理而“被封闭”。实例包括可以在使用之间进行cip和sip的处理容器。如果在特定的系统设置期间采取适当的措施，则也可以使得非灭菌系统(例如色谱法或一些过滤系统)在低生物负荷操作下封闭。如本文所用，术语“封闭的”是指“功能上封闭的”系统以及“封闭的”系统，并且如上所述，通常是指所述的模块化系统以流体流不暴露于室内环境的方式操作的事实。

在一些实施方案中，本文所述的模块化系统在无菌环境中操作。在这个实施方案中，模块化系统不必是封闭的以使产物流的污染最小化。

此外，如果合适，本文所述的模块化系统在无菌环境中的操作可以与模块化系统的封闭操作相组合。

在优选的实施方案中，模块化系统是一次性的和/或供单次使用的。

在一些实施方案中，过滤器保留沉淀物和/或用于减少生物负荷。在一些实施方案中，首先使用深度过滤器过滤沉淀物，且然后使用0.2μm过滤器用于减少生物负荷。

在一些实施方案中，本文所述的封闭的模块化系统包括至少两个0.2μm的过滤单元，从而允许过滤单元在封闭的模块化系统的各个点处的平行操作。这种平行操作是有利的，因为它允许更换阻塞的或损坏的过滤单元，同时产物流可以通过另一个过滤单元。换言之，这个实施方案有助于真正的连续处理。

维持无菌性是(半)连续生产抗体和adc的挑战。因此，优选地，在修饰单元以及在模块化系统中，所有组件都通过管(特别是一次性管)连接在一起。设备的其他组件也优选是一次性组件；特别地，使用选自以下的组件：一次性过滤元件、一次性阀管、一次性传感器(流量、ph、电导率、uv、压力)，一次性管、一次性膜、一次性连接器、一次性容器、一次性混合器和一次性采样系统。输送液体的工具，特别是泵，也优选是一次性泵，即，以一次性管作为唯一的接触表面的泵或蠕动泵。

在一些实施方案中，用于连续、病原体减少地生产和/或处理引导分子药物缀合物(例如肽或蛋白或核酸与药物的缀合物)的模块化系统是如wo2016/180798a1中所公开的生产设备，和/或使用如wo2016/180798a1中所述的用于处理控制的计算机实现的方法进行控制。

在另一方面，本发明涉及用于连续、病原体减少地生产和/或处理引导分子药物-缀合物(例如肽或蛋白或核酸与药物的缀合物)的方法，所述方法包括以下步骤：

·提供引导分子，

·提供接头，

·接头和引导分子的附接，

·引导分子-接头复合物与生物活性物质的缀合，

·任选地，产物流的至少一次连续超滤，

·产物流的至少一次连续渗滤，

·产物流的至少一次过滤。

优选地，所述方法以封闭的方式进行。

产物流的至少一次过滤通常在产物流的连续渗滤之后进行。如果对给定的处理有益，则可以在产物流的连续渗滤后的所述至少一次过滤之外，进行产物流的其他过滤，或者可以进行产物流的其他过滤，代替在产物流的连续渗滤后的所述至少一次过滤。

在一些实施方案中，如上所述，所述用于连续、病原体减少地生产和/或处理引导分子药物-缀合物(例如肽或蛋白或核酸与药物的缀合物)的方法使用如上所述的修饰单元进行。

可选地，用于连续、病原体减少地生产和/或处理引导分子药物-缀合物(例如肽或蛋白或核酸与药物的缀合物)的方法可包括以下步骤：

·提供引导分子，

·提供接头-生物活性物质底物，

·引导分子与接头-生物活性物质底物的缀合，

·产物流的至少一次连续超滤，

·产物流的至少一次连续渗滤，

·产物流的至少一次过滤，

其中所述方法以模块化方式进行。

产物流的至少一次过滤通常在产物流的连续渗滤之后进行。如果对给定的处理有益，则可以在所述产物流的连续渗滤后的那次之外，进行产物流的其他过滤，或者可以进行产物流的其他过滤，代替在所述产物流的连续渗滤后的那次。

可选地，用于连续、病原体减少地生产和/或处理引导分子药物-缀合物(例如肽或蛋白或核酸与药物的缀合物)的方法可包括以下步骤：

·提供引导分子，例如肽或蛋白或核酸，

·提供接头，

·提供生物活性物质，

·使所述引导分子、所述接头和所述生物活性物质结合，以形成引导分子-接头-活性物质缀合物，

·产物流的至少一次连续超滤，

·产物流的至少一次连续渗滤，

·产物流的至少一次过滤，

其中所述方法以模块化方式进行。

换言之，可以首先将接头与引导分子附接，或者首先将接头与生物活性物质附接，或者同时将所有三个组分结合在一起。

产物流的至少一次过滤通常在产物流的连续渗滤之后进行。如果对给定的处理有益，则可以在所述产物流的连续渗滤后的那次之外，进行产物流的其他过滤，或者可以进行产物流的其他过滤，代替在所述产物流的连续渗滤后的那次。

在进一步的方面，本文所述的用于连续、病原体减少地生产和/或处理引导分子-药物-缀合物的方法用于从异质细胞培养流体混合物连续、病原体减少地生产和/或处理抗体-药物-缀合物的方法中，其包括以下步骤：

·从产物流形式的含有抗体的异质细胞培养流体混合物制备无颗粒的流体，

·至少一次过滤，

·用于清洗抗体的至少一个色谱步骤，其包括分别经由至少两个色谱柱和/或膜吸附器的清洗，

·至少一次病毒清除，

·至少一次连续超滤，

·产物流的至少一次连续渗滤，

·使用上述方法处理在所述连续渗滤后得到的抗体，以得到抗体-药物-缀合物，

其中所述方法以连续和模块化的方式进行。

因此，上文所述的，所述用于从异质细胞培养流体混合物连续、病原体减少地生产和/或处理抗体-药物-缀合物的方法的第一步可以是连续发酵，其包括连续细胞保留以提供含有抗体的异质细胞培养流体混合物和/或提供含有抗体的异质细胞培养流体混合物，其例如是使用分批或分批补料方法制备的。

此外，可以在用于储存最终产物的储液器的下游添加用于配制的单元操作，例如添加稳定剂和调节最终药物的ph。

实施例

概述：

为了在模块化并且优选封闭的处理中，在连续的、病原体减少的条件下提供抗体-药物-缀合物，构建具有以下单元的生产设备和相伴的处理步骤：

除非另有说明，否则在处理中使用具有easyloadii泵头的masterflex蠕动泵。masterflex或cflex或sanipure用作管。接触产物的所有元件均用25kgy进行γ射线照射。在例外情况下，如果出于与材料技术相关的原因而不允许进行γ射线照射，则将组件在121℃下高压灭菌至少20分钟。在可能的情况下，将即用型一次性物品(“一次性用品”，“即用型”)用作γ射线照射的单元。通常，所有袋子都连接到单元。在每个单元之间，将γ射线照射的单次性使用的袋子作为均衡罐放置在单元n-1的出口流和单元n的入口流之间。通常，在那时，每个单元中有入口和出口流。在排出产物液体是有利的情况下，经由0.2µm疏水过滤器将容器与外部环境隔绝。此外，所述处理优选地由pcs7处理系统控制。

提供了包含抗体溶液(例如igg)的储存容器。此外，提供了包含接头溶液的储存袋。

将抗体溶液以及接头溶液从它们的储液器(也称为储存袋)泵出，并允许其混合并反应，从而修饰两种组分并产生抗体-接头底物。在下一步骤中进行缀合，其中，将包含生物活性物质的溶液(例如包含毒性基团的溶液)添加到包含抗体-接头复合物的流体流中，并且例如使用静态混合器将所有组分混合以产生抗体-接头-毒性基团缀合物。经由在两个特定波长下的uv-吸收来测量毒性基团负荷。任选地，使所得的包含抗体药物缀合物以及未结合的毒性基团的产物流通过深度过滤器，且然后进行超滤以浓缩抗体。然后，将产物流进行渗滤，例如将产物流经由毛细管超滤单元的至少一个毛细管超滤膜用洗涤流体洗涤，其中将产物流输送到毛细管中并且将洗涤流体在毛细管外部上方输送，且产物流和洗涤流体连续地进料到毛细管超滤单元中，并连续地从毛细管超滤单元中移出，且产物流和洗涤流体不循环到毛细管超滤单元中并且调节产物流的移出，以使没有不期望的净流量可以从毛细管内部流到毛细管外部，或反之亦然，并且使所有沿产物流方向离开至少一个毛细管超滤单元的流体流过至少一个保护纯化器。为了将产物流(=进料流)输送到毛细管中，并且将洗涤流体(=渗透液)在超滤单元的毛细管外部上输送，在每种情况下均使用一个泵。对于来自毛细管的产物流(=保留物)的受控移出，使用另外一个泵。通过使用这个泵(=保留物泵)，简化了保留物移出的控制。这是有利的，因为没有合格的流量传感器，其可靠地测量此连续处理中通常使用的低流速(≤100ml/min)。特别优选地，在此可以使用蠕动泵，其优点是一次性蠕动泵是商购可得的，从而无菌性是可得的，且一次性技术也是可得的。此外，使用泵用于洗涤流体(渗透液)的受控移出。

可选地，可以使用在超滤/渗滤系统中包括渗滤片的系统，代替上述连续渗滤。

最后，使用平行操作的两个0.2µm过滤器过滤产物流。过滤器和管组装件均经过γ射线照射。入口和出口管线通过无菌连接器连接到经γ射线照射的袋子，所述无菌连接器充当用于波动流速的均衡体积。为了排气，将过滤器与疏水性0.2µm空气过滤器偶联，从而在本发明的意义上封闭所述单元。空气过滤器是来自pallcorp.的emflonii或来自sartoriusstedim的midisart2000。排气阀经改进，使得其甚至在封闭时也是可渗透的，但相对于环境仍然是可靠密封的。

具体实施例

实施例1：连续修饰

将具有15.3mg/ml的初始浓度的抗体溶液，用100mm磷酸钾(kpi)-缓冲液(ph7.5)稀释至10.72g/l的终浓度。制备浓度为1.56g/l的接头溶液，在此为dma中的spdb接头(n-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)。

将这些溶液填充到储液器中，并以特定流速(对于ab溶液为284.3ml/h且对于接头-溶液为20ml/h)泵送，直到系统达到稳定状态。系统达到稳定状态(例如基本恒定的泵速)所需的这段时间称为启动阶段。在这个实施例中，启动阶段被定义为前五个停留时间，其中一个停留间隔等于产物流的给定部分流过修饰单元所需的时间量。在启动期间，所有产生的材料都被引导到废物出口。

在启动阶段之后，系统从启动模式切换到生产模式。因此，将ab-溶液和接头-溶液以特定流速(对于ab-溶液为284.3ml/h且对于接头-溶液为20ml/h)泵送至混合装置中，在此使用来自ehrfeld的静态cascade-micromixer，其具有以下设置[非对称cascade混合器，最大内径150µm，11个混合阶段]。通过混合装置后，产物流通过停留时间装置，在此使用masterflextygon管，其内径为3.1mm，具有6.3ml的总体积。此后，将产物流收集在储液器中，在此是具有bola-连接器的schott-flask。

为了收集样品材料，还将产物流引导至样品储液器。在实验期间，采集20ml的样品。

对于关闭处理，再次将流引导到废物出口，停止泵，并使用溶剂和水冲洗所有相互连接的部件，将其填充到先前分别含有抗体和接头溶液的储液器中，进行清洗。如果采用单次使用的器材，则将其丢弃。

为了证明在连续处理条件下的修饰反应是成功的，必须证实所产生的抗体-接头复合物具有与在分批处理中产生的抗体-接头复合物相同的特征。为此，在标准条件下将产生的抗体-接头复合物与毒性基团缀合，并测定其单体含量及其二聚体含量和所获得的药物与抗体的比率。

对于所述分析，用2ml磷酸盐缓冲液和0.209ml二甲基乙酰胺(dma)稀释2.25ml样品的等分试样。然后，加入40.9µl的20mm毒性基团在dma中的溶液。在18小时的反应时间后，通过pd10柱将缓冲液交换为his/gly(ph5.5)，而终止反应。进行尺寸排阻色谱，且显示96.4％的单体含量和2.8％的二聚体含量。将这个样品的等分试样稀释，并通过uv-测量分析，显示3.4的药物与抗体的比率(dar)。使用特异性hplc分析，确定ular(未缀合的接头与抗体的比率)低于0.03，在所述特异性hplc分析中，使用二硫化物裂解剂处理样品，去除蛋白，且hplc检测释放的巯基吡啶。

换言之，显示连续处理条件不影响最终缀合物的稳定性，因为否则单体含量会更低。此外，在连续条件下产生的抗体-接头复合物需要与分批处理中相同量的毒性基团/抗体-接头复合物，因为否则dar和ular值会更高或更低。

实施例2：连续缀合

使用缀合反应，作为adc生产的模式处理中在上述修饰后的第二反应步骤。装置的设置类似于上述用于修饰反应的设置。

使用100mmkpi-缓冲液(ph7.5)，将修饰抗体的溶液稀释至约6g/l的终浓度。制备美登木素生物碱dm4(14s,16s,32s,33s,2r,4s,10e,12e,14r)-86-氯-14-羟基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二氧代-7-氮杂-1(6,4)-亚噁嗪基-3(2,3)-亚环氧乙烷基-8(1,3)-亚苯并环十四碳-10,12-二烯-4-基n-(4-巯基-4-甲基戊酰)-n-甲基-l-丙氨酸酯)在dma中的3.3mm溶液。

将这些溶液填充到储液器中，并以特定流速(对于抗体-接头-溶液为169.6ml/h且对于dm4-溶液为10.0ml/h)泵送。在启动处理期间，所有产生的材料都被引导到废物出口。为了收集样品材料，将流引导至样品储液器。在实验期间，在2小时36分钟的反应时间后，采集20ml的样品。

对于关闭处理，将流引导到废物出口，停止泵，并将储液器更换成清洗溶液(用于清洗的水，1molnaoh以猝灭dm4)，使用水和naoh-溶液冲洗整个设置，进行清洗。可选地，在单次使用的情况下，可以丢弃所述设置。

反应后，浓缩溶液，并通过超滤/渗滤(uf/df)将缓冲液交换为his/gly(ph5.5)。所得混合物的sec(尺寸排阻色谱)显示96.7％的单体含量和3.03％的二聚体含量。将这个样品的等分试样稀释并通过uv测量分析，显示3.3的药物与抗体的比率。uf/df后，这个反应的产率为87％。

因此，总体而言，这些结果证实，使用如本文所述的缀合单元在连续处理中产生的抗体-接头复合物与分批处理中产生的那些相当。

附图

图1：本文所述的用于连续、病原体减少地处理引导分子和接头的修饰单元的实例的概况，其包括以下组件：含有在缓冲溶液中的引导分子的储液器(1)，含有在溶液中的接头的储液器(2)，混合装置(3)，停留时间装置(4)，用于引导分子的计量加入的泵(7)，用于接头分子的计量加入的泵(8)，用于容纳引导分子-接头复合物的储液器(5)，废物出口(6)和三通阀(9)，其用于引导产物流从停留时间装置(4)排出到废物出口(6)或用于容纳引导分子-接头复合物的储液器(5)。在操作期间，经由两个泵(7)和(8)，将缓冲溶液中的引导分子和接头溶液以受控方式添加到混合装置(3)。混合之后，产物流在这个实例中流过停留时间装置(4)。此后，在储液器(5)中收集产物流。

图2描绘了本文所述的用于连续、病原体减少地处理引导分子和接头的修饰单元的实例的示意图。在这个实例中，修饰单元与下游单元流体连通。因此，不需要用于容纳引导分子接头复合物的储液器，因为产物流连续地流向下一单元操作。在这个实例中，修饰单元包括以下组件：含有在缓冲溶液中的引导分子的储液器(1)，含有在溶液中的接头的储液器(2)，混合装置(3)，停留时间装置(4)，用于引导分子的计量加入的泵(7)，用于接头分子的计量加入的泵(8)，废物出口(6)以及与下一单元操作的连接(10)。在操作期间，经由两个泵(7)和(8)，将缓冲溶液中的引导分子和接头溶液以受控方式添加到混合装置(3)。混合之后，产物流在这个实例中流过塞流式反应器(4)。此后，产物流经由连接(10)连续地流向后续单元操作，例如图3中描绘的一个单元操作。

应注意的是，如果这是有益的，则可以在与下一单元操作的连接(10)中包括中间储液器/储存容器(未描绘)。

此外，应注意，如上所述，可以从连续产生和纯化所述抗体的上游处理提供抗体，代替在储液器(1)中提供抗体。

此外，在这个实例中，采用两个任选的质量流量控制器(26)。

图3描绘了进行缀合的示例性单元操作的示意图。在这个实例中，所述用于缀合的单元操作包括与先前单元操作的连接(10)和与后续单元操作的连接(11)，含有缓冲溶液的储液器(12)，含有毒性基团的储液器(13)，混合装置(14)，在此为静态混合器，停留时间装置(15)，两个均质回路(16)和(17)，几个用于控制不同流体流的计量加入的泵(18a-f)，两个废物出口(19a和19b)，和含有用于后续单元操作的缓冲溶液的储液器(20)。

在操作期间，在先前单元操作(即本文所述的用于修饰的单元)中产生的包含抗体-接头复合物的产物流，经由连接(10)进入用于缀合的单元操作，并经由均质回路(16)添加来自储液器(12)的缓冲液，随后从含有毒性基团的储液器(13)向含有抗体-接头复合物的产物流计量加入毒性基团溶液。然后，将包含抗体-接头复合物和毒性基团的产物流混合，并且在装置(14)中混合之后，产物流在这个实例中流过塞流式反应器(15)，并且任选地经由uv-测量分析。然后，经由均质回路(17)，从储液器(20)添加缓冲液到产物流，以调节ph和浓度，并且抗体-接头-毒性基团缀合物连续地流向后续单元操作，例如图4中描绘的一个单元操作。

图4描绘了用于连续超滤的示例性单元的示意图，包括与先前单元操作的连接(11)和与后续单元操作的连接(21)，超滤装置(22)，深度过滤器(23)，废物出口(24)，另一个过滤器(25)，检测装置(26)，缓冲袋(27)和几个用于控制流体流动的泵(28a-d)。

在操作期间，包含抗体-接头-毒性基团缀合物的产物流在这个实例中经由连接(11)进入这个单元操作，流过过滤器(25)，超滤装置(22)，检测装置(26)，缓冲袋(27)和深度过滤器(23)，且然后通过连接(21)到图5中描绘的后续单元操作。

图5：描绘了用于连续透析的示例性单元的示意图，包括与先前单元操作的连接(21)，含有缓冲溶液的储液器(29)，透析模块(30)，检测装置(31)，废物出口(32)，过滤器(33)，用于储存最终产物(即，经超滤和透析的抗体-接头-毒性基团缀合物)的储液器(34)，以及用于控制流体流的泵(35-b)。

在操作期间，包含抗体-接头-毒性基团缀合物的产物流在这个实例中经由连接(21)进入这个单元操作，并流过透析模块(30)，在此由来自储液器(29)的缓冲液交换先前的抗体-接头-毒性基团缀合物的缓冲液。将先前的缓冲液丢弃至废物出口(32)。包含抗体-接头-毒性基团缀合物的产物流经由检测装置(31)和过滤器(33)从超滤模块流向用于储存最终产物的储液器(34)。

如上所述，可以在上游添加用于产生抗体的连续细胞培养、连续细胞分离以及抗体的连续纯化的单元操作，以使得能够从细胞发酵开始连续产生抗体接头缀合物。

此外，可以在用于储存最终产物的储液器的下游，添加用于配制的单元操作，例如添加稳定剂和调节最终药物的ph。

图6：本文所述的用于连续、病原体减少地处理引导分子接头复合物和生物活性物质的缀合单元(38)的实例的概况，其包括以下组件：含有在缓冲溶液中的引导分子接头复合物的储液器(39)，含有在溶液中的生物活性物质(在此为毒性基团)的储液器(40)，混合装置(3)，停留时间装置(4)，用于引导分子接头复合物的计量加入的泵(7)，用于毒性基团的计量加入的泵(8)，用于容纳引导分子接头毒性基团缀合物的储液器(5)，废物出口(6)和三通阀(9)，其用于引导产物流从停留时间装置(4)排出到废物出口(6)或用于容纳引导分子接头毒性基团缀合物的储液器(5)中。在操作期间，经由两个泵(7)和(8)，将缓冲溶液中的引导分子接头复合物和毒性基团溶液以受控方式添加到混合装置(3)。混合之后，产物流在这个实例中流过塞流式反应器(4)。此后，在储液器(5)中收集产物流。

参考标记的列表：

1.含有引导分子的储液器(1)，

2.含有在溶液中的接头的储液器(2)，

3.混合装置(3)，

4.停留时间装置(4)，

5.储液器(5)，

6.废物出口(6)，

7.泵(7)，

8.泵(8)，

9.三通阀(9)，

10.单元之间的连接(10)，

11.单元之间的连接(11)，

12.含有缓冲溶液的储液器(12)，

13.含有毒性基团的储液器(13)，

14.混合装置(14)，

15.停留时间装置(15)，

16.均质回路(16)，

17.均质回路(17)，

18.泵(18a-f)

19.废物出口(19a和19b)，

20.含有缓冲溶液的储液器(20)，

21.单元之间的连接(21)，

22.超滤装置(22)，

23.深度过滤器(23)，

24.废物出口(24)，

25.过滤器(25)，

26.检测装置(26)，

27.缓冲袋(27)，

28.泵(28a-d)，

29.含有缓冲溶液的储液器(29)，

30.透析模块(30)，

31.检测装置(31)，

32.废物出口(32)，

33.过滤器(33)，

34.用于储存最终产物的储液器(34)，

35.泵(35a和35b)，

36.质量流量控制器(36)，

37.修饰单元(37)，

38.缀合单元(38)，

39.含有修饰抗体的储液器(39)，

40.含有毒性基团的储液器(40)。