一种跨膜蛋白脂质体硅胶复合物及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉一种跨膜蛋白脂质体硅胶复合物及其制备方法与应用。

背景技术：

跨膜蛋白结构复杂，具有一个或多个疏水性的跨膜区，其纯化重组以及保存都离不开去污剂的存在。但是在去污剂存在的环境下，蛋白的结构和功能均遭到一定的破坏，药物与跨膜蛋白的相互作用也与体内实际情况差别较大。针对体外模拟跨膜蛋白天然构建这一难题，相关学者发展了一系列新的模型和分析技术，其中最具有代表性的就是蛋白脂质体重构技术，其原理是使用各种脂质体重组形成模拟细胞膜环境的人工膜，然后将跨膜蛋白镶嵌于其上，体外模拟跨膜蛋白天然构建和环境，来表征其与药物的相互作用。然而，蛋白脂质体不具备刚性结构，不能作为色谱固定相，因此无法适用于快速便捷的液质联用这类高效的药物分析方法。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种跨膜蛋白脂质体硅胶复合物。

本发明的第二个目的是提供一种所述跨膜蛋白脂质体硅胶复合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种所述跨膜蛋白脂质体硅胶复合物作为色谱固定相的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面提供了一种跨膜蛋白脂质体硅胶复合物，是由质量比为1:(300～500):(700～900)的跨膜蛋白、脂质体、硅胶制成，质量比优选的比值为1:400:800。

所述跨膜蛋白是镶嵌于脂质体双分子层中，两端暴露于细胞膜内外表面的蛋白质，具体选用的是细菌视紫红质蛋白、卷曲蛋白受体4(fzd4)。

所述脂质体为具有脂质双层结构的人工膜，是由摩尔比为(70～90):(10～30):(1～10)的二油酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰甘油、7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺制成，摩尔比优选为80:20:5。

本发明的第二个方面提供了一种所述跨膜蛋白脂质体硅胶复合物的制备方法，包括以下步骤：

将摩尔比为(70～90):(10～30):(1～10)的二油酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰甘油、7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺混合，加入溶剂充分震摇使其溶解，除去溶剂，加入pbs充分震荡重溶，孵育后超声成囊泡状，微孔滤膜过滤，获得所述脂质体；

将活化后的硅胶与脂质体混合1～60min，在冰浴条件下搅拌1～60min，温度为0～5℃的条件下静置保存过夜，然后在温度为0～5℃的条件下离心分离，沉淀用pbs重悬，重复该步骤2次，获得脂质体-硅胶复合物；

采用cy3荧光标记试剂盒对细菌视紫红质蛋白进行标记，得到cy3荧光标记的细菌视紫红质蛋白，蛋白终浓度为1～10mg/ml，将细菌视紫红质蛋白与脂质体-硅胶复合物孵育，获得细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物；

以上步骤中保持细菌视紫红质蛋白、脂质体、硅胶的质量比为1:(300～500):(700～900)；

或，

将摩尔比为(70～90):(10～30):(1～10)的二油酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰甘油、7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺混合，加入溶剂充分震摇使其溶解，除去溶剂，加入pbs以及fzd4蛋白充分震荡重溶、孵育，超声成囊泡状，微孔滤膜过滤，获得fzd4-脂质体复合物；

将活化后的硅胶与fzd4-脂质体复合物混合1～60min，在冰浴条件下搅拌1～60min，温度为0～5℃的条件下静置保存过夜，然后在温度为0～5℃的条件下离心分离，沉淀用pbs重悬，重复该步骤2次，获得fzd4-脂质体-硅胶复合物；

以上步骤中保持fzd4、脂质体、硅胶的质量比为1:(300～500):(700～900)。

所述硅胶的活化步骤是：将硅胶在温度为110～130℃的条件下活化0.1～12h。

所述蛋白终浓度为5mg/ml。

所述溶剂为三氯甲烷。

本发明的第三个方面提供了一种所述跨膜蛋白脂质体硅胶复合物作为色谱固定相的应用。

本发明的第四个方面提供了一种所述跨膜蛋白脂质体硅胶复合物作为色谱固定相在复杂体系样品中靶向活性成分筛选中的应用。

所述复杂体系样品为生物样品、环境样品、天然产物提取液或体液，具体是葛根提取液、黄芩提取液。

所述靶向活性成分是指样品中分子量小于1000、与生物色谱固定相存在相互作用的非挥发性小分子物质。

本发明的第五个方面提供了一种所述跨膜蛋白脂质体硅胶复合物作为色谱固定相在全二维跨膜蛋白-脂质体生物色谱系统中的应用。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明构建了一种新型的跨膜蛋白-脂质体-硅胶复合物生物色谱固定相，并对制备方法学进行了考察，解决了蛋白脂质体键和色谱固定相的技术难题。

本发明构建了全二维跨膜蛋白-脂质体生物色谱系统，进行复杂体系作用于跨膜蛋白的小分子的筛选，解决新型生物色谱应用于复杂药物分析的技术难题。

本发明解决了跨膜蛋白难以实现快速、专属、准确的结合药物筛选的难题，拓展了蛋白脂质体重构技术与细胞膜色谱技术的应用范围，为该方法的进一步研究奠定基础。

本发明成功将蛋白、脂质体、硅胶三者结合到一起，制备了一种可以作为色谱固定相的新型复合物，通过高效液相色谱串联质谱进行验证也证明其有效性和寿命符合要求，本发明还进一步进行了对该色谱的应用研究，为之后该方法的进一步推广和优化奠定了基础。

附图说明

图1是不同超声时间下脂质体的粒径分布图。

图2中，a是脂质体的粒径在10天中的变化趋势示意图，b是脂质体的pdi在10天中的变化趋势示意图，c是脂质体的电位值在10天中的变化趋势示意图。

图3是扫描电镜能谱一体机分别对纯硅胶(a)和脂质体-硅胶复合物(b)的观测结果示意图。

图4是共聚焦显微镜分别对以第一种顺序(a)、第二种顺序(b)、第三种顺序(c)合成的细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物的观测结果示意图；左图中即小圆圈部分为脂质体上nbd发出的荧光，中间图中小圆圈部分为细菌视紫红质蛋白上cy3发出的荧光，右图为无荧光下拍摄的照片。

图5中，a是9-顺式视黄醛在细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物色谱柱上在正离子模式下的hplc-tof-ms离子流图，b是9-顺式视黄醛在未结合蛋白的脂质体-硅胶复合物色谱柱上在正离子模式下的hplc-tof-ms离子流图，c是地塞米松在蛋白-脂质体-硅胶色谱柱上在正离子模式下的hplc-tof-ms离子流图，d是地塞米松在未结合蛋白的脂质体-硅胶复合物色谱柱上在正离子模式下的hplc-tof-ms离子流图。

图6是色谱柱寿命考察结果示意图。

图7是葛根提取液分别在(a)全二维fzd4色谱系统及(b)无蛋白的对照色谱系统上的保留成分的二维等高图。

图8是黄芩提取液分别在(a)全二维fzd4色谱系统及(b)无蛋白的对照色谱系统上的保留成分的二维等高图。

图9是化合物对mcf7细胞增殖的影响，从左至右从上至下依次分别为棕榈油酸、千层纸素a、汉黄芩素、棕榈酸甲酯、葛根素和3'-羟基葛根素(*p＜0.05和**p＜0.01代表与对照组之间差异有统计学意义，n＝3)。

图10是(a)通过流式细胞仪检测棕榈油酸、千层纸素a、汉黄芩素、棕榈酸甲酯、葛根素和3'-羟基葛根素对mcf7细胞凋亡的影响，(b)mcf7细胞凋亡率的统计结果(**p＜0.05代表与对照组之间存在显著差异，n＝3)。

图11是蛋白免疫印迹实验检测潜在活性成分作用mcf7细胞48h后fzd4蛋白的表达示意图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明实施例所用试剂除另有注明，均可以从销售公司获得。

实施例1

细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物色谱固定相的制备

1.材料和方法

1.1试剂和材料

dopc(二油酰基磷脂酰胆碱)、dopg(二油酰基磷脂酰甘油)、nbd-dope(二油酰磷脂酰甘油、7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑基修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺)购自美国avanti公司(avanti，usa)。细菌视紫红质蛋白购自美国sigma-aldrich公司(sigma-aldrich，usa)。质谱纯乙酸铵、质谱纯乙腈、质谱纯甲酸购自德国merk公司(merk，germany)。cy3荧光标记试剂盒购自中国武汉伊莱瑞特生物科技有限公司(武汉，中国)。硅胶(5μm，)购于青岛美高化工有限公司(青岛，中国)。9-顺式视黄醛、地塞米松购自中国大连美仑公司(大连，中国)。

1.2仪器

jy92-iin细胞超声破碎仪购自中国宁波新芝生物科技股份有限公司(宁波，中国)。台式扫描电镜能谱一体机购自荷兰phenom公司(phenom，thenetherlands)。shzd-iii循环水式真空泵购自中国上海东玺制冷仪器设备有限公司(上海，中国)。tcssp5共聚焦显微镜购自德国leica公司(leica，germany)。mastersizer2000激光粒度分析仪购自英国malvern公司(malvern，uk)。heraeusmultifugex1r台式离心机购自美国thermo公司(thermo，usa)。色谱柱芯(10mm×2.1mmi.d.)购自中国大连日普利科技仪器有限公司(大连，中国)。agilent1200液相色谱系统、agilent6220飞行时间质谱仪购自美国agilent公司(agilent，usa)。

1.3脂质体的制备与检测

将摩尔比为80：20：5的dopc16mg、dopg4mg、nbd-dope1mg脂质体置于圆底烧瓶中，加入10μl三氯甲烷，充分震摇使其溶解。在温度为60℃的水浴环境下使用旋转蒸发仪将三氯甲烷蒸干。加入pbs10ml，充分震荡重溶。使用细胞超声破碎仪将脂质体超声成囊泡状，功率为400w，每工作5s，便间隔5s，超声的工作时间则分别考查2、5、10、15、20、25min这6种时间的破碎效果。超声完成后，使用0.22μm孔径pvdf(聚偏二氟乙烯)微孔滤膜进行过滤。

使用激光粒度分析仪对经过不同时间制备完成的脂质体进行检测，以选取适宜的超声时间。然后再测定该条件下脂质体的zeta电位值及pdi是否同样符合要求，重复三次，总计连续测定十天以确定其稳定性。

1.4脂质体-硅胶复合物的制备与检测

称取硅胶40mg将其放入烘箱中，在温度为120℃的条件下活化1h，然后加入具支试管中，在真空涡旋的条件下加入上述得到的脂质体20mg(步骤1.3中，加入pbs10ml，充分震荡重溶后获得的脂质体)，混合5min。在冰浴条件下搅拌50min，温度为4℃的条件下静置保存过夜。第二日，在温度为4℃的条件下，3000g(此处为离心机加速度)离心10min，弃去上清，沉淀用5mlpbs重悬，重复该步骤2次，获得脂质体-硅胶复合物，使用扫描电镜能谱一体机对制备的脂质体-硅胶复合物进行检测。

1.5细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物的制备与检测

采用商品化的cy3荧光标记试剂盒对细菌视紫红质蛋白进行标记，得到cy3荧光标记的细菌视紫红质蛋白，蛋白终浓度为5mg/ml。而后采用三种不同的结合顺序进行蛋白与脂质体的结合并考察效果。第一种顺序a：将细菌视紫红质蛋白溶液10μl(含蛋白50μg)与尚未超声成囊泡状的脂质体(即步骤1.3中pbs溶解后的脂质体)在冰浴中震摇孵育1h结合孵育，然后再将其超声成囊泡状，最后以真空涡旋法再与硅胶结合。第二种顺序b：将细菌视紫红质蛋白溶液10μl(含蛋白50μg)与已经成为囊泡状的脂质体(即步骤1.3中功率为400w、超声时间为10min后，成囊泡状的脂质体)在冰浴中震摇孵育1h结合孵育，再以真空涡旋法再与硅胶结合。第三种顺序c：将细菌视紫红质蛋白溶液10μl(含蛋白50μg)与上述制备好的脂质体-硅胶复合物(步骤1.4制备获得)在冰浴中震摇孵育1h结合孵育，获得细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物；通过三种不同的添加蛋白的顺序，最终得到了三种不同效果的细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物。使用共聚焦显微镜对结合效果进行检测。取三种复合物混悬液各5μl，滴于载玻片上，使用盖玻片小心覆盖，置于镜下进行观测比较，波长使用554nm检测cy3的荧光，使用465nm检测nbd的荧光。

1.6色谱柱有效性检测

细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物混悬液制备完成后，使用湿法装柱，以梯度升速的方式将其填装进色谱柱中。而后使用agilent1200液相色谱系统联用agilent6220飞行时间质谱仪进行检测。

分别制备一根细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物色谱柱以及一根未结合蛋白的脂质体-硅胶复合物色谱柱，进行色谱柱的有效性考察，使用的阳性药为细菌视紫红质蛋白的配体9-顺式视黄醛，使用阴性药为特异性靶点位于细胞质中、不与跨膜蛋白结合的地塞米松，两者浓度均为10mm，分别考察两种药物在两根色谱柱上的保留行为。

1.7色谱柱寿命检测

制备一根细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物色谱柱，在高效液相色谱串联飞行时间质谱仪上，使用阳性药9-顺式视黄醛进行色谱柱寿命考察，连续进样7天，每天进样3次，考察药物保留时间的变化。

2结果与讨论

2.1脂质体的检测结果

步骤1.3中脂质体制备完毕后，使用激光粒度分析仪对其参数进行检测。其结果如图1所示，图1是不同超声时间下脂质体的粒径分布图，从图中可以看出，从超声10min开始，脂质体的粒径已经逐渐趋向于稳定，继续破碎也不会有较大的变化，因此，将脂质体制备时的超声时间确定为10min，确定脂质体破碎所需的时间后，对该条件下制备的脂质体用激光粒度分析仪进行进一步检测，结果显示其粒径在200nm以下，zeta电位为负值，pdi<0.3，说明制备的脂质体符合实验的要求。之后总计十天对脂质体的这三个参数进行检测，结果如图2所示，图2中，a是脂质体的粒径在10天中的变化趋势示意图，b是脂质体的pdi在10天中的变化趋势示意图，c是脂质体的电位值在10天中的变化趋势示意图。从图中可以看出粒径、zeta电位、pdi的值在10天中虽然有一些变化，但仍保持粒径在200nm以下，zeta电位为负值，pdi<0.3，尚在可以使用的范围内，其稳定性符合要求。

2.2扫描电镜能谱一体机的检测结果

步骤1.4中脂质体-硅胶复合物制备完成后，使用扫描电镜能谱一体机对其进行验证，并比较纯硅胶和脂质体-硅胶复合物的区别，其微观形态如图3所示，图3是扫描电镜能谱一体机分别对纯硅胶(a)和脂质体-硅胶复合物(b)的观测结果示意图；从图中可以看出，在20000倍放大条件下，硅胶表面相对较为光滑，而脂质体-硅胶复合物表面能看到有明显包裹及附着的物质，说明脂质体确实包裹于硅胶表面。硅胶及脂质体-硅胶复合物的表面能谱结果如表1所示，从表中可以看出，硅胶上只有硅和氧两种元素，且硅和氧的比例近似为1:2。而脂质体-硅胶复合物上有硅、氧、碳三种元素，且硅与氧的比值较纯硅胶有所下降，一方面是因为主要元素为氧和碳的脂质体包裹上了硅胶，使得氧元素的百分比含量有所上升，另一方面是因为包裹的脂质体使得内层硅胶的检测造成了阻碍，使得硅元素的百分比含量下降，这说明脂质体确实包裹于硅胶表面。

表1纯硅胶和脂质体-硅胶复合物的能谱结果

2.3共聚焦显微镜观测结果

使用共聚焦显微镜考察步骤1.5中三种蛋白结合顺序的效果，结果如图4所示，图4是共聚焦显微镜分别对以第一种顺序(a)、第二种顺序(b)、第三种顺序(c)合成的细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物的观测结果示意图；a、b、c图中第一个图小圆圈部分为脂质体上nbd发出的荧光，a、b、c图中第二个图小圆圈部分为细菌视紫红质蛋白上cy3发出的荧光，a、b、c图中第三个图为无荧光下拍摄的照片。从图中可以看出，绿色荧光在三批图中都十分明显，证明脂质体确实包裹在硅胶上。而红色荧光部分在a中比b、c中都更为明显，说明以第一种顺序，将细菌视紫红质蛋白与尚未超声成囊泡状的脂质体(即步骤1.3中pbs溶解后的脂质体)在冰浴中震摇孵育1h结合孵育，然后以真空涡旋法再与硅胶结合；这种顺序结合蛋白相较其他两种顺序是效果最优的。

2.4色谱柱有效性实验结果

分别制备细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物色谱柱与未结合蛋白的脂质体-硅胶复合物色谱柱，在液质联用系统上进行有效性考察，使用的阳性药为9-顺式视黄醛，阴性药为地塞米松，结果如图5所示，图5中，a是9-顺式视黄醛在细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物色谱柱上在正离子模式下的hplc-tof-ms离子流图，b是9-顺式视黄醛在未结合蛋白的脂质体-硅胶复合物色谱柱上在正离子模式下的hplc-tof-ms离子流图，c是地塞米松在蛋白-脂质体-硅胶色谱柱上在正离子模式下的hplc-tof-ms离子流图，d是地塞米松在未结合蛋白的脂质体-硅胶复合物色谱柱上在正离子模式下的hplc-tof-ms离子流图。从图5中a与b可以看出，9-顺式视黄醛在细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物色谱柱上呈现明显的阳性保留，其保留时间为29.3min，而在未结合蛋白的脂质体-硅胶复合物色谱柱上，9-顺式视黄醛呈现阴性保留，保留时间为3.2min。而从图5中c与d中可以看出，地塞米松在两种色谱柱上均呈现阴性保留，保留时间分别为0.6min和0.5min。由此可证明制备的细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物色谱柱确实有效。

2.5色谱柱寿命实验结果

制备一根细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物色谱柱进行色谱柱寿命考察，使用的药物为阳性药9-顺式视黄醛，每天进样3次，连续进行7天实验，保留时间的结果如图6所示，图6是色谱柱寿命考察结果示意图，从图中可以看出，9-顺式视黄醛的保留时间自第1天起开始逐渐下降，但其下降程度尚在容许范围内，其保留行为仍然是典型的阳性保留，由此可证明制备的细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物色谱柱的寿命最低可达7天，足够用来进行实验。

3.结论

本发明参考蛋白脂质体重构技术以及细胞膜色谱技术，首次合成了一种新型的细菌视紫红质蛋白-脂质体-硅胶复合物，对其各项物理参数进行了考察，并将其填装进色谱柱，使用高效液相色谱串联飞行时间质谱对其有效性和寿命进行考察。上述一系列实验证明，该方法成功将蛋白、脂质体、硅胶三者结合到一起，制备了一种可以作为色谱固定相的新型复合物，通过高效液相色谱串联质谱进行验证也证明其有效性和寿命符合要求，为之后该方法的进一步推广和应用奠定了基础。

实施例2

全二维fzd4-脂质体-c18柱/tof-ms色谱系统的制备与应用

1.材料和方法

1.1试剂和材料

dopc、dopg、nbd-dope购自美国avanti公司(avanti，usa)。质谱纯乙酸铵、质谱纯乙腈、质谱纯甲酸购自德国merk公司(merk，germany)。卷曲蛋白受体4(fzd4)及其抗体购自美国abcam公司(abcam，usa)。葛根中药材、黄芩中药材购自中国上海雷允上药业有限公司(上海，中国)。dmem高糖培养基、pbs磷酸盐缓冲液、0.25％胰蛋白酶、胎牛血清(fbs)、二甲基亚砜(dmso)购自美国hyclone公司(hyclone，usa)。中药标准品购自上海一飞生物有限公司(上海，中国)。cck-8试剂盒、annexinv-fitc细胞凋亡试剂盒购自日本dojindo公司(dojindo，japan)。westernblot相关试剂购自上海碧云天生物技术有限公司(上海，中国)。

1.2仪器

jy92-iin细胞超声破碎仪购自中国宁波新芝生物科技股份有限公司(宁波，中国)。shzd-iii循环水式真空泵购自中国上海东玺制冷仪器设备有限公司(上海，中国)。heraeusmultifugex1r台式离心机购自美国thermo公司(thermo，usa)。agilent1200液相色谱系统、agilent6220飞行时间质谱仪购自美国agilent公司(agilent，usa)。dyy-6c蛋白电泳仪系统购自北京市六一仪器厂(北京，中国)。odyssey红外激光成像系统购自美国li-cor公司(li-cor，usa)。synergy4多波长酶标仪购自美国biotek公司(biotek，usa)facscan流式细胞仪购自美国beckondickson公司(beckondickson，usa)。

1.3葛根、黄芩中药材提取液的制备

取适量葛根中药材原料，使用高速粉碎机将其打碎成粉末状，过筛。称取100g葛根药材粉末，加入75％乙醇1000ml，温度为90℃的水浴条件下，加热回流提取2次，每次2h，浓缩至1g药材粉末/ml，得到葛根中药材的浓缩提取液。

取适量黄芩中药材原料，使用高速粉碎机将其打碎成粉末状，过筛。称取100g黄芩药材粉末，加入75％乙醇1000ml，温度为90℃的水浴条件下，加热回流提取2次，每次2h，浓缩至1g药材粉末/ml，得到黄芩中药材的浓缩提取液。

1.4fzd4-脂质体-硅胶复合物色谱柱制备

将摩尔比为80：20：5的dopc16mg、dopg4mg、nbd-dope1mg脂质体置于圆底烧瓶中，加入10μl三氯甲烷，充分震摇使其溶解。使用旋转蒸发仪在60℃水浴环境下将三氯甲烷蒸干，使脂质体混合物成膜。加入10mmpbs10ml以及fzd4蛋白50μg，充分震荡，使其重新溶解，并在冰浴中震摇孵育1h，使用细胞超声破碎仪将脂质体超声成囊泡状，功率为400w，每工作5s，便间隔5s，总计工作10min。使用0.22μm孔径pvdf微孔滤膜进行过滤，即得到fzd4-脂质体复合物。

称取事先在烘箱中120℃活化1h的硅胶40mg，加入具支试管中。在真空涡旋的条件下，使用注射器将fzd4-脂质体混悬液10ml注射进具支试管，剧烈涡旋混合5min。而后在冰浴条件下将脂质体搅拌50min，于4℃冰箱中静置保存过夜。第二日，在4℃条件下，3000g离心10min，小心弃去上清液，沉淀用5mlpbs重悬，重复该步骤2次，获得fzd4-脂质体-硅胶复合物。

使用湿法装柱法将制备好的fzd4-脂质体-硅胶复合物填装进色谱柱芯中，初始流速为0.2ml/min，然后每两分钟提升0.2ml/min直到流速为1.0ml/min。使用1.0ml/min流速填装2min后，将流速降低到0.2ml/min，继续填装30min，以使柱压稳定。色谱柱制备完成后浸泡于pbs并保存于4℃。

1.5全二维色谱筛选

本发明以agilent1200液相色谱系统为基础，建立了全二维fzd4-c18柱/tof-ms色谱系统进行实验。使用fzd4-脂质体-硅胶色谱柱作为第一维色谱柱，由一个单元泵负责流动相的输送。使用cappcellpak-c18色谱组作为第二维色谱柱，由一个多元泵负责流动相的输送。使用mxp9960二位十通阀桥联单元泵与多元泵，实现二者的同步，十通阀上连有两个500μl的定量环，用于储存和切换运行过程中产生的待分析样品，利用软件rheodynetitanmxcontrolsoftware(美国rheodyne公司)对十通阀进行控制，设置为每隔2.5min对流路进行自动切换。

第一维色谱的流动相为10mm的乙酸铵溶液，通过一个单元泵以0.2ml/min的流速泵入系统，柱温保持在37℃。第二维色谱的流动相通过多元泵泵入，流动相为a：0.1％的甲酸水溶液以及b：乙腈，洗脱梯度为：0-8min，流动相b由10％上升至60％；8-10min，流动相b维持在60％；10-10.01min，流动相b由60％降至10％；10.01-13min，流动相b维持在10％。第二维色谱的流速为0.8ml/min，柱温保持在25℃，柱后进行三通分流，使样品最终以0.4ml/min的流速进入飞行时间质谱系统。

精确量取200μl葛根、黄芩中药提取液于进样瓶中，按照上述分离分析条件进行实验，得到二者在正离子模式条件下在两种全二维色谱系统上的总离子流图。而后数据导入进matlab2010a软件(美国mathworks公司)中，通过自编命令绘制质谱鉴定结果中各成分分别在全二维fzd4色谱与空白对照色谱的二维等高线图谱。

1.6细胞系

为了进行进一步的药效验证，本发明选取人乳腺癌细胞mcf7进行药效实验，人乳腺癌细胞mcf7在含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基中培养，置于5％co2，37℃孵箱中。

1.7细胞增殖与细胞凋亡检测

使用细胞增殖检测试剂盒cck-8开展细胞增殖实验，实验使用棕榈油酸作为阳性对照。在人乳腺癌细胞mcf7贴壁培养24h后，加入1.5625-200μm的葛根素、3'-羟基葛根素、千层纸素a、汉黄芩素与棕榈酸甲酯，并孵育48h。然后，每孔加入10μlcck-8溶液，在37℃条件下孵育1.5h，并使用microplateabsorbancereader(bio-radinstruments，usa)在450nm处读取吸光度。

使用annexinv-fitc凋亡检测试剂盒及流式细胞仪测定细胞的凋亡。在六孔板上每孔接种5×10⁵数量的细胞，分别加入50μm的棕榈油酸、葛根素、3'-羟基葛根素、千层纸素a、汉黄芩素与棕榈酸甲酯孵育48h。然后收集细胞，pbs洗两次。然后加入annexinv/fitc试剂。室温黑暗条件下孵育10分钟后，清洗细胞和重悬；然后加入终浓度为1mg/l的碘化丙啶。染色完毕的细胞用facs流式细胞仪进行分析测定。

1.8蛋白免疫印迹实验实验

使用蛋白免疫印迹实验(westernblot)来探索葛根素、3'-羟基葛根素、千层纸素a、汉黄芩素与棕榈酸甲酯与fzd4蛋白的相互作用。

将细胞(人乳腺癌细胞mcf7)洗净后，使用细胞裂解液提取，后进行bca定量，取适量蛋白，加入上样缓冲液煮沸后上样。电泳胶和电转液按照试剂盒说明书进行配置。转膜后，使用5％牛奶室温下封闭2h，一抗室温下孵育2h，洗涤后，二抗室温下1h，使用仪器扫描观测。

2.结果与讨论

2.1全二维色谱实验结果

全二维fzd4-c18柱/tof-ms色谱系统搭建完成后，选取中药葛根、黄芩的提取液进行分析，得到的全二维分析数据由masshunter离线处理软件(美国agilent公司)进行处理，通过tof-ms提供的精确质荷比和丰富的同位素片段信息，再根据之前已经构建的中药化学成分数据库的比对，对葛根、黄芩中的保留成分进行了鉴定并将结果转存为csv格式，即每个样品数据所对应的数据点阵，然后将其导入matlab2010a软件(美国mathworks公司)绘制各成分的二维等高线图谱。

葛根提取液的保留行为如图7所示，图7是葛根提取液分别在(a)全二维fzd4色谱系统及(b)无蛋白的对照色谱系统上的保留成分的二维等高图。排除在对照色谱系统上呈阳性保留的假阳性成分，与fzd4可能存在相互作用的成分是丁基异丁基邻苯二甲酸酯、葛根素、大豆苷元-8-c-芹菜糖基(1→6)-葡萄糖苷、葛根素木糖苷、3'-羟基葛根素。

黄芩提取液的保留行为如图8所示，图8是黄芩提取液分别在(a)全二维fzd4色谱系统及(b)无蛋白的对照色谱系统上的保留成分的二维等高图。排除在对照色谱系统上呈阳性保留的假阳性成分后，与fzd4可能存在相互作用的成分是黄芩新素、千层纸素a、汉黄芩素、棕榈酸甲酯、黄芩素-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷、5,7,2',3'-四羟基黄酮、5,7,2',6'-四羟基黄酮。

2.2细胞增殖实验结果

为了验证从全二维fzd4色谱系统中筛选得到的潜在的活性成分的药效，本发明购买其中具有代表性的相关成分的标准品进行实验。最终选取葛根中的葛根素和3'-羟基葛根素，黄芩中的千层纸素a、汉黄芩素与棕榈酸甲酯，并使用可与fzd4蛋白结合的棕榈油酸作为阳性药。采用cck-8试剂盒分别检测了1.5625-200μm浓度的葛根素、3'-羟基葛根素、千层纸素a、汉黄芩素与棕榈酸甲酯在细胞给药48h后对mcf7细胞增殖的抑制作用，实验结果如图9所示，图9是化合物对mcf7细胞增殖的影响，从左至右从上至下依次分别为棕榈油酸、千层纸素a、汉黄芩素、棕榈酸甲酯、葛根素和3'-羟基葛根素(*p＜0.05和**p＜0.01代表与对照组之间差异有统计学意义，n＝3)。从数据中可以看出，千层纸素a、汉黄芩素、葛根素对mcf7细胞有杀伤作用，棕榈酸甲酯、3'-羟基葛根素的ic50值大于200μm，没有明显的增殖抑制现象。

2.3细胞凋亡实验结果

为了进一步验证全二维fzd4色谱系统筛选得到的潜在活性成分的药效，进行了细胞凋亡实验，在对6孔板中的细胞给药48h后，收集细胞使用流式细胞仪进行凋亡和死亡检测，结果如图10所示。图10是(a)通过流式细胞仪检测葛根素、3'-羟基葛根素、千层纸素a、汉黄芩素与棕榈酸甲酯对mcf7细胞凋亡的影响，(b)mcf7细胞凋亡率的统计结果(**p＜0.05代表与对照组之间存在显著差异，n＝3)。从数据中可以看出，千层纸素a、汉黄芩素、葛根素对mcf7细胞的杀伤是通过诱导细胞凋亡途径发挥作用的，而棕榈酸甲酯与3'-羟基葛根素则无法诱导细胞凋亡，与之前细胞增殖抑制实验的结果相符。

2.4蛋白免疫印迹实验结果

为了验证全二维fzd4色谱系统筛选得到的潜在活性成分对mcf7细胞中fzd4表达量的影响，进行了蛋白免疫印迹实验，结果如图11所示，图11是蛋白免疫印迹实验检测潜在活性成分作用mcf7细胞48h后fzd4蛋白的表达示意图。从图中可以看出，汉黄芩素、葛根素能明显下调mcf7细胞中fzd4蛋白的表达，而千层纸素a、棕榈酸甲酯与3'-羟基葛根素对mcf7细胞中fzd4蛋白的表达无明显的影响，其条带与对照组相似。

3.结论

本发明在新型跨膜蛋白-脂质体-硅胶复合物生物色谱系统的基础上，使用fzd4蛋白，进行了应用研究，筛选中药葛根、黄芩中与fzd4可能存在相互作用的抗癌活性成分，并对筛选结果进行了验证。实验结果证明本发明发展了一种高效便捷的方法进行作用于跨膜蛋白的小分子的筛选，拓展了蛋白脂质体重构技术与细胞膜色谱技术的应用范围，为该方法的进一步研究奠定基础。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。