iagen USA, CA)提取作为参考。对于在提取的完全手动操作下测试所发明的器件和过程并用于比较，使 用MOE过滤器柱，而不是盒中包括的Qiagen Mini柱(QM柱）。另外，在MOE过滤器柱的使用期 间，提取和冲洗过程用连接到MOE柱上的鲁尔锁帽体并用手操作的塑料一次性鲁尔锁注射 器完成，然而在Qiagen Mini柱的使用期间，液体通过移液转移并且如盒的用户手册中指 示，提取-冲洗过程用连接到电真空累的真空歧管QIAvac 24 Plus(Qiagen USA, CA)辅助。 [006引解冻的BCS(每个2ml)的四等份分被添加到含有裂解缓冲剂A化和蛋白酶K并在30 分钟内在60°C下培育的50ml的离屯、管(分别标示为QM和M0E)。根据指示手册中的指导，合适 量的带有异丙醇的结合缓冲剂ACB被添加到每个管。裂解物混合物的总体积是约8ml。
[0066] 为了比较，使用两种不同的提取柱来恢复，含有60bp短双链DNA的化1的叮B-DNA" 溶液（1.5 X IO6份(copies)AU)被渗入QM和MOE管中的一个并且分别标示为QM-TB和MOE-TB。叮B-DNA"溶液用来自基因组结核杆菌染色h37Rv的IS6110基因片段的PCR扩增子制备。 dsDNA被渗入BCS中作为外来的DNA控制（在主体的外部）。因此，4个管被分别标示为QM、QM+ 了8、]?06和顺化18。
[0067] QM管中的ACB裂解物混合物被转移到扩展管，从而将QM柱连接到真空歧管。使用含 有ACWl和ACW2冲洗缓冲剂的异丙醇的提取和冲洗过程通过移液和抽真空完成。
[0068] MOE管中的ACB裂解物混合物被吸入用长针附接的20ml鲁尔锁注射器。然后，针被 移除并且注射器被牢固地梓紧到50ml离屯、管(400)上的帽体101的鲁尔锁连接器上。注射器 中的裂解物混合物由手压力推动穿过MOE过滤器柱中的结合基质。冲洗缓冲剂ACWl和ACW2 也使用较小的注射器转移到MOE过滤器柱上并穿过MOE过滤器柱传送。本发明中使用的注射 器的体积应该足够大，使得除了注射器中占有的液体相之外，应该储存足够的空气相，W尽 可能清除出过滤器基质和柱中残留的液体残留物。
[0069] 两个柱中所吸收的cNA片段通过高速离屯、（15,000g)在60pl的缓冲剂AVE中洗脱。 洗脱被立即使用，或者保持冷冻。
[0070] 根据制造商的协议，含有提取的无细胞mRNA的洗脱液的一部分用M-MLV反转录酶 (cat.M170, Promega, WI)和随机引物反转录到cDNAocfDNA和cf-mRNA的定量由定量实时 PCR用SIBO TM-SYBR qPCR混合物盒（购自 Occam Biolabs,DE)确定。诸如SYBR ? Premix DimerElraser ? (Perfect Real Time，Takara-Clontech，CA)、Power SYBR? Green PCR Master Mix化ife Technologies,CA)和iQ? SY服? Green Supermix 2x Real-Time PCR MiX(BiO-Rad，CA)的其它可购买的SY服qPCR混合物盒还可用于该目的。用于qPCR检验的引 物对列在表1中。目标在于结核杆菌基因IS6110的外源序列和B. B.化urus线粒体基因Nd2 的内源序列的那些引物被具体设计为扩增短DNA序列。在RT-qPCR检验中，目标在于共用的 持家基因B2M(e-2微球蛋白）的不同序列的正向引物和反向引物被设计为与跨过大尺寸内 含子的不同的外显子互补；由此，只有从mRNA反转录的短cDNA(而不是被污染的基因组DNA) 被扩增并检测。
[00川表1、在检测小牛血清中的cNA中使用的引物
[0072] 表2、用于CfDNA和CfRNA的定量PCR的结果总结
*渗入的外源DNA ND:不可检测的。
[0073] 结果示出，当使用相同的缓冲剂，即QIAamp循环NA盒的A化、ACB、ACW1、ACW2和AVE 时，根据本发明的实施例使用手动注射器操作的过程的MOE过滤器柱和使用真空累处理的 Qiagen Mini柱具有可比较的CfDNA和CfRNA提取效率。结果也示出在外周循环中使用mRNA 片段作为用于生物样本的内源性的参考标准和质量控制的可能性。 巧074] 示例3 在此示例中，仅MOE过滤器柱与下列缓冲剂和协议使用： 缓冲剂： 裂解缓冲剂（LB):包括异硫氯酸脈(GITC)，4 !,Triton X-IOO 8%，Qiagen蛋白酶K (cat. 19131, Qiagen, CA),lOOul/ml LB。
[007引结合缓冲剂(BB):包括3 M GITC，40%异丙醇（IPA，最终浓度），混合得非常好。
[0076]冲洗缓冲剂(WB):包括 10 ml Tris,2 ml 邸TA,IOmM NaCl,70%乙醇，pH 7.0。
[OOW]洗脱缓冲剂:Qiagen缓冲剂AVE(包括在QIAamp循环核酸盒）。
[007引协议； 1、裂解:通过IOml的注射器用长针将2ml的解冻BCS吸入含有2ml LB的50ml塑料离屯、 管，通过满旋混合，在30分钟内在60°C加热块中培育。在室溫下冷却。
[0079] 2、结合:将IOml的BB吸入样品裂解管中，通过满旋混合，在10分钟内在室溫中保 持。
[0080] 3、结合和提取:将50ml裂解管中的所有含量用长针吸入20-30ml鲁尔锁注射器，继 续直到将约5ml的空气吸入注射器中，将鲁尔锁注射器梓入牢固地安置在架子中的所组装 的MOE器件400的帽体上的鲁尔锁连接器上。向下压下注射器柱塞，直到注射器中的所有液 体和空气穿过过滤器柱。废物被收集在MOE器件的50ml管中。此过程可W采取1-2分钟。梓开 20ml注射器。
[0081 ] 4、将4ml的WB吸入IOml鲁尔锁注射器，将柱塞压下W允许WB穿过柱。梓开IOml注射 器。
[0082] 5、将4ml的100%乙醇吸入IOml注射器，将柱塞压下W允许乙醇穿过柱。
[0083] 6、梓开MOE器件的帽体并将过滤器柱从帽体拆卸。将柱完全地插入柱中的1.5-2ml RNase-、无 DNase微离屯、管、空气干燥的乙醇残留物中。
[0084] 7、将10化1的洗脱缓冲剂AVE直接添加到过滤器柱中的吸收基质，梓紧过滤器柱上 的帽体W阻止在处理中的污染。等待10-30分钟W重新水化所结合的NA并从吸收基质释放 所结合的NA。
[008引8、在3分钟内在15,000-20,000G下用所插入的柱将微管离屯、。收集洗脱物用于下 游应用，或者在-20°C-8(rC下储存。
[0086] 在此实验中，2ml的LB被添加到6-50ml的离屯、管中并且在2ml的BCS之后。另外，2pl 的10倍稀释的"TB-DNA"溶液（1.5 X IO5份/pl)被渗入每个裂解管中。下列过程根据多至步 骤6的上述协议完成。
[0087] 在步骤6之后，6 MOE柱被分成3组相同的复制品（A和B)并对于每组分别表示为 MOE-O wk、M0E-2 Wk和M0E-4 wk，从而分别指示用于0周、2周和4周的进一步处理。
[0088] 进一步处理如下：标示为MOE-O Wk的组立即进行上述过程的步骤7;标示为M0E-2 wk和M0E-4 wk的组通过硅胶干燥剂Minipax ?吸收剂包中的一包（cat. Z163554, 0.5g/ 包，Sigma-Aldrich，MO)被保持在新的50ml离屯、管中。50ml的管被紧密地闭合并用一件件 封口膜(VWR，PA)包裹W确保完全密封。与过滤器柱密封的管分别暴露于室溫2周（M0E-2 Wk)和4周(M0E-4 wk)。在暴露结束时，两组被打开并且过滤器柱经由上述的步骤7进行处 理。
[0089] 在步骤8之后，所有洗脱物用qPCR和RT-qPCR检测，如示例2中所示。结果在表3中示 出。
[0090] 通过比较从柱洗脱的样品的Ct值与在暴露于室溫2周和4周之后洗脱的样品的Ct 值，惊讶地发现在由qPCR和RT-qPCR检查的所有不同种类的CfNA片段中，数量和因此(可扩 增的）整体性几乎是相同的。通过比较，当过滤器柱在步骤7之后暴露于正常湿度和室溫几 天时，所吸收的CfNA,特别是RNA种类被劣化并且是不可扩增的(数据未示出）。
[0091] 惊奇的发现意味着在提取之后，所吸收的CfNA,特别是过滤器基质上的脆弱CfRNA 可W得到稳定并且在室溫中良好地保存。大体积的乙醇(在运种情况下是4ml)冲洗多孔吸 收基质，并且此外，在封闭环境中用干燥剂将所吸收的NA保持在脱水状态，有效地保护RNA 免于劣化。用于所吸收的NA的简单经济处理提供一种简单的方法来处理、储存和运输生物 样本。
巧〇9引示例4:人外周血液中的病原体特异性核酸序列的检测 新鲜的人外周血液被从两个成年受试者(分别是卫生控制和潜伏性结核感染可疑者， 肥和LTBI)吸取。LTBI受试者被定义为PPD皮试阳性，其住在TB低负担国家25年，但是最近在 过去的两年中在TB高负担国家中具有TB接触历史。在过去的两年期间，该受试者通过CT X-射线检查测试了=次，进行疲涂片检查四次并且进行TB培养=次。所有那些测试已被证明 是阴性的，但是结核菌素试验(PPD)从负转换成正（1.8cm)。该受试者没有与结核相关的症 状。该受试者由医疗专业人员推定地定义为LTBI。众所周知的是在LTBI诊断中具有一些重 要的障碍;尤其是，没有方法来使用当前技术取得用于身体中的细菌感染的直接证据。对于 运种情况，未使用用于LTBI诊断的附加测试。
[0094]血浆通过离屯、作用（2000g，10分钟）与整个血液分离。cNA被提取作为示例3中所示 的相同过程。对于来自疑似LTBI受试者的外周血液中的TB特异性DNA片段的检测，血浆中的 人体内源性cNA片段通过qPCR和RT-qPCR，通过3引物对的常用持家基因 B2M( 0-2-微球蛋白） 和PPIA(铁基异构