多重核酸检测方法和系统的制作方法

专利名称：多重核酸检测方法和系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于单分子克隆扩增和核酸分子后续检测的方法和系统，且本发明尤其涉及判断单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms ;SNPs)、突变和诊断与这些核酸分子变化有关的疾病。
背景技术：
数十年来,聚合酶链反应(Polymerase chain reaction ；PCR)已被广泛地用于核酸分析的许多领域。单分子PCR(也称为数字PCR)是PCR技术相对较新的发展。在单分子PCR中，样品被稀释且分配至许多单个核酸扩增反应中，平均每一个反应具有少于一个的拷贝模板。一些反应没有模板分子，一些反应具有大于一个拷贝的模板分子，且一定百分比的反应刚好具有一个拷贝的模板。所有反应平行进行。在这些反应中，始于一个拷贝的模板分子的克隆扩增子可使用本领域已知的方法检测到。关于样品中是否具有特定的目标分子，分析结果提供“是”或“否”二进制信号，例如O或I的数字格式。数字PCR中所有反应的结果，通过统计分析对目标分子进行定量。数字PCR将传统PCR的指数扩增转换为线性关系，且数字PCR将传统模拟信号转换为数字格式。Vogelstein等人于1999年在Proc. NatlAcad. Sci. USA第96期第9236-9241页和美国专利第6，143，496号对于数字PCR有更详细说明，所述论文和美国专利列为本文的参考文献。数字PCR的应用包括早期癌症诊断的基因突变检测、评估等位基因不平衡、产前基因测试、基因表达的定量分析和DNA甲基化状态分析。Pohl等人Expert Rev. Mol. Diagn，2004,4(1) :41-47 ；Blow, Nature Methods,2007,4(10) :869-875 ;Diel 等人 Curr OpinOncol, 2007,19 :36-42 ；Dressman 等人 PNAS,2003,100(15) :8817-8822 ；ffeisenberger 等人Nucleic Acids Res.，2008，36 (14) :4689-4698 ;所有论文列为本文的参考文献。数字PCR所基于的单分子扩增原理还用于当前的第二代DNA测序技术中，诸如，Roche LifeSciences 的 DNA 焦憐酸测序技术,Life Technologies 的 SOLiD DNA 测序技术和 Illumina的DNA边合成边测序技术，用于测序模板制备。
数字PCR的一个优点为数字PCR在类似模板分子的较大背景下仍能检测和定量罕见序列变化(诸如，突变)的能力。这是因为每一个扩增反应可独立于样品中的其他目标分子，因为通过限制稀释模板分子被分配至单个PCR反应中。此种能力可用于对体液(诸如，来自结肠直肠癌患者的血浆样品和大便样品)进行非侵入性早期癌症检测，如Diehl等人 PNAS，2005，102(45) :16368-16373 ；Diehl 等人 Gastroenterol.，2008，135 (2) :489-498中所描述，所有论文列为本文的参考文献。本技术还能够在母亲DNA存在的情况下进行非侵入性产前基因测试，如Lo等人PNAS，2007，104(32) :13116-13121中所描述，所述论文列为本文的参考文献通过统计样品中的阳性PCR反应，可使用数字PCR进行定量。通过判断所得扩增子的标识，可对变种DNA分子与野生型DNA分子之间的区别。根据这些结果统计计算变种DNA分子与野生型DNA分子的比率。数字PCR还可以用于目标分子的绝对定量。可在Dube等人PLoS ONE, 2008, 3 (8), e2876 ;Warren 等人的“The Digital Array Response Curve”(未发表，见斯坦福大学网页 thebigone. Stanford, edu/quake/publications/DigResCurve. pdf)中发现数字PCR定量的更多细节，所有论文列为本文的参考文献。可通过增加被分析的目标分子的数量(即对更多PCR反应进行平行筛选)，以改进数字PCR的精确度和准确性。当前，位于美国加利福尼亚州南圣弗朗西斯科(South San Francisco)的Fluidigm公司的384孔芯片或48X770数字阵列微流生物芯片(Digital ArrayNanofluidic Biochip)可用于数字PCR。这些应用中的大部分应用利用实时PCR来分析每一个反应中的扩增子。文献中名称为BEAMing的方法通过乳胶PCR在磁珠上产生克隆扩增子且使用流式细胞计量术来检测和计数那些具有扩增子的小珠。然而，这些数字PCR方法因为受可用荧光染剂的光学分辨率的限制而具有有限的多重检测能力。从单分子产生克隆扩增子的其他方式包括滚环扩增(rolling circleamplification ；RCA)。RCA为等温扩增方法,在所述方法中核酸探针经杂交或连接到目标核酸分子上，接着，使用引物多次复制所述目标核酸分子的序列，所述引物与探针序列部分互补。可在 Eriksson 等人，J. Microbiol. Methods, 2009, 78,195-202 ;Baner 等人，NucI.Acids Res.,1998,26(22) :5073-5078 ；Baner 等人，Curr. Opinion Biotech. ,2001,12,11-15中发现RCA和RCA应用的更多详细说明；所有论文列为本文的参考文献。RCA还可用于第二代DNA测序技术的样品制备中，Drmanac等人，Science, 2010, 327 :78-81,所述论文列为本文的参考文献。

发明内容
在一个方面，本发明提供一种用于判断多个标识序列(IS)标签的编码(ID码)的方法，所述方法包含(a)在表面上固定多个分析物分子，其中每一个分析物分子包含一标识序列标签(IS标签)，且所述标识序列标签可与探针进行杂交；(b)将来自标记IS探针(设定LISP)探针库的一对标识序列标记IS探针(LISP)与所述IS标签的碱基审视位置处进行杂交，进而并置所述一对LISP，其中所述的每一个LISP包含(i)与探针杂交的所述IS标识签序列互补的序列，以及(ii)与所述喊基审视位置处的指定喊基相关的标记；(c)用DNA连接酶连接所述一对并置的LISP ； (d)在所述分析物分子的所述IS标签上检测所述一对连接LISP上的所述标记的存在，且根据所述一对连接的LISP的所述标记组合，以判定所述IS标签的所述碱基审视位置处的碱基组成；(e)使所述一对连接的LISP变性而脱离所述分析物分子；(f)重复步骤(b)至步骤(e)，直到不重复地审视所述IS标签中的所有碱基位置，且判定所述IS标签的所有碱基组成为止；(g)通过所述IS标签碱基组成与预设ID码的比较，判断所述分析物分子上的所述IS标签的ID码。在一些实施方式中，在每一个连接循环中，可判定所述IS标签上的两个指定碱基位置，其中包括在所述配对LISP探针的每一侧上的一个所述指定碱基位置。在一些实施方式中，在每一个LISP库中存在两组探针，其中一组为所述3'端标记IS探针(3' -LISP),所述3'端标记IS探针包含5'端磷酸基和3'端标记，且另一组为所述5'端标记IS探针(5' -LISP),所述5'端标记IS探针包含5'端标记和3'端轻基。在一些实 施方式中，在两组LISP上存在四个不同的标记，其中每一个标记代表所述碱基审视位置处的一个指定碱基(A、C、G、T)。在每一个LISP库中包含所有所述审视位置处可能碱基组合所需要的所有探针。在一些实施方式中，在每一个连接循环中使用不同LISP库；且在每一个连接循环中依序审视所述IS标签上的不同碱基位置。在一些实施方式中，所述LISP上的所述标记为荧光染剂、电化学标记或纳米颗粒。在一些实施方式中，所述碱基审视位置处在从每一个LISP的连接点起的5个碱基内，且优选地在3个碱基内，以在所述成对探针连接步骤中保持所述碱基识别特异性。在另一个方面，本发明提供分析样品中的目标核酸序列的方法，所述方法包含(a)从样品中产生多个第一模板分子和多个第二模板分子，其中所述第一模板分子包含第一目标核酸序列和第一标识序列(IS)标签，且所述第二模板分子包含第二目标核酸序列和第二 IS标签，且其中所述第一 IS标签构成第一标识(ID)码且所述第二 IS标签构成第二 ID码；(b)利用克隆扩增所述第一模板分子以产生第一群组克隆扩增子，且利用克隆扩增所述第二模板分子以产生第二群组克隆扩增子，其中所述第一群组克隆扩增子和所述第二群组克隆扩增子在空间上分开定位；以及(c)识别所述克隆扩增子的所述IS标签的所述ID码，以判断所述克隆扩增子代表的所述目标核酸序列。在一些实施方式中，所述方法进一步包含通过分析所述第一群组克隆扩增子和所述第二群组克隆扩增子的序列状态，判断所述目标核酸序列的相应序列状态。在一些实施方式中，所述方法进一步包含定量来自每一个模板分子的克隆扩增子的群组数量，以推断所述样品中的每一个目标核酸序列的量。在一些实施方式中，所述方法进一步包含在表面上固定所述第一群组克隆扩增子和第二群组克隆扩增子。在一些实施方式中，所述目标核酸序列选自由以下组成的群组基因体DNA、cDNA和 RNA。在一些实施方式中，使用引物通过酶促反应，以产生所述第一和第二模板分子，其中所述引物包含所述IS标签和序列，所述序列与所述目标核酸序列中的至少一部分为互补的序列，且其中维持所述样品中的所述两个目标核酸序列的数量比。在一些实施方式中，通过酶促扩增或复制，在所述表面上产生所述第一和第二群组克隆扩增子，其中用于克隆扩增或复制的至少两个引物接合于所述表面上且在空间上分开。在一些实施方式中，在多个水性液滴中进行所述克隆扩增，每一个水性液滴包含DNA扩增试剂，所述DNA扩增试剂包括多个引物；以及微粒，其中至少一个引物接合于所述微粒的表面上。在一些实施方式中，所述水性液滴由油包水型乳胶形成，且所述水性液滴含于反应容器中，其中所述反应容器含有油相，且所述油相包含与水不混溶的液体。在一些实施方式中，所述DNA扩增为聚合酶链反应(PCR)，且在所述克隆扩增期间所述反应容器为热循环的。在一些实施方式中，在亲水反应点上进行模板分子的所述克隆扩增，而所述亲水反应点在疏水表面上形成图案化，其中每一个亲水反应点包含所述水性液滴。在一些实施方式中，所述亲水反应点由所述与水不混溶的液体覆盖，以在所述克隆扩增期间防止水相蒸发且隔离各单个亲水反应点。在一些实施方式中，所述DNA扩增为聚合酶链反应(PCR)，且在所述克隆扩增期间所述表面为热循环的。在一些实施方式中，所述克隆扩增通过所述单链模板分子的环化，且由DNA聚合酶在延伸寡核苷酸上进行后续的等温滚环扩增(RCA)，其中所述延伸寡核苷酸在5'末端接合于所述表面上且其3'末端处与所述环化模板分子互补，且所述延伸寡核苷酸包含用 于酶促延伸的3'端羟基(3' -OH基)。在一些实施方式中，通过酶促延伸产生至少两个拷贝的所述环化模板分子序列。在一些实施方式中，所述DNA聚合酶包含Φ29 ΝΑ聚合酶。在一些实施方式中，通过在所述延伸寡核苷酸上连接所述模板分子的两个末端，进行所述模板分子的所述环化，所述模板分子含有特定的核酸序列，且所述核酸序列为从目标核酸序列制备所述模板分子时所用引物序列中的一部分。在一些实施方式中，所述环化模板分子的长度介于40个碱基与400个碱基之间，且长度优选地介于60个碱基与200个碱基之间。在一些实施方式中，对所述不同模板分子中的至少两个模板分子来说，所述两个末端处的所述特定的核酸序列为相同的或不同的。在一些实施方式中,所述微粒为磁性微粒。在一些实施方式中，所述微粒的所述表面包含二氧化硅或聚苯乙烯。在一些实施方式中，所述克隆扩增子直接连合至磁性微粒的所述表面。在一些实施方式中，所述克隆扩增子通过物理力或通过化学键结，在所述表面上固定所述磁性微粒。在一些实施方式中，其中所述物理力为磁场。在一些实施方式中，通过标记探针的依序连接循环或通过DNA测序技术，同时判断所述克隆扩增子的所述ID码，且其中所述ID码显示出每一群组克隆扩增子所代表的所述目标核酸序列。在一些实施方式中，每一群组克隆扩增子的所述序列状态包括但不限于单核苷酸多态、突变或甲基化状态，可由本领域已知的方法进行判断。本发明的另一个方面提供一种用于多重核酸分析的系统，所述系统包含可移动的流动室，所述流动室包含第一反应表面和第二表面，其中在所述第一反应表面中实施生物反应，而所述第二表面包含检测窗口，通过所述检测窗口检测所述流动室内部的所述生物反应；温度控制单元，所述温度控制单元包含导热层和相关的加热元件和冷却元件，所述相关的加热元件和冷却元件连接到所述导热层上；和永磁体，所述永磁体施加磁场穿过所述导热层；以及任选地，绝热层，所述绝热层介于所述导热层与所述磁体之间，其中所述流动室定位于所述导热层上，以调节所述第一反应表面的温度，且所述流动室受所述磁场的影响，所述磁场由所述磁体提供；流体控制单元，所述流体控制单元连接至所述流动室，以控制试剂传输至所述流动室且控制试剂从所述流动室去除；检测单元，所述检测单元用于检测所述流动室的所述第一表面上的适当标记的存在且判断所述流动室的所述第一表面上的适当标记的位置；和电子控制单元，所述电子控制单元用于控制且协调所述系统的元件，且执行资料分析。在一些实施方式中，所述可移动的流动室能够与所述温度控制单元分开，以在必要时最小化所述磁场对所述流动室的所述第一反应表面的效应。在一些实施方式中，通过热电冷却器、电阻加热器以及冷却风扇或热水和冷水的循环，执行所述温度调节。在一些实施方式中，所述磁性单元包含永磁体。在一些实施方式中，所述检测单元包含光学器件和检测器，以通过所述流动室的检测窗口进行荧光检测。在一些实施方式中，所述系统包含多个流动室。本发明的另一个方面提供一种用于涵盖多重核酸分析的试剂盒。所述试剂盒的一实施方式包含引物，所述引物含有各种IS标签，以在模板分子制备中进行基因特异性预扩增；LISP探针，用荧光染色标记所述LISP探针，所述荧光染色的光谱与检测器的能力和其他所需试剂兼容。


图Ia为将IS标签嵌入模板分子和克隆扩增的方法示意图。图Ib为将IS标签嵌入模板分子和克隆扩增的另一个方法示意图。图Ic为通过单分子滚环扩增将IS标签嵌入模板分子和克隆扩增的方法示意图。图2为流动室和流动室内部磁性微粒分布的示意图。图3图示一系列单个PCR反应液滴，该等反应液滴在图案化表面上含有磁性微粒，所述图案化表面由油层覆盖，在过度去除油后由外部磁力将这些磁性微粒维持于表面上。图4示出用于IS标签测定的依序成对探针连接化学作用的原理。图5a :表I显示来自IS标签的可能ID码的色码和相应的碱基组成的实例。图5b 表2显示特定的碱基码。表3显示同义的碱基码。图6示出转移ID窗口以供依序成对探针连接的原理。图7图示系统的实例。图8图示使用多重核酸分析进行非侵入性癌症早期检测的实例。图9示出本发明的示范性实施方式。
具体实施例方式本发明提供用于同时分析多个目标核酸序列的方法和系统，诸如用于发现和验证以及临床诊断的多个生物标记检测。A.由标识序列标签进行多重核酸分析在一个方面，本发明提供分析样品中的目标核酸序列的方法。本文中，用“核酸”或“寡核苷酸”或者语法上的等效物表示至少两个共价连接在一起的核苷酸。通常，本发明的核酸将含有磷酸二酯键，但是在一些情况下，例如在引物含有标记时，可使用核酸类似物。核酸可为DNA (基因组DNA和cDNA)、RNA或杂合体，其中核酸含有去氧核醣核苷酸与核糖核苷酸的任意组合和碱基的任意组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷、黄嘌呤和次黄嘌呤等。如本文所用，术语“核苷”包括核苷酸和核苷和核苷酸类似物，以及修饰核苷，诸如标记修饰核苷。
本文中，用“目标核酸序列”或“目标序列”或者语法上的等效物表示单链核酸上的核酸序列。目标序列可为基因、调控序列、基因组DNA、cDNA、RNA (包括mRNA和rRNA)或其他序列中的一部分。目标序列可为任意长度，同时应了解较长序列更具有特异性。在一些实施方式中，可能理想的为，将样品核酸裂解或切割成100个碱基对至10，000个碱基对的片段，在一些实施方式中优选大致500个碱基对的片段。如将为本领域技术人员所认识，互补的目标序列可采用许多形式。例如，目标序列可含于较大核酸序列内，即，基因或mRNA中的全部或一部分、质粒DNA或基因组DNA中的一限制性片段及其他基因序列。如本文中所概述，在一些实施方式中，目标序列包含需要序列信息的位置，在本文中通常称为“检测位置”或“检测位点”。在一个实施方式中，检测位置为单核苷酸，但是在一些实施方式中，检测位置可包含 多个核苷酸，既可彼此接近也可由一或更多个核苷酸分离开来。如本文所用的“多个”表示至少两个。如本文所用，与杂合体中的检测位置碱基进行碱基配对的碱基称为“读出位置”或“审视位置”；因此本发明的许多探针包含审视位置。在一些实施方式中，如本文中所概述，目标序列可能不是样品目标序列而是扩增反应产物，在本文中有时称为“衍生”目标序列、“模板分子”或扩增子。本文中，用“扩增子”表示核酸分子，所述核酸分子通过扩增方法生成。通常，由PCR方法(包括多重PCR)进行扩增。扩增子可能为双链DNA分子或单链DNA分子。如下所述，可使用能增加其中一链的扩增反应技术。在一个实施方式中，本发明的扩增子包括目标核酸序列。在另一个实施方式中，扩增子含有核酸目标链和第二核酸目标链，所述核酸目标链由本文所述的方法扩增，所述核酸目标链含有如下文所述的两个或两个以上目标域，所述第二核酸目标链与第一核酸链互补。用“单链目标核酸”、“单链目标”、“单链目标序列”或所述术语语法上的等效物表示用于本发明的扩增方法的起始材料。在另一个实施方式中，本发明的目标序列含有与探针序列大体上互补的区域，如本文中所定义。包含目标序列的样品可实际上来自任意有机体和任意源，所述有机体和源包括但不限于体液(包括但不限于，实际上任意有机体样品的血液、骨髓、尿、排泄物、泪液、血清、淋巴液、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液、精液和其他体液，任意有机体诸如包括人类的哺乳动物)；细菌和病菌(包括病毒)的细胞裂解物；硬组织(例如器官，诸如肝脏、脾脏、肾、心脏、肺等)；环境样品(包括但不限于，空气样品、农业样品、水样品和土壤样品)；生物战剂样品；研究样品(即，样品可为扩增反应产物，所述扩增反应包括诸如PCR扩增反应的目标扩增和信号扩增，如通常在W099/037819中所描述，所述专利列为本文的参考文献)；纯化样品，诸如纯化基因体DNA、RNA、蛋白质等；原样(细菌、病毒、基因体DNA等)；如将为本领域技术人员所认知，可对样品进行任意实验操作。如果需要的话，那么使用已知的技术来制备目标序列。例如，可使用已知的裂解液、电穿孔等，处理样品以溶解细胞，其中根据需要进行纯化和/或扩增，如将为本领域技术人员所认识。在一个方面，本发明提供基因特异性预扩增的方法，将设定的IS标签和IS码嵌入基于目标核酸序列所产生的扩增子。基因特异性预扩增已广泛用于核酸分析，诸如，基因分型、基因表达分析和临床诊断中的样品制备。Li 等人，Nucleic Acids Res. , 1996, 24 :538-539 ;Mengual 等人,BMCResearch Notes, 2008 年 6 月，I :21 ;Xia 等人，Genet. Mol. Biol. ；2009 :20-24 ；Arneson等人，Cold Spring Harb. Protoc, “Whole-Genome Amplification by Improved PrimerExtension Preamplification PCR(I-PEP-PCR) ”，2008 ;所有论文列为本文的参考文献。在一些实施方式中，本发明的方法包含从样品中产生多个第一模板分子和多个第二模板分子，第一模板分子包含第一目标核酸序列和第一标识序列(IS)标签，且第二模板分子包含第二目标核酸序列和第二 IS标签，并且第一 IS标签构成第一 ID码且第二 IS标签构成第二 ID码。
在一些实施方式中，使用引物，通过酶促反应产生第一和第二模板分子，所述引物包含IS标签和序列，所述序列与目标核酸序列中的至少一部分互补，其中保留样品中的两个目标核酸序列的数量比。本文中，用“标识序列(IS)标签”表示较短人造DNA序列，所述较短人造DNA序列用于样品分析物间识别特定目标分子的编码。在一些实施方式中，IS的长度小于6个碱基或小于10个碱基。IS标签还可包含额外的核酸序列，所述额外的核酸序列在解码处理期间为探针杂交所需要。通常，将IS标签设计为不同于核酸分析中目标基因体序列。在一些实施方式中，引入这些IS标签作为样品制备中的一部分。本文中，用“标识(ID)码”表示分配给IS标签的代码。每一个IS标签的碱基组成对应于一个特定的ID码。在一些实施方式中，第一和第二目标核酸序列的丰度类似。在一些实施方式中，第一目标核酸序列比第二目标核酸序列丰富至少100倍、1000倍或10，000倍。在一些实施方式中，本发明的方法包含通过第一模板分子的克隆扩增产生第一群组克隆扩增子，且通过第二模板分子的克隆扩增产生第二群组克隆扩增子，其中第一群组克隆扩增子和第二群组克隆扩增子在空间上分离定位。本文中，用“克隆扩增子”或“扩增子克隆”表示扩增子群组，扩增子群组可直接或间接地追溯到分离的多核苷酸。本文中，用“克隆扩增”表示分离且扩增多核苷酸以产生“扩增子克隆”或“克隆扩增子”的方法。本文中，用“在空间上分离定位”表示两个或两个以上群组扩增子在空间上定位不同。例如，不同群组扩增子可定位于相同表面上的不同点上、或定位于不同表面上，诸如本文所述的不同微粒表面上。在一些实施方式中，通过酶促扩增或复制，在表面上产生第一和第二群组克隆扩增子，其中在克隆扩增期间，用于扩增或复制的至少两个引物连接至表面且在空间上分离开来。在一些实施方式中，多簇克隆扩增子接合至表面上。克隆扩增子直接或间接地连接至表面。在一些实施方式中，克隆扩增子接合至磁性微粒的表面，且通过本文所述或本领域已知的物理力(例如，磁场)或通过化学键结，在表面上固定磁性微粒。在一些实施方式中，识别所述克隆扩增子的IS标签的ID5马，以判定由本文所述的克隆扩增子代表的目标核酸序列。在一些实施方式中，通过分析克隆扩增子的所述群组序列状态，判断目标核酸序列的相应序列状态。本文中，用“序列状态”表示序列特征，诸如单核苷酸多态、突变或甲基化。序列状态可由本领域已知或本文中所公开的方法进行判断，方法包括但不限于标记探针连接、单碱基延伸、DNA测序和熔解曲线分析。在一些实施方式中，本发明的方法进一步包含通过累加含有同一 IS标签的克隆扩增子群组数，定量来自每一个模板分子的克隆扩增子的簇组数量，根据已知的用于样品制备中的稀释倍率，以推断样品中的每一个目标核酸序列的量。通常，单分子克隆扩增中的模板分子的随机分布遵循泊桑(Poisson)分布。C反应腔室中的M模板分子的随机分布遵循泊桑分布。在给定反应腔室中具有至少一个模板分子的概率表示为P，
权利要求
1.一种用于判断多个标识序列标签的标识码的方法，所述方法包含以下步骤 (a)在一表面上固定多个分析物分子,其中每一个分析物分子包含一标识序列(IS)标签，且所述标识序列(IS)标签可与探针进行杂交； (b)将来自标记IS探针(LISP)库的一对LISP与所述IS标签在碱基审视位置处进行杂交，进而并置所述一对LISP，其中每一个所述LISP包含(i)与所述探针杂交的所述IS标签序列互补的序列，以及(ii)与所述喊基审视位置处的指定喊基相关的标记； (c)连接所述一对并置的LISP； (d)在所述分析物分子的所述IS标签上检测所述一对连接的LISP上所述标记的存在，且根据所述一对连接的LISP的所述标记组合，判定所述IS标签的所述碱基审视位置处的喊基组成； (e)使所述一对连接的LISP变性而脱离所述分析物分子； (f)重复步骤(b)至步骤(e)，直到不重复地审视所述IS标签中的所有碱基位置，且判定所述IS标签的所有喊基组成为止；和 (g)通过比较所述碱基组成与预定ID码，判断所述分析物分子上的所述IS标签的所述ID码。
2.如权利要求I所述的方法，其中审视所述IS标签上的两个指定碱基位置，包括在所述一对连接的LISP的每一侧上的一个所述指定碱基位置。
3.如权利要求I所述的方法，其中在每一个LISP库中存在两组探针，其中一组为3'端标记的IS探针(3' -LISP),所述3'端标记的IS探针包含5'端磷酸基和3’端标记，且另一组为5'端标记的IS探针(5' -LISP),所述5'端标记IS探针包含5'端标记和3'端羟基。
4.如权利要求I所述的方法，其中在两组LISP上存在四个不同的标记，其中每一个标记代表所述审视位置处的一个指定碱基(A、C、G、T)，且其中在每一个LISP库中包含所述审视位置处的所有可能碱基组合所需要的所有探针。
5.如权利要求I所述的方法，其中在每一个连接循环中使用不同LISP库，且其中在每一个连接循环中依序审视所述IS标签上的不同碱基位置。
6.如权利要求I所述的方法，其中所述LISP上的所述标记包含荧光染剂、电化学标记或纳米颗粒。
7.如权利要求I至6中的任一项所述的方法，其中所述碱基审视位置处在距每一个LISP的连接点起的5个碱基内，且优选地在3个碱基内，以在所述成对探针连接步骤中保持碱基识别特异性。
8.—种分析样品中的目标核酸序列的方法，所述方法包含 (a)从样品中产生多个第一模板分子和多个第二模板分子，其中所述第一模板分子包含第一目标核酸序列和第一标识序列(IS)标签，且所述第二模板分子包含第二目标核酸序列和第二 IS标签，并且其中所述第一 IS标签构成第一标识(ID)码且所述第二 IS标签构成第二 ID码； (b)利用克隆扩增所述第一模板分子以产生第一群组克隆扩增子，且利用克隆扩增所述第二模板分子以产生第二群组克隆扩增子，其中所述第一群组克隆扩增子和所述第二群组克隆扩增子在空间上分开定位；和(C)识别所述克隆扩增子的所述IS标签的所述ID码，以判断所述克隆扩增子代表的所述目标核酸序列。
9.如权利要求8所述的方法，所述方法进一步包含通过分析所述群组克隆扩增子的序列状态，判断所述目标核酸序列的相应序列状态。
10.如权利要求8所述的方法，所述方法进一步包含定量来自每一个模板分子的克隆扩增子的群组数量，以推断所述样品中的每一个目标核酸序列的量，且任选地定量所述样品中的所述参考序列。
11.如权利要求8所述的方法，所述方法进一步包含在表面上固定所述第一群组克隆扩增子和第二群组克隆扩增子。
12.如权利要求8至12中的任一项所述的方法，其中所述第一目标核酸序列和第二目标核酸序列可为相同的或可为不同的，且可以存在更多所述第一和第二目标核酸序列。
13.如权利要求8至12中的任一项所述的方法，其中所述目标核酸序列选自由以下组成的群组基因体DNA、cDNA和RNA。
14.如权利要求8至12中的任一项所述的方法，其中使用引物通过酶促反应，以产生所述第一模板分子和第二模板分子，所述引物包含所述IS标签和序列，所述序列与所述目标核酸序列中的至少一部分为互补，且其中维持所述样品中的所述两个目标核酸序列的数量比。
15.如权利要求11所述的方法，其中通过酶促扩增或复制，在所述表面上产生所述第一和第二群组克隆扩增子，其中在所述克隆扩增期间，用于所述扩增或复制的至少两个所述引物是接合于所述表面且在空间上分开的。
16.如权利要求8至15中的任一项所述的方法，其中所述克隆扩增在多个水性液滴中进行，且每一个水性液滴包含 DNA扩增试剂，所述DNA扩增试剂包括多个引物；和 微粒，其中至少一个所述引物是接合于所述微粒的表面上。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述水性液滴由油包水型乳胶形成，且所述油包水型乳胶置于反应容器中，其中所述反应容器含有与水不混溶的液体。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中所述DNA扩增为聚合酶链反应(PCR)，且在所述克隆扩增期间所述反应容器为热循环的。
19.如权利要求16所述的方法，其中在亲水反应点上进行模板分子的所述克隆扩增，而所述亲水反应点在疏水表面上形成图案化，且其中每一个亲水反应点包含所述水性液滴。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述亲水反应点由与水不混溶的液体覆盖，以在所述克隆扩增期间防止水相蒸发且隔离各单个亲水反应点。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述DNA扩增是聚合酶链反应(PCR)，且在所述克隆扩增期间所述表面为热循环的。
22.如权利要求8至17、19和20中的任一项所述的方法，其中所述克隆扩增通过所述单链模板分子的环化由DNA聚合酶在延伸寡核苷酸上进行后续的等温滚环扩增(RCA)，其中所述延伸寡核苷酸在5'末端接合于所述表面或微粒上，且其3'末端处与所述环化模板分子互补，且所述延伸寡核苷酸包含用于酶促延伸的自由3'端羟基。
23.如权利要求22所述的方法，其中通过所述酶促延伸产生至少两个拷贝的所述环化模板分子序列。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述DNA聚合酶包含O29DNA聚合酶。
25.如权利要求22至24中的任一项所述的方法，其中通过在所述延伸寡核苷酸上连接所述单链模板分子的所述两个末端，进行所述模板分子的环化，所述模板分子含有特定的核酸序列，且所述特定核酸序列为产生所述模板分子所用的引物序列中的一部分。
26.如权利要求25所述的方法，其中对至少两个所述不同的模板分子来说，所述两个 末端处的所述特定的核酸序列为相同的或不同的。
27.如权利要求22所述的方法，其中所述环化模板分子的长度介于40个碱基与400个碱基之间，且长度优选地介于60个碱基与200个碱基之间。
28.如权利要求16至27中的任一项所述的方法，其中所述微粒为磁性微粒。
29.如权利要求16所述的方法，其中所述微粒的所述表面包含二氧化硅或聚苯乙烯。
30.如权利要求26所述的方法，其中所述克隆扩增子接合于磁性微粒的所述表面，且其中通过物理力或通过化学键结，在所述表面上固定所述磁性微粒。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述物理力为磁场。
32.如权利要求8所述的方法，其中通过标记探针的依序连接循环或通过DNA测序技术，同时判断所述克隆扩增子的所述ID码，且所述每一群组克隆扩增子的ID码显示出每一群组克隆扩增子所代表的所述目标核酸序列。
33.一种用于多重核酸分析的系统，所述系统包含 可移动的流动室，所述流动室包含第一反应表面和第二表面，其中在所述第一反应表面中实施生物反应，而所述第二表面包含检测窗口，通过所述检测窗口检测所述流动室内部的所述生物反应； 温度控制单元，所述温度控制单元包含导热层和相关的加热元件和冷却元件，所述相关的加热元件和冷却元件连接到所述导热层上；和永磁体，所述永磁体施加磁场穿过所述导热层；以及任选地，绝热层，所述绝热层介于所述导热层与所述磁体之间，其中所述流动室定位于所述导热层上，以调节所述第一反应表面的温度，且所述流动室受所述磁场的影响，所述磁场由所述磁体提供； 流体控制单元，所述流体控制单元连接至所述流动室，以控制试剂传输至所述流动室且控制试剂从所述流动室去除； 检测单元，所述检测单元用于检测所述流动室的所述第一表面上的适当标记的存在且判断所述流动室的所述第一表面上的适当标记的位置；和 电子控制单元，所述电子控制单元用于控制且协调所述系统的元件，且执行资料分析。
34.如权利要求33所述的系统，其中所述可移动的流动室能够与所述温度控制单元分开，以在必要时最小化所述磁场对所述流动室的所述第一反应表面的效应。
35.如权利要求33所述的系统，其中通过热电冷却器、电阻加热器以及冷却风扇或热水和冷水的循环，执行所述温度调节。
36.如权利要求33所述的系统，其中所述系统包含多个流动室，以在所述流动室中同时执行不同操作或反应。
37.一种用于多重核酸分析的试剂盒，所述试剂盒包含酶促反应引物，其中一些所述引物包含标识序列(IS)标签；以及 标记探针库，其中所述标记探针库包含多个标记IS探针(LISP)。
38.如权利要求37所述的试剂盒，其中每一个标记探针库包含两组LISP，一组为3' -LISP，而另一组为5' -LISP，且其中每一组LISP包含的所有探针含有一指定碱基审视位置处。
39.如权利要求37所述的试剂盒，其中在每一组LISP上存在四个不同的标记，每一个标记代表所述审视位置处的一指定碱基(A、C、G、T)，且其中在每一个LISP库中包括所述审视位置处所有可能碱基组合所需要的所有探针。
全文摘要
本发明涉及基于单分子克隆扩增和后续检测核酸分子的方法和系统，且本发明尤其涉及判断单核苷酸多态性(SNPs)、突变和诊断与这些核酸分子变化有关的疾病。
文档编号C12Q1/68GK102625850SQ201080024654
公开日2012年8月1日 申请日期2010年4月2日 优先权日2009年4月3日
发明者蒂莫西·Z·刘 申请人:蒂莫西·Z·刘