多重核酸检测方法和系统的制作方法

多重核酸检测方法和系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基于单分子克隆扩增和后续检测核酸分子的方法和系统，且本发明尤其涉及判断单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms；SNPs)、突变和诊断与这些核酸分子变化有关的疾病。
【专利说明】多重核酸检测方法和系统
[0001] 本申请是中国专利申请201080024654. 8的分案申请。

【技术领域】
[0002] 本发明涉及基于单分子克隆扩增和核酸分子后续检测的方法和系统，且本发明尤 其涉及判断单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms ;SNPs)、突变和诊断与这 些核酸分子变化有关的疾病。

【背景技术】
[0003] 数十年来，聚合酶链反应（Polymerase chain reaction ;PCR)已被广泛地用于核 酸分析的许多领域。单分子PCR(也称为数字PCR)是PCR技术相对较新的发展。在单分子 PCR中，样品被稀释且分配至许多单个核酸扩增反应中，平均每一个反应具有少于一个的拷 贝模板。一些反应没有模板分子，一些反应具有大于一个拷贝的模板分子，且一定百分比的 反应刚好具有一个拷贝的模板。所有反应平行进行。在这些反应中，始于一个拷贝的模板 分子的克隆扩增子可使用本领域已知的方法检测到。关于样品中是否具有特定的目标分 子，分析结果提供"是"或"否"二进制信号，例如〇或1的数字格式。数字PCR中所有反应 的结果，通过统计分析对目标分子进行定量。数字PCR将传统PCR的指数扩增转换为线性关 系，且数字PCR将传统模拟信号转换为数字格式。Vogelstein等人于1999年在Proc. Natl Acad. Sci. USA第96期第9236-9241页和美国专利第6, 143, 496号对于数字PCR有更详细 说明，所述论文和美国专利列为本文的参考文献。
[0004] 数字PCR的应用包括：早期癌症诊断的基因突变检测、评估等位基因不平衡、产前 基因测试、基因表达的定量分析和DNA甲基化状态分析。Pohl等人Expert Rev. Mol. Diagn， 2004,4(1) :41-47 ;Blow, Nature Methods，2007,4(10) :869-875 ;Diel 等人 Curr Opin Oncol，2007,19 :36-42 ;Dressman 等人 PNAS，2003,100 (15) :8817-8822 ;Weisenberger 等 人Nucleic Acids Res.，2008,36(14) :4689-4698;所有论文列为本文的参考文献。数 字PCR所基于的单分子扩增原理还用于当前的第二代DNA测序技术中，诸如，Roche Life Sciences 的 DNA 焦憐酸测序技术，Life Technologies 的 SOLiD DNA 测序技术和 Illumina 的DNA边合成边测序技术，用于测序模板制备。
[0005] 数字PCR的一个优点为数字PCR在类似模板分子的较大背景下仍能检测和定量罕 见序列变化（诸如，突变）的能力。这是因为每一个扩增反应可独立于样品中的其他目标 分子，因为通过限制稀释模板分子被分配至单个PCR反应中。此种能力可用于对体液（诸 如，来自结肠直肠癌患者的血浆样品和大便样品）进行非侵入性早期癌症检测，如Diehl等 人 PNAS，2005,102 (45) :16368-16373 ;Diehl 等人 Gastroenterol.，2008,135 (2) :489-498 中所描述，所有论文列为本文的参考文献。本技术还能够在母亲DNA存在的情况下进行非 侵入性产前基因测试，如Lo等人PNAS，2007,104 (32) : 13116-13121中所描述，所述论文列 为本文的参考文献。
[0006] 通过统计样品中的阳性PCR反应，可使用数字PCR进行定量。通过判断所得扩增子 的标识，可对变种DNA分子与野生型DNA分子之间的区别。根据这些结果统计计算变种DNA 分子与野生型DNA分子的比率。数字PCR还可以用于目标分子的绝对定量。可在Dube等人 PLoS ONE，2008, 3(8)，e2876;Warren 等人的"The Digital Array Response Curve"（未发 表，见斯坦福大学网页 thebigone. Stanford. edu/quake/publications/DigResCurve. pdf) 中发现数字PCR定量的更多细节，所有论文列为本文的参考文献。可通过增加被分析的目 标分子的数量（即对更多PCR反应进行平行筛选），以改进数字PCR的精确度和准确性。
[0007] 当前，位于美国加利福尼亚州南圣弗朗西斯科（South San Francisco)的 Fluidigm公司的384孔芯片或48X770数字阵列微流生物芯片（Digital Array Nanofluidic Biochip)可用于数字PCR。这些应用中的大部分应用利用实时PCR来分析每 一个反应中的扩增子。文献中名称为BEAMing的方法通过乳胶PCR在磁珠上产生克隆扩增 子且使用流式细胞计量术来检测和计数那些具有扩增子的小珠。然而，这些数字PCR方法 因为受可用荧光染剂的光学分辨率的限制而具有有限的多重检测能力。
[0008] 从单分子产生克隆扩增子的其他方式包括滚环扩增（rolling circle amplification ;RCA)。RCA为等温扩增方法，在所述方法中核酸探针经杂交或连接到目标核 酸分子上，接着，使用引物多次复制所述目标核酸分子的序列，所述引物与探针序列部分互 补。可在 Eriksson 等人，J. Microbiol. Methods，2009, 78,195-202 ;Baner 等人，Nucl. Acids Res.，1998,26(22) :5073-5078 ;Baner 等人，Curr. Opinion Biotech.，2001，12,11-15 中发 现RCA和RCA应用的更多详细说明；所有论文列为本文的参考文献。RCA还可用于第二代 DNA测序技术的样品制备中，Drmanac等人，Science, 2010,327 :78-81,所述论文列为本文 的参考文献。


【发明内容】

[0009] 在一个方面，本发明提供一种用于判断多个标识序列（IS)标签的编码（ID码）的 方法，所述方法包含：(a)在表面上固定多个分析物分子，其中每一个分析物分子包含一标 识序列标签（IS标签），且所述标识序列标签可与探针进行杂交；(b)将来自标记IS探针 (设定LISP)探针库的一对标识序列标记IS探针（LISP)与所述IS标签的碱基审视位置 处进行杂交，进而并置所述一对LISP，其中所述的每一个LISP包含：（i)与探针杂交的所述 IS标识签序列互补的序列，以及（ii)与所述喊基审视位置处的指定喊基相关的标记；（c) 用DNA连接酶连接所述一对并置的LISP ;(d)在所述分析物分子的所述IS标签上检测所述 一对连接LISP上的所述标记的存在，且根据所述一对连接的LISP的所述标记组合，以判定 所述IS标签的所述碱基审视位置处的碱基组成；（e)使所述一对连接的LISP变性而脱离 所述分析物分子；（f)重复步骤（b)至步骤（e)，直到不重复地审视所述IS标签中的所有碱 基位置，且判定所述IS标签的所有碱基组成为止；（g)通过所述IS标签碱基组成与预设ID 码的比较，判断所述分析物分子上的所述IS标签的ID码。
[0010] 在一些实施方式中，在每一个连接循环中，可判定所述IS标签上的两个指定碱基 位置，其中包括在所述配对LISP探针的每一侧上的一个所述指定碱基位置。在一些实施 方式中，在每一个LISP库中存在两组探针，其中一组为所述3'端标记IS探针（3'-LISP)， 所述3'端标记IS探针包含5'端磷酸基和3'端标记，且另一组为所述5'端标记IS探针 (5' -LISP)，所述5'端标记IS探针包含5'端标记和3'端羟基。
[0011] 在一些实施方式中，在两组LISP上存在四个不同的标记，其中每一个标记代表所 述碱基审视位置处的一个指定碱基（A、C、G、T)。在每一个LISP库中包含所有所述审视位 置处可能碱基组合所需要的所有探针。在一些实施方式中，在每一个连接循环中使用不同 LISP库；且在每一个连接循环中依序审视所述IS标签上的不同碱基位置。
[0012] 在一些实施方式中，所述LISP上的所述标记为荧光染剂、电化学标记或纳米颗 粒。
[0013] 在一些实施方式中，所述碱基审视位置处在从每一个LISP的连接点起的5个碱基 内，且优选地在3个碱基内，以在所述成对探针连接步骤中保持所述碱基识别特异性。
[0014] 在另一个方面，本发明提供分析样品中的目标核酸序列的方法，所述方法包含： (a)从样品中产生多个第一模板分子和多个第二模板分子，其中所述第一模板分子包含第 一目标核酸序列和第一标识序列（IS)标签，且所述第二模板分子包含第二目标核酸序列 和第二IS标签，且其中所述第一 IS标签构成第一标识（ID)码且所述第二IS标签构成第 二ID码；(b)利用克隆扩增所述第一模板分子以产生第一群组克隆扩增子，且利用克隆扩 增所述第二模板分子以产生第二群组克隆扩增子，其中所述第一群组克隆扩增子和所述第 二群组克隆扩增子在空间上分开定位；以及（c)识别所述克隆扩增子的所述IS标签的所述 ID码，以判断所述克隆扩增子代表的所述目标核酸序列。
[0015] 在一些实施方式中，所述方法进一步包含：通过分析所述第一群组克隆扩增子和 所述第二群组克隆扩增子的序列状态，判断所述目标核酸序列的相应序列状态。
[0016] 在一些实施方式中，所述方法进一步包含：定量来自每一个模板分子的克隆扩增 子的群组数量，以推断所述样品中的每一个目标核酸序列的量。
[0017] 在一些实施方式中，所述方法进一步包含：在表面上固定所述第一群组克隆扩增 子和第二群组克隆扩增子。
[0018] 在一些实施方式中，所述目标核酸序列选自由以下组成的群组：基因体DNA、cDNA 和 RNA。
[0019] 在一些实施方式中，使用引物通过酶促反应，以产生所述第一和第二模板分子，其 中所述引物包含所述IS标签和序列，所述序列与所述目标核酸序列中的至少一部分为互 补的序列，且其中维持所述样品中的所述两个目标核酸序列的数量比。
[0020] 在一些实施方式中，通过酶促扩增或复制，在所述表面上产生所述第一和第二群 组克隆扩增子，其中用于克隆扩增或复制的至少两个引物接合于所述表面上且在空间上分 开。
[0021] 在一些实施方式中，在多个水性液滴中进行所述克隆扩增，每一个水性液滴包含： DNA扩增试剂，所述DNA扩增试剂包括多个引物；以及微粒，其中至少一个引物接合于所述 微粒的表面上。在一些实施方式中，所述水性液滴由油包水型乳胶形成，且所述水性液滴含 于反应容器中，其中所述反应容器含有油相，且所述油相包含与水不混溶的液体。
[0022] 在一些实施方式中，所述DNA扩增为聚合酶链反应（PCR)。
[0023] 在一些实施方式中，在亲水反应点上进行模板分子的所述克隆扩增，而所述亲水 反应点在疏水表面上形成图案化，其中每一个亲水反应点包含所述水性液滴。在一些实施 方式中，所述亲水反应点由所述与水不混溶的液体覆盖，以在所述克隆扩增期间防止水相 蒸发且隔离各单个亲水反应点。
[0024] 在一些实施方式中，所述克隆扩增通过所述单链模板分子的环化，且由DNA聚合 酶在延伸寡核苷酸上进行后续的等温滚环扩增（RCA)，其中所述延伸寡核苷酸在5'末端接 合于所述表面上且其3'末端处与所述环化模板分子互补，且所述延伸寡核苷酸包含用于 酶促延伸的3'端羟基（3'-OH基）。在一些实施方式中，通过酶促延伸产生至少两个拷贝的 所述环化模板分子序列。在一些实施方式中，通过在所述延伸寡核苷酸上连接所述模板分 子的两个末端，进行所述模板分子的所述环化，所述模板分子含有特定的核酸序列，且所述 核酸序列为所述模板分子制备时所用引物序列中的一部分。在一些实施方式中，所述环化 模板分子的长度介于40个碱基与400个碱基之间，且长度优选地介于60个碱基与200个 碱基之间。
[0025] 在一些实施方式中，对所述不同模板分子中的至少两个模板分子来说，所述两个 末端处的所述特定的核酸序列为相同的或不同的。
[0026] 在一些实施方式中，所述克隆扩增子直接连合至磁性微粒的所述表面，且其中通 过物理力或通过化学键结，在所述表面上固定所述磁性微粒。
[0027] 在一些实施方式中，通过标记探针的依序连接循环或通过DNA测序技术，同时判 断所述克隆扩增子的所述ID码，且所述ID码显示出每一群组克隆扩增子所代表的所述目 标核酸序列。
[0028] 本发明的另一个方面提供一种用于涵盖多重核酸分析的试剂盒。所述试剂盒的一 实施方式包含：酶促反应引物，其中所述引物含有各种IS标签，以在模板分子制备中进行 基因特异性预扩增；以及标记探针库，其中所述标记探针库包含多个LISP探针。

【专利附图】

【附图说明】
[0029] 图Ia为将IS标签嵌入模板分子和克隆扩增的方法示意图。图Ib为将IS标签嵌 入模板分子和克隆扩增的另一个方法示意图。图Ic为通过单分子滚环扩增将IS标签嵌入 模板分子和克隆扩增的方法示意图。
[0030] 图2为流动室和流动室内部磁性微粒分布的示意图。
[0031] 图3图示一系列单个PCR反应液滴，该等反应液滴在图案化表面上含有磁性微粒， 所述图案化表面由油层覆盖，在过度去除油后由外部磁力将这些磁性微粒维持于表面上。
[0032] 图4示出用于IS标签测定的依序成对探针连接化学作用的原理。
[0033] 图5a :表1显示来自IS标签的可能ID码的色码和相应的碱基组成的实例。图5b : 表2显示特定的碱基码。表3显示同义的碱基码。
[0034] 图6示出转移ID窗口以供依序成对探针连接的原理。
[0035] 图7图示系统的实例。
[0036] 图8图示使用多重核酸分析进行非侵入性癌症早期检测的实例。
[0037] 图9示出本发明的示范性实施方式。

【具体实施方式】
[0038] 本发明提供用于同时分析多个目标核酸序列的方法和系统，诸如用于发现和验证 以及临床诊断的多个生物标记检测。
[0039] A.由标识序列标签进行多重核酸分析
[0040] 在一个方面，本发明提供分析样品中的目标核酸序列的方法。
[0041] 如本文中所概述，在一些实施方式中，目标序列包含需要序列信息的位置，在本文 中通常称为"检测位置"或"检测位点"。在一个实施方式中，检测位置为单核苷酸，但是在 一些实施方式中，检测位置可包含多个核苷酸，既可彼此接近也可由一或更多个核苷酸分 离开来。如本文所用的"多个"表示至少两个。
[0042] 如本文所用，与杂合体中的检测位置碱基进行碱基配对的碱基称为"读出位置"或 "审视位置"；因此本发明的许多探针包含审视位置。在一些实施方式中，如本文中所概述， 目标序列可能不是样品目标序列而是扩增反应产物，在本文中有时称为"衍生"目标序列、 "模板分子"或扩增子。本文中，用"扩增子"表示核酸分子，所述核酸分子通过扩增方法生 成。通常，由PCR方法（包括多重PCR)进行扩增。扩增子可能为双链DNA分子或单链DNA 分子。如下所述，可使用能增加其中一链的扩增反应技术。
[0043] 在一个实施方式中，本发明的扩增子包括目标核酸序列。在另一个实施方式中，扩 增子含有核酸目标链和第二核酸目标链，所述核酸目标链由本文所述的方法扩增，所述核 酸目标链含有如下文所述的两个或两个以上目标域，所述第二核酸目标链与第一核酸链互 补。用"单链目标核酸"、"单链目标"、"单链目标序列"或所述术语语法上的等效物表示用 于本发明的扩增方法的起始材料。在另一个实施方式中，本发明的目标序列含有与探针序 列大体上互补的区域，如本文中所定义。
[0044] 包含目标序列的样品可实际上来自任意有机体和任意源，所述有机体和源包括但 不限于体液（包括但不限于，实际上任意有机体样品的血液、骨髓、尿、排泄物、泪液、血清、 淋巴液、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液、精液和其他体液，任意有机体诸如包括人类的哺乳 动物）；细菌和病菌（包括病毒）的细胞裂解物；硬组织（例如器官，诸如肝脏、脾脏、肾、心 脏、肺等）；环境样品（包括但不限于，空气样品、农业样品、水样品和土壤样品）；生物战剂 样品；研究样品（即，样品可为扩增反应产物，所述扩增反应包括诸如PCR扩增反应的目标 扩增和信号扩增，如通常在W099/037819中所描述，所述专利列为本文的参考文献）；纯化 样品，诸如纯化基因体DNA、RNA、蛋白质等；原样（细菌、病毒、基因体DNA等）；如将为本领 域技术人员所认知，可对样品进行任意实验操作。如果需要的话，那么使用已知的技术来制 备目标序列。例如，可使用已知的裂解液、电穿孔等，处理样品以溶解细胞，其中根据需要进 行纯化和/或扩增，如将为本领域技术人员所认识。
[0045] 在一个方面，本发明提供基因特异性预扩增的方法，将设定的IS标签和IS码嵌入 基于目标核酸序列所产生的扩增子。
[0046] 基因特异性预扩增已广泛用于核酸分析，诸如，基因分型、基因表达分析和临床诊 断中的样品制备。Li 等人，Nucleic Acids Res·，1996,24 :538-539 ;Mengual 等人，BMC Research Notes，2008 年 6 月，I :21 ;Xia 等人，Genet. Mol. Biol. ;2009 :20-24 ;Arneson 等人，Cold Spring Harb. Protoc, "Whole-Genome Amplification by Improved Primer Extension Preamplification PCR(I-PEP-PCR) "，2008 ;所有论文列为本文的参考文献。
[0047] 在一些实施方式中，本发明的方法包含：从样品中产生多个第一模板分子和多个 第二模板分子，第一模板分子包含第一目标核酸序列和第一标识序列（IS)标签，且第二模 板分子包含第二目标核酸序列和第二IS标签，并且第一 IS标签构成第一 ID码且第二IS 标签构成第二ID码。
[0048] 在一些实施方式中，使用引物，通过酶促反应产生第一和第二模板分子，所述引物 包含IS标签和序列，所述序列与目标核酸序列中的至少一部分互补，其中保留样品中的两 个目标核酸序列的数量比。
[0049] 本文中，用"标识序列（IS)标签"表示较短人造 DNA序列，所述较短人造 DNA序列 用于样品分析物间识别特定目标分子的编码。在一些实施方式中，IS的长度小于6个碱基 或小于10个碱基。IS标签还可包含额外的核酸序列，所述额外的核酸序列在解码处理期间 为探针杂交所需要。通常，将IS标签设计为不同于核酸分析中目标基因体序列。在一些实 施方式中，引入这些IS标签作为样品制备中的一部分。
[0050] 本文中，用"标识（ID)码"表示分配给IS标签的代码。每一个IS标签的碱基组 成对应于一个特定的ID码。
[0051] 在一些实施方式中，第一和第二目标核酸序列的丰度类似。在一些实施方式中，第 一目标核酸序列比第二目标核酸序列丰富至少100倍、1000倍或10, 〇〇〇倍。
[0052] 在一些实施方式中，本发明的方法包含：通过第一模板分子的克隆扩增产生第一 群组克隆扩增子，且通过第二模板分子的克隆扩增产生第二群组克隆扩增子，其中第一群 组克隆扩增子和第二群组克隆扩增子在空间上分离定位。
[0053] 本文中，用"克隆扩增子"或"扩增子克隆"表示扩增子群组，扩增子群组可直接或 间接地追溯到分离的多核苷酸。本文中，用"克隆扩增"表示分离且扩增多核苷酸以产生"扩 增子克隆"或"克隆扩增子"的方法。
[0054] 本文中，用"在空间上分离定位"表示两个或两个以上群组扩增子在空间上定位不 同。例如，不同群组扩增子可定位于相同表面上的不同点上、或定位于不同表面上，诸如本 文所述的不同微粒表面上。
[0055] 在一些实施方式中，通过酶促扩增或复制，在表面上产生第一和第二群组克隆扩 增子，其中在克隆扩增期间，用于扩增或复制的至少两个引物连接至表面且在空间上分离 开来。
[0056] 在一些实施方式中，多簇克隆扩增子接合至表面上。克隆扩增子直接或间接地连 接至表面。在一些实施方式中，克隆扩增子接合至磁性微粒的表面，且通过本文所述或本领 域已知的物理力（例如，磁场）或通过化学键结，在表面上固定磁性微粒。
[0057] 在一些实施方式中，识别所述克隆扩增子的IS标签的ID码，以判定由本文所述的 克隆扩增子代表的目标核酸序列。
[0058] 在一些实施方式中，通过分析克隆扩增子的所述群组序列状态，判断目标核酸序 列的相应序列状态。
[0059] 本文中，用"序列状态"表示序列特征，诸如单核苷酸多态、突变或甲基化。序列状 态可由本领域已知或本文中所公开的方法进行判断，方法包括但不限于标记探针连接、单 碱基延伸、DNA测序和熔解曲线分析。
[0060] 在一些实施方式中，本发明的方法进一步包含：通过累加含有同一 IS标签的克隆 扩增子群组数，定量来自每一个模板分子的克隆扩增子的簇组数量，根据已知的用于样品 制备中的稀释倍率，以推断样品中的每一个目标核酸序列的量。
[0061] 通常，单分子克隆扩增中的模板分子的随机分布遵循泊桑（Poisson)分布。C反应 腔室中的M模板分子的随机分布遵循泊桑分布。在给定反应腔室中具有至少一个模板分子 的概率表示为P，
[0062]

【权利要求】
1. 一种分析样品中的目标核酸序列的方法，所述方法包含： (a) 从样品中产生多个第一模板分子和多个第二模板分子，其中所述第一模板分子包 含第一目标核酸序列和第一标识序列（IS)标签，且所述第二模板分子包含第二目标核酸 序列和第二IS标签，并且其中所述第一 IS标签构成第一标识（ID)码且所述第二IS标签 构成第二ID码； (b) 利用克隆扩增所述第一模板分子以产生第一群组克隆扩增子，且利用克隆扩增所 述第二模板分子以产生第二群组克隆扩增子，其中所述第一群组克隆扩增子和所述第二群 组克隆扩增子在空间上分开定位；和 (c) 识别所述克隆扩增子的所述IS标签的所述ID码，以判断所述克隆扩增子代表的所 述目标核酸序列。
2. 如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包含：通过分析所述第一群组克隆扩增 子和所述第二群组克隆扩增子的序列状态，判断所述目标核酸序列的相应序列状态。
3. 如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包含：定量来自每一个模板分子的克隆 扩增子的群组数量，以推断所述样品中的每一个目标核酸序列的量。
4. 如权利要求3所述的方法，其中所述方法进一步包含定量所述样品中的所述参考序 列。
5. 如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包含：在表面上固定所述第一群组克隆 扩增子和第二群组克隆扩增子。
6. 如权利要求1所述的方法，其中所述第一目标核酸序列和第二目标核酸序列可为相 同的或可为不同的，且可以存在更多所述第一和第二目标核酸序列。
7. 如权利要求1所述的方法，其中所述目标核酸序列选自由以下组成的群组：基因体 DNA、cDNA 和 RNA。
8. 如权利要求1所述的方法，其中使用引物通过酶促反应，以产生所述第一模板分子 和第二模板分子，所述引物包含所述IS标签和序列，所述序列与所述目标核酸序列中的至 少一部分为互补，且其中维持所述样品中的所述两个目标核酸序列的数量比。
9. 如权利要求5所述的方法，其中通过酶促扩增或复制，在所述表面上产生所述第一 和第二群组克隆扩增子，其中在所述克隆扩增期间，用于所述扩增或复制的至少两个所述 引物是接合于所述表面且在空间上分开的。
10. 如权利要求1所述的方法，其中所述克隆扩增在多个水性液滴中进行，且每一个水 性液滴包含： DNA扩增试剂，所述DNA扩增试剂包括多个引物；和 微粒，其中至少一个所述引物是接合于所述微粒的表面上；和 所述模板分子。
11. 如权利要求10所述的方法，其中所述水性液滴由油包水型乳胶形成，且所述油包 水型乳胶置于反应容器中，其中所述反应容器含有与水不混溶的液体。
12. 如权利要求10所述的方法，其中在亲水反应点上进行模板分子的所述克隆扩增， 而所述亲水反应点在疏水表面上形成图案化，且其中每一个亲水反应点包含所述水性液 滴。
13. 如权利要求12所述的方法，其中所述亲水反应点由与水不混溶的液体覆盖，以在 所述克隆扩增期间防止水相蒸发且隔离各单个亲水反应点。
14. 如权利要求10所述的方法，其中所述DNA扩增是聚合酶链反应（PCR)。
15. 如权利要求1所述的方法，其中所述克隆扩增通过所述单链模板分子的环化由DNA 聚合酶在延伸寡核苷酸上进行后续的等温滚环扩增（RCA)，其中所述延伸寡核苷酸在5' 末端接合于表面上，且其3'末端处与所述环化模板分子互补，且所述延伸寡核苷酸包含用 于酶促延伸的自由3'端羟基。
16. 如权利要求15所述的方法，其中通过在所述延伸寡核苷酸上连接所述单链模板分 子的所述两个末端，进行所述模板分子的环化，所述模板分子含有特定的核酸序列，且所述 特定核酸序列为产生所述模板分子所用的引物序列中的一部分。
17. 如权利要求16所述的方法，其中对至少两个所述不同的模板分子来说，所述两个 末端处的所述特定的核酸序列为相同的或不同的。
18. 如权利要求14所述的方法，其中所述环化模板分子的长度介于40个碱基与400个 碱基之间。
19. 如权利要求10所述的方法，其中所述微粒为磁性微粒。
20. 如权利要求5所述的方法，其中所述克隆扩增子直接接合于磁性微粒的所述表面， 且通过物理力或通过化学键结，在所述表面上固定所述磁性微粒。
21. 如权利要求1所述的方法，其中通过标记探针的依序连接循环或通过DNA测序技 术，同时判断所述克隆扩增子的所述ID码，且所述每一群组克隆扩增子的ID码显示出每一 群组克隆扩增子所代表的所述目标核酸序列。
22. -种用于多重核酸分析的试剂盒，所述试剂盒包含： 酶促反应引物，其中一些所述引物包含标识序列（IS)标签；以及 标记探针库，其中所述标记探针库包含多个标记IS探针（LISP)。
23. 如权利要求22所述的试剂盒，其中每一个标记探针库包含两组LISP，一组为 3' -LISP，而另一组为5' -LISP，且每一组LISP包含的所有探针含有一个指定碱基审视位 置处。
24. 如权利要求22所述的试剂盒，其中在每一组LISP上存在四个不同的标记，每一个 标记代表所述审视位置处的一指定碱基（A、C、G、T)，且在每一个LISP库中包括所述审视位 置处所有可能碱基组合所需要的所有探针。
【文档编号】C12Q1/68GK104404134SQ201410568510
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2010年4月2日 优先权日:2009年4月3日
【发明者】蒂莫西·Z·刘 申请人:蒂莫西·Z·刘