一种酶活提高的天冬酰胺酶突变体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种酶活提高的天冬酰胺酶突变体，属于酶工程领域。本发明通过定点突变的方式，将天冬酰胺酶分子内部亲水性的氨基酸天冬酰胺、缬氨酸突变成疏水性强的酪氨酸、色氨酸、异亮氨酸，改变了分子内部疏水性，显著提高菌株表达天冬酰胺酶的酶活力，并将天冬酰胺酶酶活提高了2.57倍。改造后的菌株产酶能力显著提高，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。
【专利说明】一种酶活提高的天冬酰胺酶突变体
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酶活提高的天冬酰胺酶突变体，属于酶工程领域。
【背景技术】
[0002] L-天冬酰胺酶（EC3. 5. I. 1)是一种有抗癌活性的蛋白酶，能专一催化L-天冬酰胺 水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤 其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物， 对骨髓细胞没有抑制作用。
[0003] L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的 还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以 水解天冬酰胺，从源头上减少丙烯酰胺的生成。
[0004] -些微生物、哺乳动物及植物被证实含有L-天冬酰胺酶。因为动物血清中L-天 冬酰胺酶含量低，且提取工艺复杂，微生物具有易培养，成本低等优点，成为学者研究的重 点，目前研究的产L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia coli、Erwinia carotovora、 Erwinia chrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酰胺酶产量低，近年来利用基因工程技术将 L-天冬酰胺酶基因克隆到大肠杆菌中，获得L-天冬酰胺酶的高效表达，利用工程菌产L-天 冬酰胺酶已成为一个重要来源。
[0005] L-天冬酰胺酶有两种类型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II， Escherichiacoli、Erwinia chrysanthemi、B. subtilis 等均包含这两种 L-天冬醜胺 酶，研究证实仅L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，来自Escherichia coli和Erwinia chrysanthemi的L-天冬酰胺酶II已被开发为治疗急性淋巴细胞白血病的有效药物，目前 研究的大部分是具有抗肿瘤效果的L-天冬酰胺酶II。
[0006] 本发明通过定点突变改变蛋白质分子内部的疏水性，从而进一步提高天冬酰胺酶 酶活。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的问题是提供一种酶活力提高的天冬酰胺酶突变体，所述突变是 对氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的来源于枯草芽孢杆菌的天冬酰胺酶蛋白质内部氨基酸 进行定点突变，从而提高了天冬酰胺酶的活性。
[0008] 所述突变是将天冬酰胺酶第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸或色氨酸，得到 突变体N133Y、N133W ;或将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸，得到突变体V143I ;或在将143 位的缬氨酸突变为异亮氨酸的同时，将第133位的天冬酰胺分别突变为色氨酸或酪氨酸， 得到突变体 N133W/V143I、N133Y/V143I。
[0009] 天冬酰胺酶突变体 N133Y、N133W、V143I、N133W/V143I、N133Y/V143I 的氨基酸序 列分别如SEQ ID NO. 2-6所示。
[0010] 本发明解决的另一个技术问题是提供构建所述突变体的方法，是通过定点突变技 术将天冬酰胺酶蛋白质分子内部第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸、色氨酸；或将143 位的缬氨酸突变为异亮氨酸；或在将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸的同时，将第133位的 天冬酰胺分别突变为酪氨酸或色氨酸。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，将含有编码天冬酰胺酶的基因与载体PET22M+)连 接，转化大肠杆菌E. coli rosetta。挑选转化子接种到LB液体培养基中，37°C培养12h，转 接到TB培养基中，接种量为3%。菌体长到0D_为1. 5时，加入IPTG诱导，并将培养温度 降到30°C，培养24h。收集发酵上清，纯化获得天冬酰胺酶突变体。
[0012] 本发明还提供一株天冬酰胺酶分泌能力增强的大肠杆菌，是将含有编码天冬酰胺 酶的基因与表达载体连接后转化大肠杆菌。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，将含有编码天冬酰胺酶的基因与载体PET22M+)连 接，转化大肠杆菌E. colirosetta。
[0014] 本发明还提供一种提高天冬酰胺酶活力的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示的天冬酰胺酶蛋白质分子内部第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸、色氨酸；或将 143位的缬氨酸突变为异亮氨酸；或在将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸的同时，将第133 位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸或色氨酸。
[0015] 本发明通过定点突变的方式，将天冬酰胺酶分子内部亲水性的氨基酸天冬酰胺、 缬氨酸突变成疏水性强的酪氨酸、色氨酸、异亮氨酸，改变了分子内部疏水性，显著提高菌 株表达天冬酰胺酶的酶活力，并将天冬酰胺酶酶活提高了 2. 57倍。改造后的菌株产酶能力 显著提高，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1突变体酶活
【具体实施方式】
[0017] LB 培养基：胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaC110g/L，pH7. 0 ;
[0018] TB 培养基：蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，甘油 8g/L，17mmol/LKH2P04, 72mmol/ LK2HPO4。
[0019] 采用分光光度法测定天冬酰胺酶酶活，1个单位天冬酰胺酶酶活定义为：酶活 定义：在37°C反应条件下，每分钟内能催化L-天冬酰胺释放1 μ mol NH3所需要的酶量 为一个酶活单位（U/ml)。酶活测定条件：37°C条件下，ImllOmM K2HP04-KH2P04(PH7. 5)， 0. lmll89mM天冬酰胺，0. 3ml发酵上清液，保温30分钟，0. lmll.5MTCA终止反应。利用 ShimadzuUV-1240在436nm处测定吸光值，通过硫酸铵绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶 活。
[0020] 实施例1高效分泌天冬酰胺酶菌株构建
[0021] 以NdeI、BamHI为限制性内切酶酶切位点，对质粒pMA0911-wapA-SP_ansZ(片段） 及pET22b(+)质粒（载体）进行双酶切，利用胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收， 电泳检验回收产物的浓度。回收后的目的基因（wapA-SP-ansZ)与载体pET22b(+)进行 连接，连接体系：目的基因（wapA-SP-ansZ) 4 μ L，载体（pET22b (+)) 1 μ L，solutionI5 μ L， 16°C过夜连接。将连接好的重组质粒pET22b-wapA-SP/ansZ转化到感受态E. coil JM109， 转化氨苄青霉素 LB平板，挑取阳性菌落。如图1。37°C摇床过夜培养后提取质粒，命名为 pET22b-wapA-SP/ansZ，酶切验证正确后，转化子由上海生工进行测序。
[0022] WapA-SP-ansZ基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示。
[0023] 实施例2高分泌能力天冬酰胺酶生产菌株的验证
[0024] 将实施例1中测序正确的质粒，转化大肠杆菌E. coli rosetta。挑选转化子接种 到LB液体培养基中，37°C，培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3%。菌体长到0D_为 1. 5时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到30°C，培养24h。收集发酵上清，检测发酵上清酶 活，结果显示，天冬酰胺酶被分泌到胞外。酶活力为2. 68U/ml。
[0025] 实施例3高活性及热稳定突变株的获得
[0026] 利用定点突变试剂盒（TaKaRa)，设计3对引物（如表1示），以已构建的 pET22b-wapA-SP/ansZ为模版，进行PCR，将天冬酰胺酶分子内部133位的天冬酰胺分别突 变为酪氨酸、色氨酸，143位的缬氨酸突变为异亮氨酸，分别命名为N133Y、N133W、V143I。 PCR 反应条件为：95°C 5min，34 个循环（95°C 5min、60°C 30s、72°C 5min40s)，72°C lOmin。 PCR 扩增体系：模板 I μ L，上下游引物各 I μ L，dNTP Mix4y L，5XprimeSTAR BufferlOy L， 灭菌的双蒸水32. SyUprimeSTAR DNA聚合酶0.5 μ L。采用胶回收试剂盒对PCR产物 进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。转化子由上海生工进行测序，转化子命名为 pET-22b (+) -asp-N133Y、pET-22b (+) -asp-N133W、pET-22b (+) -asp-V143I。
[0027] 以测序正确的菌株pET-22b(+)-asp-V143I的质粒为模版，对天冬酰胺酶分子 内部133位的天冬酰胺进行复合突变，分别突变为酪氨酸、色氨酸，命名为V143I/N133Y、 V143I/N133W、转化子由上海生工进行测序，转化子命名为pET-22b (+) -asp-V143I/N133Y、 pET-22b(+)-asp-V143I/N133W。
[0028] 实施例4高产天冬酰胺酶生产菌株的验证
[0029] 将测序正确的质粒，转化E. coli Rosetta(DE3)，挑选转化子接种到LB液体培养 基中，37°C，培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3%。菌体长到0D_为1.5时，加入 IPTG诱导，并将培养温度降到30°C，培养24h。收集发酵上清，检测发酵上清酶活，结果如 图1所示。实验结果表明与出发菌株比较，酶活力均有显著提高，WT、N133Y、N133W、V143I、 N133Y/V143I、N133W/V143I 酶活力分别为 2· 68、4· 36、4· 51、3· 91、5· 33、6· 89U/ml 且复合突 变菌株pET-22b(+)-asp-V143I/N133Y胞外酶活提高到6.89U/ml，较出发菌株提高2.57倍。
[0030] 表1弓丨物序列
[0031]
【权利要求】
1. 一种酶活力提高的天冬酰胺酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的天冬 酰胺酶第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸或色氨酸；或将143位的缬氨酸突变为异亮 氨酸；或在将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸的同时，将第133位的天冬酰胺分别突变为色 氨酸或酪氨酸。
2. 根据权利要求1所述的天冬酰胺酶突变体，其特征在于，天冬酰胺酶突变体的氨基 酸序列分别如SEQ ID NO. 2-6所示。
3. -种获得权利要求1所述突变体的方法，是通过定点突变技术将天冬酰胺酶蛋白质 分子内部第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸、色氨酸；或将143位的缬氨酸突变为异亮 氨酸；或在将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸的同时，将第133位的天冬酰胺分别突变为酪 氨酸或色氨酸。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将含有编码天冬酰胺酶的基因与载体 pET22b(+)连接，转化大肠杆菌E. coli rosetta ;挑选转化子接种到LB液体培养基中，37°C 培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3% ;菌体长到0D6QQ为1.5时，加入IPTG诱导，并 将培养温度降到30°C，培养24h，收集发酵上清，纯化获得天冬酰胺酶突变体。
5. -种表达权利要求1所述天冬酰胺酶突变体的大肠杆菌，是将含有编码天冬酰胺酶 的基因与表达载体连接后转化大肠杆菌。
6. 根据权利要求5所述的大肠杆菌，其特征在于，将含有编码天冬酰胺酶的基因与载 体pET22b(+)连接，转化大肠杆菌E. coli rosetta。
7. 权利要求1所述天冬酰胺酶突变体的应用。
8. 权利要求5所述大肠杆菌的应用。
9. 一种提高天冬酰胺酶活力的方法，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 示的天冬酰胺酶蛋白质分子内部第133位的天冬酰胺分别突变为酪氨酸、色氨酸；或将143 位的缬氨酸突变为异亮氨酸；或在将143位的缬氨酸突变为异亮氨酸的同时，将第133位的 天冬酰胺分别突变为酪氨酸或色氨酸。
【文档编号】C12N9/82GK104371993SQ201410568323
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】刘松, 冯岳, 陈坚, 堵国成, 陈双全, 王广圣, 陈璇 申请人:江南大学