专利名称：5-氟-尿嘧啶免疫测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型抗体和5-FU的单克隆抗体。本发明的抗血清可以通过使用本发明的免疫原免疫宿主动物而常规产生。合适的宿主动物包括啮齿类，例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠等，或者较高等的哺乳动物，例如山羊、绵羊、马等。根据用于引发动物中的免疫反应的接受的规程，给以初始剂量、出血和加强注射，例如，在优选实施方式中，小鼠接受100μg免疫原/小鼠初始剂量，i.p.和随后两次或多次100μg免疫原/小鼠加强注射进行六个月以上。通过周期性的出血，利用常规的免疫测定观察免疫小鼠的血液样品以发展对抗5-FU的免疫反应。这些方法提供了筛选产生了具有需要活性的抗血清的宿主的方便方法。
根据上述计划接着给小鼠i.p.或i.v.注射100μg免疫原连续三天，在细胞融合三天前开始，通过免疫Balb/c小鼠方便地产生单克隆抗体。当然也可以利用抗体领域中公知的其它方法。本文中详细的完全免疫方法提供了用于5-FU抗体的血清抗体反应的最佳方法。
从宿主的脾脏、外周血液、淋巴结或其它组织获得的B淋巴细胞可以用作单克隆抗体产生细胞。最优选的是从脾脏得到的B淋巴细胞。通过将这种B淋巴细胞与无限增殖细胞系融合得到能产生本发明需要的单克隆抗体的杂交瘤，该无限增殖细胞系为在杂交细胞上给予长期组织培养稳定性的细胞系。在本发明优选的实施方式中，无限增殖细胞可以为类淋巴母细胞或者浆细胞瘤细胞如骨髓瘤细胞，其自身是抗体产生细胞而且是恶性的。产生5-FU单克隆抗体的鼠类杂交瘤是通过融合小鼠骨髓瘤细胞和来自免疫了抗5-FU蛋白质缀合物的小鼠的脾细胞而形成的。嵌合的和人源化的单克隆抗体可以通过克隆来自杂交瘤细胞的抗体表达基因并使用现在本领域公知的重组DNA方法将小鼠可变区连接到人恒定区或者将人框架区与来自供体小鼠或大鼠免疫球蛋白的互补决定区(CDR)组合来产生。实施鼠类单克隆抗体人源化的改进方法在国际专利申请WO92/11018中有阐述，其提供了增强亲和力的抗体。
可以产生仅含有部分初级抗体结构的多肽片段，该片段拥有一种或多种免疫球蛋白活性。这些多肽片段可以使用本领域公知的方法通过完整抗体的蛋白酶裂解来生产，或者使用定向诱变在含有抗体基因的表达载体中需要的位置插入终止密码子来产生Fab片段或(Fab′)2片段。单链抗体可以通过将VL和VH区域与DNA接头结合产生(见Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，855879-5883(1988)和Bird等人，Science，242423-426(1988))。
本发明的抗体对于5-FU是选择性的，并且与如尿嘧啶、胞嘧啶、喃氟啶等的嘧啶碱没有实质上的交叉反应性。没有实质上的交叉反应性意味着本发明的抗体相对于具有不超过12％优选不超过5％的这些代谢产物的5-FU具有交叉反应性。
免疫测定 根据本发明，由式II-A的这些化合物的免疫原产生的前述缀合物和抗体可以用作确定患者样品中5-FU的试剂。这种测定通过免疫测定进行。由式II-B的化合物形成的试剂缀合物与样品中的5-FU竞争本发明产生的抗体上的结合部位的任何免疫测定可以用于确定患者样品中5-FU的存在。在怀疑含有5-FU的样品中进行这种分析5-FU的方法包括组合(a)含水介质样品，(b)本发明产生的5-FU抗体和(c)由式II-A和II-B的化合物形成的缀合物。样品中5-FU的量可以通过测量结合添加到样品和抗体的混合物中的已知量的缀合物的特异抗体的抑制来确定。将通过未知样品抑制已知量缀合物的这种结合的结果与通过利用已知5-FU标准溶液的相同分析所得到的结果比较。在确定未知样品中5-FU的量时，可以以任何顺序添加样品、由式II-B的化合物形成的缀合物以及抗体。
可以采用各种方法来测量结合到抗体的、由式II-A和II-B的化合物形成的缀合物的量。一种方法是缀合物与抗体的结合引起了荧光基团缀合物旋转速率的降低。在液体混合物中荧光基团缀合物旋转速率的降低量可以通过荧光极化技术来检测，例如美国专利No.4,269,511和4,420,568所公开。
另一方面，抗体可以包被或吸收在纳米粒子上，使得这些粒子与由式II-A和II-B的化合物形成的5-FU缀合物反应时，这些纳米粒子形成聚集体。然而，当包被或吸收纳米粒子的抗体与样品中的5-FU反应时，来自结合到这些纳米粒子的样品的5-FU不产生抗体纳米粒子的聚集。通过吸收率在分析混合物中可以测量聚集或凝聚的量。
另一方面，可以通过将抗体或者5-FU缀合物附着到如微量滴定板的固相载体或者任何其它包括固体粒子的常规固相载体上来进行这些分析。将抗体和蛋白附着到这种固体粒子上是本领域公知的。可以利用任何常规方法来进行这种附着。在许多情况下，为了有助于测量，可以将标记放置在抗体、缀合物或者固体粒子上，所述标记例如放射性标记或酶标记，作为检测与抗体结合或未结合的由式II-B的化合物形成的缀合物的量的助剂。其它合适的标记包括发色团、荧光基团等。
为方便起见，本发明的分析组分可以提供在试剂盒中，与预定量的用于分析5-FU的新试剂包装组合。这些试剂包括本发明的抗体，还有由式II-A和II-B的化合物形成的缀合物。
除了这些必需的试剂，可以包括添加剂如辅助试剂，例如稳定剂、缓冲剂等。各种试剂的相对量可以广泛变化，以提供基本上使分析敏感性最佳化的试剂在溶液中的浓度。试剂可以在溶液中或者作为干粉，通常是冻干的，该试剂包括赋形剂，其在溶解时提供具有进行分析的合适浓度的试剂溶液。
实施例 在实施例中，指定使用下列缩写 THF四氢呋喃 EA乙醇 DCM二氯甲烷 DMAP二甲氨基吡啶 NHS N-羟基-琥珀酰亚胺 EDC盐酸1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺 TLC薄层色谱 ANS 8-苯胺基-1-萘磺酸 i.p.腹膜内 HRP辣根过氧化物酶 TMB 3，3′,5，5′-四甲基联苯胺 TRIS盐酸三(羟甲基)氨基甲烷 BSA牛血清白蛋白 BTG牛甲状腺球蛋白 PBS磷酸盐缓冲盐水 di去离子水 在实施例中，方案1，方案2，方案3a、3b和方案4，下面阐述制备的特定化合物，并通过实施例中的编号表示。方案如下 方案1
方案2
方案3a
方案3b
方案4
实施例1 方案1，制备1-取代的5-FU活化酯[4] 在30℃下搅拌中向DMF(100mL)中的氟尿嘧啶(50g)[1]溶液中加入三乙胺(78g)。然后滴加乙基-4-溴丁酸酯(88.5g)。滴加完成后，将所得到的反应混合物在室温下搅拌48小时。过滤反应混合物，并在减压下除去溶剂。将残留物在乙酸乙酯中结晶，提供了26g(29％)的化合物[2]。
向甲醇(100mL)中[2]的溶液(20g)中加入20％的氢氧化钾水溶液(27mL)。所得溶液在室温下搅拌3小时，然后在减压下浓缩该混合物。将残留物溶解在丙酮(50-100mL)中，并用浓HCl调节到pH为2-3。接着过滤，用丙酮洗涤。通过加热将固体产物溶解在丙酮(50mL)中。冷却至室温后，通过添加乙酸乙酯(100mL)将固体沉淀出来。通过过滤收集固体产物，接着干燥得到约10g的[3]。用于酯的TLC条件是乙酸乙酯∶醚(3∶1)。用于酸的TLC条件是氯仿∶甲醇(15∶1)，2滴乙酸。
在0℃下向600mL的二氯甲烷中6.3g的化合物[3]中加入NHS。再向这种溶液中滴加于二氯甲烷中的DCC(4.8g)。在0℃下搅拌2小时，将得到的反应混合物在室温下搅拌15小时。将反应混合物浓缩。在丙酮中结晶残留物得到粗产物。在二氧化硅凝胶柱(用乙酸乙酯∶醚为3∶1来洗脱)上提纯该粗产物，得到4g化合物[4]。
实施例2 方案2，制备1-取代的5-FU酸[5] 向乙腈(300mL)中化合物[4](3.2g)的溶液中添加水(900mL)，接着加入1.2 e.q.的对甲氨基苯甲酸。将所得反应混合物在室温下搅拌20小时。在减压下浓缩该混合物，除去乙腈。形成沉淀并通过过滤收集。然后在丙酮中结晶得到2.8g粗产物。将该粗产物在二氧化硅凝胶柱(用氯仿∶甲醇为15∶1洗脱，1-2滴乙酸)上提纯，得到2g化合物[5]。
实施例3a 方案3a，制备3-取代的5-FU酸衍生物[12]，[14] 在40℃下在设有冷凝器、温度计和滴液漏斗的三颈烧瓶中搅拌80mL的POCl3中15.6g的5-FU[1]的混合物。在滴加了25mL的N，N-二甲基苯胺后，将所得混合物加热回流3小时。在减压下蒸发过量的POCl3。将混合物冷却至室温，并倒入75g的碎冰中。然后用氯仿(50mL三次)萃取。用水洗涤组合的萃取物，用MgSO4干燥，并浓缩，得到约50％产率的浅黄色固体化合物[7]。
在45℃下搅拌在48mL的2N NaOH溶液中16g的氯氧化物[7]的混合物1小时。反应混合物的pH降低到7。再加入48mL 2N NaOH溶液，并持续搅拌至在反应混合物中不再观察到油性物质。将混合物冷却至室温后，用浓HCl调节pH至pH为3。冷却，产物[8]沉淀出来。收集化合物氯氧化物[8]，用水洗涤，直到洗涤溶液变成中性。产率约55％。
向装有冷凝器、温度计和dean stark装置的三颈烧瓶中加入20mL甲苯、52mL苯甲醇和2.44g固体NaOH。将所得混合物回流至变干。然后，加入3g化合物[8]，并持续回流3小时。将反应混合物冷却至室温后，加入50mL水。用水洗涤有机相两次(每次50mL)。将水相组合起来，在减压下除去甲苯和苯甲醇的残留物。用浓HCl调节溶液pH为3，冷却下来，形成沉淀，收集该沉淀。在乙醇中再次结晶，得到约60％产率的化合物[9]。
将20mL苯、20mL水和0.5g四丁基溴化铵的混合物加热至55℃后，将溶液A(在20mL 1N NaOH水溶液中2g的[9])和溶液B(在20mL苯中1.9g的乙基-4-溴丁酸酯)以交替滴加方式加入该混合物中。反应混合物的pH控制在8-10。滴加完之后，将反应混合物回流2个半小时。分离有机相，用5％NaOH和水洗涤，用MgSO4干燥。减压下除去有机溶剂。在硅胶凝胶柱(用醚和乙酸乙酯为10∶1洗脱)上提纯残留物，得到约40％产率的油状产物的化合物[10]。
将50mL甲醇中3g化合物[10]，0.3g 10％Pd/C的混合物在氢气(15psi)下搅拌约24小时。通过过滤除去催化剂。向含有[10]的滤液中加入2g NaOH和50mL水。所得混合物在室温下搅拌8小时。在减压下除去甲醇。用浓HCl调节混合物的pH至3。冷却后，形成沉淀，通过过滤收集。将该沉淀从乙醇中再结晶，得到约50％产率的[12]。
在室温下将50mL氯仿中的1g干燥的[12]、0.74g NHS、1.47g DDC的混合物搅拌过夜(约24小时)。在减压下除去溶剂，在硅胶凝胶柱(用乙酸乙酯和甲醇10∶1来洗脱)上提纯残留物，得到约40％产率的化合物[13]。
在室温下将30mL DMF中1g化合物[13]，0.5g 4-(氨甲基)-苯甲酸的混合物搅拌8小时。向反应混合物中加入150mL水。用100mL乙酸乙酯洗涤所得到的混合物。使水相在4℃下静置，通过过滤收集缓慢从溶液中沉淀出来的产物[14]，在P2O5的存在下在室温真空下干燥，得到产率约65％的[14]。
实施例3b 方案3b，制备3-取代的5-FU酸衍生物[6] 将20mL苯、20mL水和0.5g四丁基溴化铵的混合物加热至55℃后，向该混合物中同时加入溶液A(20mL 1N NaOH水溶液中2g[9])和溶液B(20mL苯中2.05g 4-溴丁酸乙酯)。将反应混合物的pH控制在8-10。添加完之后，将反应混合物回流两个半小时。分离有机相，用5％NaOH和水洗涤，并用MgSO4干燥。在减压下除去有机溶剂。在硅胶凝胶柱(用醚和乙酸乙酯10∶1洗脱)上提纯残留物，得到约38％产率的油状产物的化合物[15]。
将60mL甲醇中2g化合物[15]，0.2g 10％Pd/C的混合物在氢气(15psi)下搅拌约24小时。通过过滤除去催化剂。将含有化合物[16]的滤液浓缩至约20mL，然后加入1g NaOH和20mL水。所得混合物在室温下搅拌8小时。在减压下除去甲醇，并用浓HCl调节混合物的pH为3。冷却后，形成沉淀，通过过滤收集。将该沉淀从乙醇中再结晶，得到约60％产率的[6]。
实施例4 从相应的酸[3，5，12，14，6]制备NHS活化酯的一般方法 向搅拌的20mL干燥的CH2Cl2中NHS(1.39mmol)溶液中加入酸(0.695mmol)[3，5，12，14，6]和EDC(2.085mmol)。在氮气气氛下在室温搅拌该溶液18小时。通过添加3mL盐酸(0.3N)将该反应终止，再搅拌5分钟。分离有机层、干燥(Na2SO4)、过滤并蒸发(真空下)，产生白色固体。
实施例5 制备1-取代的5-FU KLH免疫原 向50mM磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.5)中5.86mL KLH(31.2mg/mL)中滴加实施例1中制备的0.692mL化合物[4](在DMSO中12.8mg/mL)，调节pH为8.5。在室温下使混合物搅拌18小时。然后，通过渗析提纯该免疫原性缀合物，并根据以前所描述的过程表征(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.Forensic Sci.pp 821-826，1998)。
实施例6a 制备3-取代的5-FU BTG免疫原 向50mM磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.5)中11.4mL BTG(16.9mg/mL)中滴加1.2mL DMSO，检验pH为7.5。向其中滴加实施例3a制备的0.227mL化合物[13](在DMSO中52.5mg/mL)，并再次检验pH为7.5。在室温下使混合物搅拌18小时。然后，通过渗析提纯该免疫原性缀合物，并根据以前所描述的过程表征(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.Forensic Sci.pp 821-826，1998)。
实施例6b 制备3-取代的5-FU KLH免疫原 向50mM磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.5)中8.3mL KLH(24.9mg/mL)中滴加0.922mL DMSO，检验pH为7.5。向其中滴加实施例3a制备的0.227mL化合物[13](在DMSO中52.6mg/mL)，并再次检验pH为7.5。在室温下使混合物搅拌18小时。然后，通过渗析提纯该免疫原性缀合物，并根据以前所描述的过程表征(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.Forensic Sci.pp 821-826，1998)。
实施例7a 制备具有衍生物12的3-取代的5-FU BSA缀合物(10∶1比例) 向50mM磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.5)中BSA(50mg/mL)的1mL溶液中滴加0.111mL DMSO。滴加实施例4制备的化合物[12](在DMSO溶液中0.045mL 52.5mg/mL)的活化N-羟基琥珀酰亚胺酯。在室温下使混合物搅拌过夜，产生3-取代的5-FU与BSA的缀合物。然后，通过渗析提纯该缀合物，并根据以前所描述的过程表征(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1 997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.ForensicSci.pp 821-826，1998)。
实施例7b 制备具有衍生物6的3-取代的5-FU BSA缀合物(1∶1比例) 向50mM磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.5)中20mL BSA(50.0mg/mL)中滴加2.222mL DMSO，并检验pH为7.5。向其中滴加0.272mL实施例4制备的化合物[6](在DMSO溶液中20.0mg/mL)的活化N-羟基琥珀酰亚胺酯，再次检验pH为7.5。在室温下使混合物搅拌18小时。然后，通过渗析提纯该免疫原性缀合物，并根据以前所描述的过程表征(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.Forensic Sci.pp 821-826，1998)。
实施例8 制备具有衍生物5的1-取代的5-FU BSA缀合物(20∶1比例) 向冰浴中的50mM磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.5)中BSA(50mg/mL)的14mL溶液中滴加14mL DMSO。滴加实施例4制备的化合物[5](在DMSO溶液中1.65mL 57mg/mL)的活化N-羟基琥珀酰亚胺酯。在室温下使混合物搅拌过夜，产生1-取代的5-FU与BSA的缀合物。然后，通过渗析提纯该缀合物，并根据以前所描述的过程表征(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1 997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1 997，Salamone等人，J.ForensicSci.pp 821-826，1998)。
实施例9 制备5-FU抗体 给10只雌性BALB/c系小鼠以100μg/小鼠i.p.免疫在完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant)中乳化的实施例5制备的5-FU-KLH或实施例6a制备的5-FU-BTG。在用以100μg/小鼠在不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund’s Adjuvant)中乳化的相同免疫原初次注射后四星期，给小鼠加强一次。加强试验后10天通过眼窝放血获得从每只小鼠放出的血。在实施例12a、13和14中评价来自这些含有5-FU抗体的试验放血的抗血清。对于单克隆抗体，给10雌性BALB/c小鼠i.p.免疫在完全弗氏佐剂中乳化的实施例6a制备的3-取代的5-FU-KLH 100μg/小鼠。在用100μg/小鼠的在不完全弗氏佐剂中乳化的相同免疫原初次注射后四星期，给小鼠加强一次。加强试验后10天通过眼窝放血获得从每只小鼠放出的血并将这些在实施例12a和15中筛查。为了融合前(第0天)4天开始制备单克隆抗体，给小鼠i.p.注射400μg(第3天)、200μg(第2天)和200μg(第1天)的PBS中的3-取代的5-FU-KLH免疫原连续3天。从挑选的小鼠分离脾细胞，并根据Coligan，J.E.等人，eds.，Current Protocols in Immunology，2.5.1-2.5.8，(1992)，Wiley & Sons，NY的方法，用具有50％聚乙二醇1500的2×107SP2/0细胞融合。将融合的细胞铺板在用20％FetalClone I、2％L-谷氨酰胺(100mM)和2％50X HAT补充的DMEM/F12中的10个96孔板上。两周后，通过ELISA分析杂交瘤上清抗-5-FU的存在(实施例12b)。阳性孔扩大，再次以相同的方法筛查。通过竞争ELISA(实施例12a和15)证实了5-FU结合的阳性克隆。根据Coligan，J.E.等人，eds.，Current Protocols in Immunology，2.5.8-2.5.17，(1992)，Wiley &Sons，NY.中公开的方法，通过有限稀释将由ELISA鉴定的阳性克隆亚克隆一次或两次。
实施例10 用5-FU衍生物5-BSA缀合物的微量滴定板敏化过程 在为蛋白质结合而优化的且每板含有96孔的聚苯乙烯微量滴定板(Nunc MaxiSorp C8或F8 Immunomodules)中进行测量5-FU浓度的ELISA方法。通过添加在0.05M pH＝9.6的碳酸氢钠中10μg/mL的300μL 5-FU-BSA缀合物并在室温下温育3小时，用5-FU-BSA缀合物(实施例8所制备)包被每个孔。用0.05M pH＝9.6的碳酸氢钠洗涤孔，接着在室温下用400μL5％的蔗糖、0.2％酪蛋白酸钠溶液阻断30分钟。除去包被后(post-coat)溶液后，在板在37℃下干燥过夜。
实施例11a 用5-FU衍生物12-BSA缀合物的微量滴定板敏化过程 在为蛋白质结合而优化的且每板含有96孔的聚苯乙烯微量滴定板(Nunc MaxiSorp C8或F8 Immunomodules)中进行测量5-FU浓度的ELISA方法。通过添加在0.05M pH＝9.6的碳酸氢钠中10μg/mL的300μL5-FU-BSA缀合物并在室温下温育3小时，用5-FU-BSA缀合物(实施例7a所制备)包被每个孔。用0.05M pH＝9.6的碳酸氢钠洗涤孔，接着在室温下用400μL 5％的蔗糖、0.2％酪蛋白酸钠溶液阻断30分钟。除去包被后溶液后，在板在37℃下干燥过夜。
实施例11b 用5-FU衍生物6-BSA缀合物的微量滴定板敏化过程 在为蛋白质结合而优化的且每板含有96孔的聚苯乙烯微量滴定板(Nunc MaxiSorp C8或F8 Immunomodules)中进行测量5-FU浓度的ELISA方法。通过添加在0.05M pH＝9.6的碳酸氢钠中10μg/mL的300μL 5-FU-BSA缀合物并在室温下温育3小时，用5-FU-BSA缀合物(实施例7b所制备)包被每个孔。用0.05M pH＝9.6的碳酸氢钠洗涤孔，接着在室温下用375μL 5％的蔗糖、0.2％酪蛋白酸钠溶液阻断30分钟。除去包被后溶液后，在板在37℃下干燥过夜。
实施例12a 抗体筛查过程-滴定 使用由实施例7a、7b和8所描述的5-FU-BSA敏化的微量滴定板进行筛查5-FU抗体(在实施例9中制备)的ELISA方法。通过将含有5-FU抗体的抗血清在含有0.1％BSA和0.01％硫柳汞的磷酸盐缓冲盐水中稀释为1∶100、1∶1000、1∶10000和1∶100000进行抗体筛查实验。向每个5-FU-BSA敏化的孔(实施例11 a、11b和10所制备)中添加100μL稀释的抗体，并在室温下摇动温育10分钟。在此温育过程中，抗体结合到孔中的5-FU-缀合物。用0.02M TRIS、0.9％NaCl、0.5％Tween-80和0.00 1％硫柳汞，pH 7.8洗涤板孔三次，除去任何未结合的抗体。为了检测孔中结合到5-FU-BSA缀合物的5-FU抗体的量，将用0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞在PBS中稀释1/2000的、能特异结合鼠类免疫球蛋白并且当用底物温育时可以产生有色产物的100μL的山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物(Jackson Immunoresearch)添加到各孔中。在室温下摇动温育10分钟后，在该期间山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物在孔中结合5-FU抗体，再洗涤该板三次以除去未结合的山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物。为了显出孔中的可测颜色，洗涤后接着添加100μL用于HRP的底物TMB(TMB Liquid Substrate，Sigma或BioFx)，以在室温下摇动温育10分钟显色。显色温育后，向各孔中添加50μL终止液(在去离子水中1.5％的氟化钠)，以终止显色，摇动10秒后测定650nm时的吸光度(Molecular Devices Plate Reader)。孔中抗体的量与所测的吸光度是成比例的，并表示为产生吸光度为1.5的稀释度(滴度)。通过画出所测抗体(x轴)的对数抗体稀释度与650nm的吸光度(y轴)的图，并推知吸光度为1.5时的滴度。该滴度确定了用于实施例13、14和15描述的间接竞争微量滴定板分析的抗体浓度(稀释度)。
实施例12b 抗体筛查过程-单克隆筛查 使用由实施例7b所描述的5-FU-BSA敏化的微量滴定板进行筛查5-FU单克隆抗体(在实施例9中制备)的ELISA方法。向每个5-FU-BSA敏化的孔(实施例11b所制备)中添加含有0.1％BSA和0.01％硫柳汞的磷酸盐缓冲盐水50μL，并接着添加50μL单克隆培养物上清液，在室温下摇动温育10分钟。在此温育过程中，抗体结合孔中的5-FU-缀合物。用0.02M TRIS、0.9％NaCl、0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞，pH7.8洗涤板孔三次，除去任何未结合的抗体。为了检测孔中结合5-FU-BSA缀合物的5-FU抗体的量，将用0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞在PBS中稀释为预定的比活性(约1/2000)的、能特异结合鼠类免疫球蛋白并且当用底物温育时产生有色产物的100μL的山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物(Jackson Immunoresearch)添加到各孔中。在室温下摇动温育10分钟后，在该期间山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物在孔中结合5-FU抗体，再洗涤该板三次以除去未结合的山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物。为了显出孔中的可测颜色，洗涤后接着添加100μL用于HRP的底物TMB(TMB Liquid Substrate，Sigma或BioFx)，以在室温下摇动温育10分钟时显色。显色温育后，向各孔中添加50μL终止液(在去离子水中1.5％的氟化钠)，以终止显色，摇动10秒后测定650nm(Molecular Devices Plate Reader)时的吸光度。孔中抗体的量与所测的吸光度是成比例的。具有大于两倍背景的吸光度的样品指定为阳性。
实施例13 测定IC50以及抗体与5-FU衍生物4缀合物的交叉反应性的间接竞争微量滴定板免疫测定过程 使用由实施例7a描述的5-FU-BSA敏化的微量滴定板进行测量5-FU浓度的ELISA方法。将5-FU、尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶和喃氟啶在PBS中稀释10倍浓度范围为0.01-10000ng/mL。通过温育50μL的分析物进行分析，用稀释为实施例12a中测定的滴度的50μL抗体(用实施例5的免疫原在实施例9中制备)测量。在10分钟的温育过程中(室温下，摇动)，存在抗体竞争结合孔中5-FU缀合物和溶液中的分析物。这种温育后，用0.02M TRIS、0.9％NaCl、0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞，pH7.8洗涤板孔三次，除去任何未结合的物质。为了检测孔中结合到5-FU-BSA缀合物的5-FU抗体的量，将用0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞在PBS中稀释1/2000、能特异结合鼠类免疫球蛋白并且当用底物温育时产生有色产物的100μL的山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物(Jackson Immunoresearch)添加到各孔中。在室温下摇动温育10分钟后，在该期间山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物在孔中结合5-FU抗体，再洗涤该板三次以除去未结合的第二缀合物。为了显出孔中的可测颜色，洗涤后接着添加100μL用于HRP的底物TMB(TMB LiquidSubstrate，Sigma或BioFx)，以在室温下摇动温育10分钟显色。显色温育后，向各孔中添加50μL终止液(在去离子水中1.5％的氟化钠)，以终止显色，摇动10秒后测定650nm(Molecular Devices Plate Reader)时的吸光度。孔中抗体的量与所测的吸光度是成比例的，且与样品中5-FU的量成反比。将含有分析物的孔中颜色的吸光度与没有分析物的比较，产生标准曲线。给定分析物的IC50值定义为要求抑制不含有分析物的孔的50％的吸光度的分析物的浓度。将给定分析物的交叉反应性计算为表达成百分比的5-FU的IC50与尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶和喃氟啶的IC50的比例。当用实施例5的免疫原在实施例9中产生的抗体测量时，相对于5-FU，尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶的百分比交叉反应性小于7％，喃氟啶为200％。结果列于表I中。
实施例14 测定抗体与5-FU衍生物13缀合物的IC50和交叉反应性的间接竞争微量滴定板免疫测定过程 使用由实施例8描述的5-FU-BSA敏化的微量滴定板进行测量5-FU浓度的ELISA方法。将5-FU、尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶和喃氟啶在PBS中稀释10倍浓度范围为0.01-10000ng/mL。通过温育50μL的分析物进行分析，用稀释为实施例12a中测定的滴度的50μL抗体(在实施例9中制备)测量。在10分钟的温育过程中(室温下，摇动)，在孔中抗体竞争结合5-FU缀合物和溶液中的分析物。这种温育后，用0.02M TRIS、0.9％NaCl、0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞，pH 7.8洗涤板孔三次，除去任何未结合的物质。为了检测孔中结合5-FU-BSA缀合物的5-FU抗体的量，将用0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞在PBS中稀释1/2000、能特异结合鼠类免疫球蛋白并且当用底物温育时产生有色产物的100μL的山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物(JacksonImmunoresearch)添加到各孔中。在室温下摇动温育10分钟后，在该期间山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物在孔中结合5-FU抗体，再洗涤该板三次以除去未结合的第二缀合物。为了显出孔中的可测颜色，接着添加100μL用于HRP的底物TMB(TMB Liquid Substrate，Sigma或BioFx)，以在室温下摇动温育10分钟显色。显色温育后，向各孔中添加50μL终止液(在去离子水中1.5％的氟化钠)，以终止显色，摇动10秒后测定650nm(Molecular Devices PlateReader)时的吸光度。孔中抗体的量与所测的吸光度是成比例的，且与样品中5-FU的量成反比。将含有分析物的孔中颜色的吸光度与没有分析物的比较，产生标准曲线。给定分析物的IC50值定义为要求抑制不含有分析物的孔的50％的吸光度的分析物的浓度。将给定分析物的交叉反应性计算为表达成百分比的5-FU的IC50与尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶和喃氟啶的IC50比例。当用实施例6a的免疫原在实施例9中产生的抗体测量时，相对于5-FU，尿嘧啶的百分比交叉反应性小于8％，胞嘧啶的小于0.03％，喃氟啶的小于1％且胸腺嘧啶约12％。结果列于表I中。
实施例15 测定抗体与5-FU衍生物13缀合物的IC50和交叉反应性的间接竞争微量滴定板免疫测定过程 使用由实施例7b描述的5-FU-BSA敏化的微量滴定板进行测量5-FU浓度的ELISA方法。取决于样品，将5-FU、尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶和喃氟啶在PBS中稀释10倍浓度范围为0.1-1000000ng/mL。通过温育50μL的分析物进行分析，用稀释为实施例12a中测定的滴度的50μL抗体(在实施例9中制备)测量。在10分钟的温育过程中(室温下，摇动)，在孔中抗体竞争结合5-FU缀合物和溶液中的分析物。这种温育后，用0.02M TRIS、0.9％NaCl、0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞，pH7.8洗涤板孔三次，除去任何未结合的物质。为了检测孔中结合5-FU-BSA缀合物的5-FU抗体的量，将用0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞在PBS中稀释为预定的比活性(约1/2000)、能特异结合鼠类免疫球蛋白当且用底物温育时产生有色产物的100μL的山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物(Jackson Immunoresearch)添加到各孔中。在室温下摇动温育10分钟后，在该期间山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物在孔中结合5-FU抗体，再洗涤该板三次以除去未结合的第二缀合物。为了显出孔中的可测颜色，洗涤后接着添加100μL用于HRP的底物TMB(TMB Liquid Substrate，Sigma或BioFx)，以在室温下摇动温育10分钟显色。显色温育后，向各孔中添加50μL终止液(在去离子水中1.5％的氟化钠)，以终止显色，摇动10秒后测定650nm(Molecular Devices Plate Reader)时的吸光度。孔中抗体的量与所测的吸光度是成比例的，且与样品中5-FU的量成反比。将含有分析物的孔中颜色的吸光度与没有分析物的作比较，产生标准曲线。给定分析物的IC50值定义为要求抑制不含有分析物的孔的50％的吸光度的分析物的浓度。将给定分析物的交叉反应性计算为表达成百分比的5-FU的IC50与尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶和喃氟啶的IC50比例。当用实施例6b的免疫原在实施例9中产生的单克隆抗体测量时，相对于5-FU，尿嘧啶的百分比交叉反应性小于8％，胞嘧啶的小于0.01％，喃氟啶的约为1％且胸腺嘧啶小于4％。结果列于表II中。
表1使用多克隆抗体具有相关化合物的5-氟尿嘧啶免疫测定的交叉反应性 表2用3-取代的-5-FU化合物-BSA缀合物(实施例7b)包被的平板使用3-取代的-KLH(实施例6b)的单克隆抗体的5-氟尿嘧啶免疫测定的交叉反应性 这些表中的结果证明由式II-A的化合物形成免疫原以及由式II-A或II-B的化合物形成的试剂的重要性。从这些结果可以看出，当免疫原是由式II-A而不是由II-B形成时，产生不与喃氟啶交叉反应的抗体。是通过由式II-A化合物的免疫原提供的抗体以及由II-A或II-B的化合物提供的试剂载体产生了准确的5-FU免疫测定，以监控用5-FU治疗的患者。
权利要求
1.一种检测样品中5-氟-尿嘧啶的免疫测定，该免疫测定包括提供以下混合物，a)样品，b)基本上不与喃氟啶交叉反应的、与5-氟-尿嘧啶选择性反应的抗体，和c)载体与式II-B的化合物、或式II-A的化合物或者它们的混合物的缀合物；使样品中的5-氟-尿嘧啶和所述缀合物与所述抗体结合以及随后测量在所述结合或未结合所述抗体的混合物中所述缀合物的量，由此可以测定样品中5-氟-尿嘧啶的存在，
其中，Y为有机间隔基团；
X为能结合到所述载体的末端官能团；并且p为0-1的整数；
其中X、Y和p与上述相同。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品为人样品。
3.根据权利要求2所述的免疫测定，其中所述抗体由含有免疫原性载体的免疫原产生，所述免疫原性载体含有与下式化合物缀合的多胺聚合物
其中p、X和Y与上述相同。
4.根据权利要求2所述的免疫测定，其中所述抗体结合到固体载体上。
5.根据权利要求4所述的免疫测定，其中所述固体载体为微量滴定板。
6.根据权利要求4所述的免疫测定，其中所述固体载体为纳米粒子。
7.一种选择性地结合到5-氟-尿嘧啶且基本上不结合到喃氟啶的抗体。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的抗体，其中所述抗体衍生自小鼠、兔子或大鼠。
10.根据权利要求9所述的抗体，其中所述抗体与尿嘧啶和胞嘧啶基本上不交叉反应。
11.根据权利要求7所述的抗体，其中，所述抗体衍生自免疫原性载体，所述免疫原性载体含有缀合到下式化合物的多胺聚合物
其中，Y为有机间隔基团；
X为能结合多胺聚合物的末端官能团；并且
p为0-1的整数。
12.根据权利要求11所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
13.根据权利要求11所述的抗体，其中所述抗体衍生自小鼠、兔子或大鼠。
14.根据权利要求13所述的抗体，其中所述抗体与尿嘧啶和胞嘧啶基本上不交叉反应。
15.一种下式的化合物
其中，Y为有机间隔基团；
X为能结合载体的末端官能团；并且
p为0-1的整数。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中p为0。
17.根据权利要求16所述的化合物，其中X为
-N＝C＝R4或
其中R3为氢或者与它的附着氧原子一起形成反应性酯，且R4为氧或硫。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中X为
且R3为氢。
19.根据权利要求17所述的化合物，其中X为
且R3形成反应性酯。
20.根据权利要求19所述的化合物，其中所形成的酯为低级烷基酯、亚氨酸酯或者氨基酯。
21.根据权利要求15所述的化合物，其中p是1。
22.根据权利要求21所述的化合物，其中Y为含有1-10个碳原子的亚烷基，
-NH-(CH2)m-或者
其中，n和o为0-6的整数，m为1-6的整数。
23.一种下式的化合物或其混合物
其中，Y为有机间隔基团；
X为能结合载体的末端官能团；并且p为0-1的整数。
24.根据权利要求23所述的化合物，其中p为0。
25.根据权利要求24所述的化合物，其中X为
-N＝C＝R4或
其中R3为氢或者与它的附着氧原子一起形成反应性酯，且R4为氧或硫。
26.根据权利要求25所述的化合物，其中X为
且R3为氢。
27.根据权利要求26所述的化合物，其中X为
且R3形成反应性酯。
28.根据权利要求27所述的化合物，其中所形成的酯为低级烷基酯、亚氨酸酯或者氨基酯。
29.根据权利要求23所述的化合物，其中p为1。
30.根据权利要求29所述的化合物，其中X为
-N＝C＝R4或
其中R3为氢或者与它的附着氧原子一起形成反应性酯，且R4为氧或硫。
31.根据权利要求30所述的化合物，其中Y为含有1-10个碳原子的亚烷基，
-NH-(CH2)m-或者
其中，n和o为0-6的整数，m为1-6的整数。
32.一种载体与下式化合物的缀合物
其中，Y为有机间隔基团；
X为能结合载体的末端官能团；并且
p为0-1的整数。
33.根据权利要求32所述的缀合物，其中p为0。
34.根据权利要求33所述的缀合物，其中X为
-N＝C＝R4或
其中R3为氢或者与它的附着氧原子一起形成反应性酯，且R4为氧或硫。
35.根据权利要求32所述的缀合物，其中p为1且Y为含有1-10个碳原子的亚烷基，
-NH-(CH2)m-或者
其中n和o为0-6的整数，m为1-6的整数。
36.根据权利要求35所述的缀合物，其中所述载体含有由
或
连接的一个或多个氨基，其中R4为氧或硫。
37.一种载体与下式化合物的缀合物
其中，Y为有机间隔基团；
X为能结合载体的末端官能团；并且
p为0-1的整数；
38.根据权利要求37所述的缀合物，其中p为0。
39.根据权利要求38所述的缀合物，其中X为
-N＝C＝R4或
其中R3为氢或者与它的附着氧原子一起形成反应性酯，且R4为氧或硫。
40.根据权利要求37所述的缀合物，其中p为1。
41.根据权利要求40所述的缀合物，其中Y为含有1-10个碳原子的亚烷基，
-NH-(CH2)m-或者
其中n和o为0-6的整数，m为1-6的整数。
42.根据权利要求41所述的共轭物，其中X为
-N＝C＝R4或
其中R3为氢或者与它的附着氧原子一起形成反应性酯，且R4为氧或硫。
43.一种含有免疫原性载体的免疫原，所述免疫原性载体含有连接到下式化合物的多胺聚合物
其中，Y为有机间隔基团；
X为能结合多胺聚合物的末端官能团；并且
p为0-1的整数。
44.根据权利要求43所述的免疫原，其中p为0。
45.根据权利要求43所述的免疫原，其中所述p为1。
46.根据权利要求45所述的免疫原，其中Y为含有1-10个碳原子的亚烷基，
-NH-(CH2)m-或者
其中n和o为0-6的整数，m为1-6的整数。
47.根据权利要求46所述的免疫原，其中所述免疫原性聚合物含有由
或
连接的一个或多个氨基，
其中R4为氧或硫。
48.一种用于测定患者样品中5-氟-尿嘧啶的存在的试剂盒，该试剂盒包括在分隔的容器中的试剂，试剂中的一种为载体与式II-B的化合物、或者II-A化合物或者它们的混合物的缀合物；
并且第二容器含有基本上与5-氟-尿嘧啶选择性反应并且基本上与喃氟啶和尿嘧啶不交叉反应的抗体，
其中，Y为有机间隔基团；
X为能结合载体的末端官能团；并且
p为0-1的整数；
其中X、Y和p与上述相同。
49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述缀合物在所述第一容器中以预定量存在。
50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于测定所述样品中5-氟-尿嘧啶的量。
51.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述抗体由免疫原性多胺多肽的免疫原产生，所述免疫原性多胺多肽链接到下式的化合物
其中p、X和Y与上述相同。
全文摘要
新型5-氟-尿嘧啶的缀合物和新型5-氟-尿嘧啶免疫原以及由这些免疫原产生的单克隆抗体，这些免疫原用于定量和监控生物分泌物中5-氟-尿嘧啶的免疫测定。
文档编号G01N33/53GK101147063SQ200680009624
公开日2008年3月19日 申请日期2006年2月2日 优先权日2005年2月8日
发明者S·萨拉莫内, J·B·考特尼, D·斯托克 申请人:萨拉戴克斯生物医学公司