专利名称：：抗磷酸化Tau蛋白抗体及其在AD症异常磷酸化Tau蛋白水平测定上的用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于免疫生物学和医学诊断范畴，具体涉及一种分别抗Thrl81，Thr205，Thr231，Ser262，Ser396，Ser404位点氨基酸磷酸化Tau蛋白的抗体及其在AD症(阿尔茨海默氏疾病)异常磷酸化Tau蛋白水平测定上的用途。
背景技术：
：Tau蛋白是一种广泛存在于神经元内的含磷糖蛋白，在脑内主要集中在神经细胞轴突之中(与轴突的结合力比与胞体或树突的结合力强)。通过与神经轴突内的微管结合，起到促进微管聚合、防止解聚和维持微管功能等效应。健康成年人脑中分离的tau蛋白质至少有56种异构体，均是由位于人类第17号染色体长臂上的同一单基因编码而成。该基因全长约100kb,包含16个外显子，由于其转录mRNA产物在转录后拼接上的差异(对tau外显子2、3、10选择性拼接)而产生了不同的蛋白异构体。最小的tau蛋白异构体352个氨基酸，最大的441个氨基酸，其余四种为381、383、410、412个氨基酸残基组成，它们之间的区别在于C末端有3或4个由3132个氨基酸残基组成的微管结合区以及N末端有0、l或2个由29个氨基酸残基构成的插入序列。胎儿期脑组织中仅有一种最短的tau蛋白异构体(352个氨基酸)，其C末端含3个串联重复顺序，N端无插入序列，且此时tau蛋白是处于高度磷酸化状态的(7molespi/分子)。随着发育过程的进展磷酸化程度逐渐降低，正常成熟脑内tau蛋白磷酸化位点很少，平均只有23个，此时tau蛋白与微管蛋白结合，结构稳定不易被磷酸化。老年性痴呆，又称为阿尔茨海默氏疾病(Alzheimerdisease,AD)是一种老年人神经系统进行性、退变性疾病，临床上主要有记忆、理解、判断及定向等认知功能障碍，精神行为异常，智力降低及生活能力减退等表现。自从1907年AloisAlzheimer本人发表第l例临床病理报告以来，已有一百年的研究历史，但发病机制至今仍不完全清楚。一般认为，该疾病是多因素共同作用时所致，其发病与遗传、环境、代谢诸因素有关。来自流行病学调查的资料显示，阿尔茨海默氏病的发病率与年龄老化程度有明显相关性65~74岁发病率为3%~6%、7585岁18.7%,>85岁47%。我国的发病情况与西方国家大致相同，估计现有病人360万左右，而且随着人口预期寿命的增高，社会老龄化的到来，其患病人数还会逐渐增多。从病理学上来看，AD症表现为两大特征①老年斑(SenilePlaques,SP):又称轴索斑，由一种4皮称为类淀粉样前体蛋白(AmyloidPrecussorProtein，APP)(分子量4KD，属(3片层状结构蛋白，故又称PA4蛋白)为核心，周围由已变性的轴索、树突、类淀粉样纤维和胶质细胞及其突起等环绕而成。那些周围环绕的神经突起常常是营养不良性的，含双股螺旋纤丝(PairedHelicalFilaments，PHFs),而PHFs又是由大量高度异常磷酸化的tau蛋白组成。②神经元纤维缠结(NeurofibrillaryTangles，NFTs):它是由异常细胞骨架组成的神经元内含体，其形态随不同种类细胞而异。NFTs的结构也是由PHFs组成。通过蛋白抗体标记物显示证明PHFs的主要成分是高度异常磷酸化的tau蛋白，正是这些高度异常磷酸化的Tau蛋白形成丝状样沉积物沉积于神经元内最终导致神经元的损害。迄今为止，人们发现涉及tau蛋白异常磷酸化修饰的位点大约有31个，其中至少有10个是脯氨酸指导的，即这些磷酸化位点与脯氨酸指导的蛋白激酶(ProlineDirectedProteinKinase,PDPK)有关。另有15个位点于46、198、199、202、208、210、235、262、396、400、404、409、412、413及422位丝氨酸残基上；其他6个位点在181、205、212、217、231及403位苏氨酸残基上。用不同生化分离技术可将AD症脑中的tau蛋白分成3个组分①胞浆非异常修饰的tau蛋白(c-tau);②异常修饰易溶型蛋白(ADP-tau)和③异常修饰并聚集的tau蛋白(PHF-tau)。根据PHF-tau在2%的十二烷基硫酸钠中的溶解性质差异，又可将其分为PHFI-tau和PHFII-tau蛋白两种。tau蛋白结构中最显著的特征是主体结构呈Pro-Gly-Gly-Gly的"重复串联"出现，tau蛋白借助"重复串联"区与双螺旋细丝(PHF)结合，促进了PHF发生不可逆的聚合，导致NFT的形成及神经元发生变性。Cambridge等在1988年经免疫细胞化学及生化研究揭示高度磷酸化的tau蛋白是PHF的主要亚单位。AD患者脑tau的异常磷酸化作用有如下特点①不仅是PHF中的所有异形tau均以异常磷酸化形式存在，胞浆中游离的tau也被磷酸化；②不仅在tau的氨基末端，而且在其分子内的多部位出现异常磷酸化；(D虽然每克分子蛋白含的磷酸是正常tau分子的4倍，但AD患者脑匀浆中的磷酸蛋白磷酸的总水平与正常者相比无显著改变。AD脑中的tau蛋白异常磷酸化修饰可进一步促进其发生糖基化，糖化，消旋化，泛素化等翻译后错误纟务饰，这些过程整合在一起大大加速了PHF/NFTs的形成。目前临床上有采用酶联免疫吸附法测定AD症患者血浆、脑脊液(CSF)中Tau蛋白水平，结果发现AD症患者CSF中Tau蛋白水平比同龄正常及非神经疾病患者组均显著增高，以此用于AD诊断及疗效观察，其敏感性为82%,特异性达为70%。若同时也检出(3-AP42水平降低，对老年性痴呆诊断的特异性可达70%90%。故国际上许多公司和研究才几构，都在积极开展这方面的研究，但目前基于磷酸化位点特异性Tau蛋白抗体的免疫组织化学检测和相关诊断方法比较少，大部分是停留于研究范畴。所以本发明提供的这一类六种分别抗Thr181，Thr205，Thr231,Ser262，Ser396，Ser404位点氨基酸磷酸化Tau蛋白的抗体及其在AD症异常磷酸化Tau蛋白水平测定上的用途具有重要的应用价值。参考文献1.BinderL，FrankfurterA，RebhunL(1985).Thedistributionoftauinthemammaliancentralnervoussystem.J.Cell.Biol.101(4):1371-82.AndreadisA.(2005)Taugenealternativesplicing:expressionpatterns,regulationandmodulationoffunctioninnormalbrainandneurodegenerativediseases.BiochimBiophysActa.1739(2-3》91-103.Review.3.AndreadisA，BrownW，KosikK(1992)Structureandnovelexonsofthehumantaugene.Biochem，31(43):10626-33.4.GoedertM,SpillantiniM,JakesR，RutherfordD,CrowtherR(1,)Multipleisoformsofhumanmicrotubule-associatedproteintau:sequencesandlocalizationinneurofibrillarytanglesofAlzheimer'sdisease.Neuron,3:519-26.5.SeldenSC，PollardTD.(1983)PhosphorylationofMicrotubule-associatedProteinsRegulatesTheirInteractionwithActinfilaments,TheJournalofBiologicalChemistry,258(11):7064-71.6.LeeVMetal.(1991)A68:AMajorSubunitofPairedHelicalFilamentsandderivatizedformsofNormalTau，Science,251(4994):675-8.7.PfefferRI，AfifiAA，ChanceJM.(1987)PrevalenceofAlzheimer'sdiseaseinaretirementcommunity,AmJEpidemiol,125(3):420-36.8.EvansDA，FunkensteinHH,AlbertMS,etal.(1989)PrevalenceofAlzheimer'sdiseaseinacommunitypopulationofolderpersons,Higherthanpreviouslyreported.JAMA,262(18):2551-69.FlamentSetal.(1990)PhosphorylationofTauproteins:amajoreventduringtheprocessofneurofibrillarydegeneration:AcomparativestudybetweenAlzheimer'sdiseaseandDown'ssyndrome,BrainResearch,516(1》15-9.10.Grundke-Iqbaletal.(1986)abnormalphosphorylationofthemicrotubule-associatedprotein(Tau)inAlzheimercytoskeletalpathology,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83(13),4913-7.11.MorishimaKawashimaM,etal.(1995)Proline-directedandnon-proline匿directedphosphorylationofPHF-tau.JBiolChem,270(2):823-912.VullietR，etal.(1992)Proline-directedphosphorylationofhumanTauprotein.JBiolChem，267(31):22570-413.KopKeEetal.(1993)Microtubule-associatedproteintau.Abnormalphosphorylationofanon-pairedhelicalfilamentpoolinAlzheimerdisease.JBio1Chem,268(32):24374-8414.KhatoonS，etal.(1992)Brainlevelsofmicrotubule-associatedproteintauareelevatedinAlzheimer'sdisease:aradioimmuno-slot-blotassayfornanogramsoftheprotein.JNeurochem,59(2》750-315.BrionJP，etal.(1991)TauinAlzheimerneurofibrillarytangles.N-andC-terminalregionsaredifferentiallyassociatedwithpairedhelicalfilamentsandthelocationofaputativeabnormalphosphorylationsite.JBiochem，273(Ptl):127-3316.GoedertM，etal.(1992)TauproteinsofAlzheimerpairedhelicalfilaments:abnormalphosphorylationofallsixbrainisoforms，JNeuron,8(1):159-68。
发明内容本发明的目的之一是提供一种抗磷酸化Tau蛋白的抗体。该类抗体是针对同一Tau蛋白的磷酸化位点特异性抗体，具体包括了六种分别抗Thrl81，Thr205，Thr231,Ser262，Ser396,Ser404位点磷酸化修饰Tau蛋白的兔多克隆抗体。本发明的另一目的是提供一种该类抗磷酸化Tau蛋白抗体在阿尔茨海默氏疾病脑组织异常磷酸化Tau蛋白水平测定上的用途，即，该六种抗体用于脑組织切片AD症异常磷酸化Tau蛋白水平测定的使用方法。该六种抗体分别以常规免疫组织化学方法检测阿尔茨海默氏疾病模型大鼠脑组织切片中磷酸化Tau蛋白水平的方法，以及进一步推广在人类阿尔茨海默氏疾病中的诊断和评价应用。完成上述发明任务的技术方案是一种抗磷酸化Tau蛋白的抗体，其特征在于，六种分别抗Thrl81，Thr205,Thr231，Ser262，Ser396，Ser404位点磷酸化修饰Tau蛋白的兔多克隆抗体，制备时分别采用了以下的抗原多肽，其具体序列分别为(注序列中斜体并用双下划线标出的为磷酸化的氨基酸，N端半胱氨酸是人为添加的，用于载体连接)Thr231位点的抗原多肽CKVAVVRIPPKSPSSer262位点的抗原多肽CVKSKIG^TENLKHSer396位点的抗原多肽CAEIVYKJPVVSGDSer404位点的抗原多肽CVVSGDTfiPRHLSN所述的六种抗磷酸化Tau蛋白抗体的制备方法是分别选用以上这六条抗原多肽，经化学合成后采用异型双功能偶连剂石黄基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-l-羧环己烷(SMCC)把多肽偶联到栽体蛋白KLH上，形成适合动物免疫的KLH-多肽抗原系统。然后经常规的兔子免疫(每种抗体对应选用该位点的KLH-多肽抗原)、抗血清制备和多抗分离纯化等步骤，最终获得的这一类六种分别抗Thr181，Thr205，Thr231,Ser262，Ser396,Ser404位点磷酸化修饰Tau蛋白的兔多克隆抗体。ELISA测试表明本发明上述的六种分别抗Thrl81，Thr205,Thr231，Ser262，Ser396，Ser404位点磷酸化修饰Tau蛋白的兔多克隆抗体，均对特定位点氨基酸磷酸化Tau蛋白高度的结合专一性，而与此位点非磷酸化的Tau蛋白结合力极低。更优化和更具体的说，本发明的抗磷酸化Tau蛋白的抗体，其特征在于，是指采用以下方法获得的抗体(l).抗原多肽设计与合成依据蛋白质数据库中人类Tau蛋白的序列信息，精心设计出六条分别对应Tau蛋白中六个关键的Thrl81，Thr205，Thr231,Ser262，Ser396,Ser404磷酸化氨基酸位点两侧连续的14AA(包括磷酸氨基酸)多肽(N端人为添加一个半胱氨酸)，其具体序列为(注序列中斜体并用双下划线标出的为磷酸化的氨基酸)Thrl81CTPPAPKIPPSSGEThr205CSPGSPGffGSRSRThr231CKVAVVRIPPKSPSSer262CVKSKIG,NLKHSer396CAEIVYK^PVVSGDSer404CVVSGDT^PRHLSN(2).以化学合成法制备出以上六条包含对应位点氨基酸磷酸化的抗原多肽(P肽)和另外六条对应位点氨基酸非磷酸化的多肽(N肽)；(3).通过异型双功能偶连剂磺基琥珀酰亚胺4-[N-曱基马来酸]-l-羧环己烷(SMCC)把P肽偶联到载体蛋白KLH上，形成适合动物免疫的多肽-KLH抗原系统；把P肽、N肽分别偶联到载体蛋白BSA(牛血清白蛋白)上，用做ELISA才企测时的包祐j元原；(4).兔子免疫与阳性血清采集按照每只兔子300ug多肽-KLH的剂量对兔子进行基础免疫；基础免疫时，采用含50。/。福氏完全佐剂的多肽-KLH抗原乳化液；免疫途径为皮下多点；以后每隔20天进行一次加强免疫，采用的是含有50%福氏不完全佐剂的多肽-KLH抗原乳化液，期间采血以BSA-多肽做ELISA测试，在完成第四次加强免疫后7天才艮据ELISA结果，收集达到采血标准的阳性血清；(5).抗体分离纯化与鉴定采用化学连4妄法4巴多肽抗原(P肽、N肽)偶连到GEL上以制备出亲和层析用的抗原柱；采集的阳性血清经0.45um滤器过滤、pH调节后，将其与偶连了磷酸化多肽抗原的亲和层析GEL混合4'C緩慢搅拌过夜，第二天将其装入层析柱中，以10mMPBS洗柱后用pH2.8的甘氨酸溶液洗柱，收集OD28(^0.15的洗脱液并迅速调节pH中性，该洗脱液中包含了抗此P肽对应位点氨基酸磷酸化Tau蛋白抗体(P-抗体)和抗此P肽对应位点氨基酸非磷酸化Tau蛋白抗体(Pan-抗体)，进一步将此洗脱液与偶连了对应非磷酸化多肽抗原的亲和柱结合去除其中混有的Pan-抗体，收集其穿透液经透析、浓缩、添加甘油保护剂，最终获得了抗此P肽对应位点氨基酸磷酸化修饰Tau蛋白的兔多克隆抗体成品(既选用Thrl81位点抗原多肽最终可产生抗Thr181位点磷酸化修饰Tau蛋白的抗体成品，其余Thr205，Thr231，Ser262,Ser396，Ser404位点抗体的制备过程类似)；以BSA-多肽抗原包被的酶标板做ELISA测试，数据显示了其高效价和指定位点磷酸化Tau蛋白高度的专一性。完成本发明第2个发明任务的技术方案是所述的抗磷酸化Tau蛋白的抗体在阿尔茨海默氏疾病(AD症)异常磷酸化Tau蛋白水平测定上的用途，其特征在于，步骤如下首先通过脑内注射Ap25-35凝聚态建立AD症大鼠模型(同时设立去势组、雌激素受体激动剂干预组)，模型成功后断头处死大鼠，以常规方法制备各组脑组织石蜡切片。然后采用本发明中六种分别抗Thrl81，Thr205，Thr231，Ser262，Ser396，Ser404位点氨基酸磷酸化Tau蛋白抗体做免疫组化检测时的一抗，以常规免疫组织化学方法检测各组大鼠脑组织神经细胞中的磷酸化Tau蛋白，结果各组脑切片上都检测到了磷酸化Tau蛋白，表现为脑组织特定区域内神经细胞胞浆和神经突起位置呈现棕黄色(DAB显色)，且各组之间强度上存在一定的差异。结合生化分子病理学的报道，此发明的六种抗磷酸化Tau蛋白抗体可以开发为免疫组化试剂盒，用于人类阿尔茨海默氏疾病的it断和治疗评价。鉴于本发明提供的这一类抗磷酸化Tau蛋白的抗体能够很好的识别包括人、大鼠、小鼠物种的Tau蛋白，故其在大鼠脑组织切片AD症异常磷酸化Tau蛋白水平测定上的用途，可以为进一步推广在人类阿尔茨海默氏疾病异常磷酸化Tau蛋白水平的诊断中进行应用。图l为六种抗磷酸化Tau蛋白兔多抗在AD症大鼠脑组织切片的免疫组化检测效果。具体实施例实施例l，一类抗磷酸化Tau蛋白的抗体制备(1).抗原多肽合成与载体偶连依据蛋白质数据库中人类Tau蛋白的序列信息，设计了六条分别对应Tau蛋白中六个关键的Thr181，Thr205，Thr231,Ser262,Ser396，Ser404磷酸化氨基酸位点两侧连续的、包括磷酸氨基酸在内的14AA多肽(N端人为添加一个半胱氨酸)，这六条抗原多肽的具体序列为(注序列中斜体并用双下划线标出的为磷酸化的氨基酸)Thrl81CTPPAPKJPPSSGEThr205CSPGSPGJPGSRSRThr231CKVAVVRIPPKSPSSer262CVKSKIG,NLKHSer396CAEIVYK^PVVSGDSer404CVVSGDT^PRHLSN(2).以化学合成法制备出以上六条包含对应位点氨基酸磷酸化的抗原多肽(P肽)和另外六条对应位点氨基酸非磷酸化的多肽(N肽)。(3).用磺基琥珀酰亚胺4-[N-曱基马来酸]-l-羧环己烷(SMCC)做偶连剂，把P肽偶联到载体蛋白KLH上，形成适合动物免疫的多肽-KLH抗原；同样方法分别把P肽、N肽偶联到栽体蛋白BSA(牛血清白蛋白)上，用于ELISA检测的包被抗原。偶连好的抗原保存于-70'C冰箱中。(4).兔子免疫与阳性血清采集按照每只兔子300ug多肽-KLH的剂量对兔子实施基础免疫。基础免疫时，采用福氏完全佐剂多肽-KLH抗原以体积比l:l制成的乳化液，免疫途径为皮下多点。以后每隔20天进行一次加强免疫，加强时每只兔子200ug多肽-KLH的剂量，采用福氏不完全佐剂多肽-KLH抗原以体积比1:1制成的乳化液，期间采血分离血清以BSA-多肽做ELISA测试，在完成第四次加强免疫后7天根据ELISA结果，收集达到采血标准的阳性血清。一般按照上述方法，四次加强免疫完成后，兔子的血清效价都在l:64000以上，免疫效果极佳。(5).抗体分离纯化与鉴定采用化学连接法把多肽抗原(P肽、N肽)偶连到GEL上以制备出亲和层析用的抗原柱。采集的阳性血清经0.45um滤器过滤，并添加10%的pH7.6Tris-HCl緩冲液(三羟甲基氨基曱烷-盐酸)调节pH。然后将血清与偶连了磷酸化多肽抗原的亲和层析GEL混合4。C緩慢搅拌过夜，第二天将其装入层析柱中，以10mMPBS洗完柱后用pH2.8的甘氨酸溶液洗柱，收集OD28(^0.15的洗脱液并迅速调节pH中性，该洗脱液中包含了抗此P肽对应位点氨基酸磷酸化Tau蛋白的抗体(P-抗体)和抗此P肽对应位点氨基酸非磷酸化Tau蛋白的抗体(Pan-抗体)，进一步将洗脱液与偶连了对应的N肽的亲和柱结合去除其中混有的Pan-抗体，收集其穿透液经透析、浓缩、添加甘油保护剂，最终获得了抗此P肽对应位点氨基酸磷酸化修饰Tau蛋白的兔多克隆抗体成品(既选用Thrl81位点抗原多肽最终可产生抗Thrl81位点磷酸化修饰Tau蛋白的抗体成品，其余Thr205,Thr231，Ser262,Ser396，Ser404位点抗体的制备过程类似)；以BSA-多肽抗原包被的酶标板做ELISA测试，数据(见表1)显示了这六种抗体的高效价(均大于1:64000)和指定位点磷酸化Tau蛋白高度的专一性(在1:64000的稀释浓度下抗体对P肽的OD值远高于对对应N肽的OD值)。表l六种抗磷酸化Tau蛋白兔多抗的ELISA测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例2、抗石粦酸化Tau蛋白抗体以免疫组织化学法4企测AD症大鼠动物模型脑组织中磷酸化Tau蛋白1、Aj325-35注射建立AD症大鼠模型将lmgAj325-35溶于200pL灭菌生理盐水中，制成5nmol/pL浓度，密封后置于37。C细胞培养箱中96小时形成A(325-35凝聚态。分为三组给药造模AD症模型组大鼠4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，用脑立体定位仪取平颅头位固定大鼠，确定右侧前囟后3.8mm、中线旁2.5mm，颅骨表面下3.0mm为右侧海马背側部，用lML微量注射器5min内緩慢注入AJ325-35pL，予以留针10min。术后给予青霉素钠盐5万单位肌注，每天1次，连续3天，至第14天处死大鼠。AD去势组大鼠在10%水合氯醛(3-4mL/kg,ip)麻醉下进行手术，无菌下腹部正中纵切口约3-4cm，摘除双侧卵巢组织，置输卵管入腹腔，肠管和胃回位。缝合腹肌前，向腹腔注入10万单位青霉素，缝合皮肤。术后连续行阴道涂片。于去势术2周后同前制作AD模型。(造模时间共4周)雌激素受体激动剂干预组去势术4周后AD大鼠皮下注射17(3-雌二醇，200ug/Kg体重，每周2次，持续两周(造模时间共6周)。2、脑组织切片制作各组大鼠断头处死，取出全脑置于10%曱醛中浸泡约1~2小时后，冠状切取一见交叉和乳头体之间的脑组织，继续置于曱醛中固定24小时。组织块经常规脱水、透明、浸蜡、包埋成蜡块，行冠状切片，每片厚度4um。3、组织化学法检测磷酸化Tau蛋白a、按标准免疫组织化学染色方法，先将组织切片于60。C烤片lh,常规二曱苯浸泡脱蜡，梯度乙醇溶液水化后，PBST沖洗3次，每次5min。b、抗原修复(煮沸法)将切片放入10mmol/L的柠檬酸盐緩冲液(pH6.0),于微波炉中加热计时3分钟，取出容器待冷却至室温后，把切片用PBST冲洗3次，每次5min。c、3%&02-曱醇溶液阻断内源性过氧化物酶15min,PBST冲洗3次，每次5min;d、用免疫组化笔将切片作好标记，按照编号分别添加以上六种分别抗Thrl81,Thr205，Thr231,Ser262，Ser396，Ser404位点^J^酸磷酸化Tau蛋白的兔多抗(稀释度l:50)后，置于37。C孵育lhr;PBST代替一抗作阴性对照。e、PBST冲洗3次，每次5min后，每片滴加迈新公司即用型ELivisionplus第二代組化试剂盒试剂A:Postblocking试剂一滴50^L，湿盒中室温继续孵育30min。f、PBST冲洗3次，每次5min，每片滴加组化试剂盒试剂B(HRP标记的polymer二抗)一滴50pL，室温，孵育30分钟。g、PBST冲洗3次，每次5min，DAB底物显色，苏木素复染，脱水、透明后中性树胶封固。4、磷酸化Tau蛋白的免疫组化结果分析各组免疫组织化学实验完成后，切片置于光学显微镜下观察，取代表性的视野拍照分析。结果如图2，可见六种抗Thrl81，Thr205，Thr231,Ser262，Ser396，Ser404位点氨基酸磷酸化Tau蛋白兔多克隆抗体在AD症大鼠的三个组模型组(A列)、去势组(B列)、雌激素受体激动剂干预组(C列)中都4企测到了阳性，染色结果表现为神经细胞轴突和胞体部分呈现棕黄色，且组之间表现为一定的趋势AD去势组是阳性率是最高的，AD组相对要低一些，雌激素干预组比AD去势组低，表现为介于AD去势组和AD组之间。权利要求1、一种抗磷酸化Tau蛋白的抗体，其特征在于，所述抗体是针对同一Tau蛋白的磷酸化位点特异性抗体，包括六种分别抗Thr181，Thr205，Thr231，Ser262，Ser396，Ser404位点磷酸化修饰Tau蛋白的兔多克隆抗体。2、根据权利要求1所述的抗磷酸化Tau蛋白的抗体，其特征在于，所述的Tau蛋白，包括来自人、大鼠、小鼠物种中的Tau蛋白。3、根据权利要求1所述的抗磷酸化Tau蛋白的抗体，其特征在于，所述的六种抗体制备时分别采用了针对人类Tau蛋白中Thrl81，Thr205，Thr231,Ser262,Ser396，Ser404这六个磷酸化位点设计的以下六条14AA抗原多肽，其具体序列为Thrl81位点的抗原多肽CTPPAPKIPPSSGEThr205位点的抗原多肽CSPGSPGIPGSRSRThr231位点的抗原多肽CKVAVVRIPPKSPSSer262位点的抗原多肽CVKSKIG^TENLKHSer396位点的抗原多肽CAEIVYK^PVVSGDSer404位点的抗原多肽CVVSGDTfiPRHLSN以上序列中斜体并用双下划线标出的为磷酸化的氨基酸，N端半胱氨酸是人为添加的，用于载体连接。4、根据权利要求1或2或3所述的抗磷酸化Tau蛋白的抗体，其特征在于，所述的抗磷酸化Tau蛋白的抗体，是指采用以下方法获得的抗体分别选用以上这六条抗原多肽，经化学合成后采用异型双功能偶连剂磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-l-羧环己烷把多肽偶联到载体蛋白KLH上，形成适合动物免疫的KLH-多肽抗原系统。然后经常身见的兔子免疫，每种抗体对应选用该位点的KLH-多肽抗原；抗血清制备和多抗分离纯化，最终获得的这六种分别抗Thr181，Thr205，Thr231,Ser262，Ser396，Ser404位点磷酸化修饰Tau蛋白的兔多克隆抗体。5、根据权利要求4所述的这一类抗磷酸化Tau蛋白的抗体，其特征在于，所述的抗磷酸化Tau蛋白的抗体，是指采用以下方法获得的抗体(1).抗原多肽设计与合成依据蛋白质数据库中人类Tau蛋白的序列信息，设计出六条分别对应Tau蛋白的Thrl81，Thr205,Thr231，Ser262,Ser396，Ser404六个磷酸化氨基酸位点两侧一段连续的、14个氨基酸的多肽；各多肽的N端人为添加一个半胱氨酸，其具体序列为Thrl81CTPPAPKIPPSSGEThr205CSPGSPGIPGSRSRThr231CKVAWRZPPKSPSSer262CVKSKIG^TENLKHSer3%CAEIVYKffWSGDSer404CVVSGDTfiPRHLSN(2).以化学合成法制备出以上六条包含对应位点氨基酸磷酸化的抗原多肽作为P肽的磷酸化多肽，和制备出另外六条对应位点氨基酸非磷酸化的多肽作为N肽的非磷酸化多肽；(3).通过异型双功能偶连剂磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-l-羧环己烷把P肽偶联到载体蛋白KLH上，形成适合动物免疫的多肽-KLH抗原系统；把P肽、N肽分别偶联到载体蛋白BSA上，用做ELISA检测时的包被抗原；(4).兔子免疫与阳性血清采集按照每只兔子300ug多肽-KLH的剂量对兔子进行基础免疫；基础免疫时，采用含50%福氏完全佐剂的多肽-KLH抗原乳化液；免疫途径为皮下多点；以后每隔20天进行一次加强免疫，采用的是含有50%福氏不完全佐剂的多肽-KLH抗原乳化液，期间采血以BSA-多肽做ELISA测试，在完成第四次加强免疫后7天根据ELISA结果，收集达到采血标准的阳性血清；(5).抗体分离纯化与鉴定采用化学连接法把多肽抗原的P肽、N肽偶连到GEL上以制备出亲和层析用的抗原柱；采集的阳性血清经0.45um滤器过滤、pH调节后，将其与偶连了P肽抗原的亲和层析GEL混合4。C緩慢搅拌过夜，第二天将其装入层析柱中，以10mMPBS洗柱后用pH2.8的甘氨酸溶液洗柱，收集0028(^0.15的洗脱液并迅速调节pH中性，该洗脱液中包含了抗此P肽对应位点氨基酸磷酸化Tau蛋白的抗体和抗此P肽对应位点氨基酸非磷酸化Tau蛋白抗体，进一步将此洗脱液与偶连了对应N肽抗原的亲和柱结合去除其中混有的Pan-抗体，收集其穿透液经透析、浓缩、添加甘油保护剂，最终获得了抗此P肽对应位点氨基酸磷酸化Tau蛋白的兔多克隆抗体成品；以BSA-多肽抗原包被的酶标板啦文ELISA测试。6、一种权利要求1所述的抗磷酸化Tau蛋白的抗体在阿尔茨海默氏疾病异常磷酸化Tau蛋白水平测定上的用途。7、根据权利要求6所述的抗磷酸化Tau蛋白的抗体在阿尔茨海,默氏疾病异常磷酸化Tau蛋白水平测定上的用途，其特征在于，步骤如下首先通过脑内注射AP25-35凝聚态建立阿尔茨海默氏疾病大鼠模型，同时设立去势组、雌激素受体激动剂干预组，^t型成功后断头处死大鼠，以常规方法制备各组脑组织石蜡切片；然后分别采用外又利要求1所述的六种抗Thr181,Thr205，Thr231，Ser262,Ser396，Ser404位点磷酸化修饰Tau蛋白的抗体做一抗，以常规免疫组织化学方法检测各组大鼠脑组织神经细胞中的磷酸化Tau蛋白，结果各组脑切片上都检测到了以上各个位点磷酸化的Tau蛋白，表现为脑组织特定区域内神经细胞胞浆和神经突起位置呈现棕黄色，且各组之间强度上存在一定的差异。全文摘要抗磷酸化Tau蛋白抗体及其在AD症异常磷酸化Tau蛋白水平测定上的用途。抗体为分别抗Thr181，Thr205，Thr231，Ser262，Ser396，Ser404位点磷酸化修饰Tau蛋白的兔多克隆抗体。Tau蛋白包括来自人、大鼠、小鼠物种中的Tau蛋白。抗磷酸化Tau蛋白抗体在AD症异常磷酸化Tau蛋白水平测定上的用途，步骤是通过建立AD症大鼠模型制备各组脑组织石蜡切片；采用分别抗各位点磷酸化修饰Tau蛋白的抗体做一抗；检测各组大鼠脑组织神经细胞中磷酸化Tau蛋白，结果检测到各个位点磷酸化Tau蛋白。这六种抗体可开发为试剂盒，用于人类和相关动物模型阿尔茨海默氏疾病诊断和评估。文档编号G01N33/68GK101307108SQ20081012431公开日2008年11月19日申请日期2008年6月25日优先权日2008年6月25日发明者夏树开,孙钵清,李保仝,林世康,胡云龙,黄文华申请人:南京川博生物技术有限公司