专利名称：：一种特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种酶联免疫检测试剂盒，尤其涉及一种特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒。
背景技术：
：特布他林属于P—兴奋剂，(3—兴奋剂是一类化学合成的苯乙醇胺类衍生物。P—兴奋剂作用机理和肾上腺素、去甲肾上腺素相同，可影响营养物质在动物体内的流向和重新分配，有效促进肌肉组织生长，降低胴体脂肪含量，提高瘦肉率和增加瘦肉产量，因而曾在欧美广泛使用。运动员使用此药，可以增加肌肉和肺活量，縮短高强度训练后的恢复期。但另一方面，p—兴奋剂具有类似肾上腺素的化学结构，而且这类化合物作为促生长剂的用量一般较高，一般为治疗用量的5-10倍。事实表明此类药物不易破坏，如果在屠宰前没有经过一定时间的休药期，则在肌肉和内脏器官会残留较高浓度的药物。如果人食用了含有这些残留药物的可食性组织，这些药物就能与细胞表面的P—受体结合而产生明显的生理作用，如心悸、头疼、目眩、恶心、呕吐、战栗、神经过敏、血管扩张、心率加快等，尤其是对高血压、心脏病、糖尿病、甲亢患者危害更大，严重的可导致死亡。因此为了保证消费者的安全，目前欧美各国均禁止其在畜牧生产上的应用。但还是有某些国家和地区的饲养者在食用性动物喂养中添加特布他林，导致相关动物性食品中有特布他林残留，因此定期对特布他林残留进行检测成为许多国家的监控的必要手段。目前，检测特布他林的方法主要有微生物法、薄层色谱法(TLC)、放射免疫法，高效液相色谱法(HPLC)、色/质联用分析法(LC-MS)、液/质联用分析法(LC-MS/MS)。微生物法的缺陷是费时而且缺乏特异性。薄层色谱法的缺陷是操作过程复杂，时间长;操作人员需要经过专业培训；影响分析的干扰因素较多，结果重复性差。薄层色谱法、放射免疫法，高效液相色谱法、色/质连用分析法、液/质联用分析法这些理化方法的缺陷是仪器设备昂贵，样品前处理复杂，费时，费力，不易普及，检测费用高，特别是放射免疫法还需要配备放射源，有一定危险性。鉴于此，建立一种有效、快速、简单、灵敏的检测特布他林的方法具有重要意义。
发明内容本发明的目的是提供一种特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒具有检测灵敏度高、应用灵活、方便的特点。本发明所述特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由特布他林与卵清蛋白偶合制成；所述试剂包括特布他林系列标准溶液、酶标羊抗兔抗体、特布他林抗体、发光溶液、洗涤溶液、包被溶液及封闭溶液。上述特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒中所述包被抗原浓度优选5//g/mL。所述卵清蛋白的分子量范围优选6.7KDa6.8KDa。所述特布他林系列标准溶液分别是O.lng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL。所述酶标羊抗兔抗体为辣根过氧化酶-羊抗兔IgG原液，其工作浓度优选为1:1000。所述特布他林抗体是由特布他林与分子量范围是6.7KDa6.8KDa的牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫动物制得的多克隆抗体，其工作浓度优选为1:600。所述发光液是0.01M鲁米诺与0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲垸溶液(pH=8.8)和3/10000(体积比)&02的混合液。所述鲁米诺为发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。所述洗涤溶液是含有体积分数0.05%吐温-20的pH7.5、0.1mol/L磷酸盐缓冲液。所述包被溶液是每升水中含1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠的溶液，pH为9.5。所述封闭溶液是每升洗涤溶液中含10g卵清蛋白(OVA，ovalbumin,也称鸡卵清白蛋白或鸡卵白蛋白，由386aa组成，分子量约43Kd)且加入重量分数0.5%NaN3的溶液。本发明试剂盒最大检测范围为0.1ng/mL10ng/mL。本发明试剂盒中涉及的特布他林标准溶液、酶标羊抗兔抗体溶液、特布他林抗体溶液、发光溶液及洗涤溶液及其配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是1、特布他林标准溶液0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL。2、酶标羊抗兔抗体溶液酶标羊抗兔抗体为辣根过氧化酶-羊抗兔IgG原液，使用时用洗涤溶液配制成1:1000的工作浓度。3、特布他林抗体溶液特布他林抗体是用人工免疫抗原免疫动物制得的多克隆抗体，将所得特布他林抗体用洗涤溶液稀释成1:600的工作浓度。4、发光溶液是0.01M鲁米诺与O.OOIM对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(pH=8.8)禾卩3/10000(体积比)H202的混合液。5、洗涤溶液指含有体积分数0.05。/。吐温-20的pH7.5、0.1mol/L磷酸盐缓冲液。6、包被溶液1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH为9.5。7、封闭溶液配制10gOVA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量比为0.05%的NaN3。本发明中微孔板的制备本发明中包被的微孔板采用特布他林-OVA在设定的包被溶液中，以设定的浓度，在4t:中过夜反应包被。本发明采用的是pH为9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。本发明中微孔板中所包被的特布他林-OVA在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次洗板，采用的包被蛋白浓度为5/^g/mL。包被好的微孔板可以用含封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选OVA，需加入NaN3防止变质。特布他林抗体溶液和酶标羊抗兔抗体溶液的制备本发明中特布他林抗体溶液、酶标羊抗兔抗体溶液浓度是决定本发明中特布他林酶联免疫测试试剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。本发明中涉及的特布他林抗体溶液可以用洗涤溶液配制成浓度为0.1~10ng/mL溶液；或用洗涤溶液稀释成1:600的工作浓度。本发明中涉及的酶标羊抗兔抗体溶液优选用洗涤溶液配制的浓度为1:1000。按照上述特布他林抗体溶液浓度和酶标羊抗兔抗体溶液浓度制备的试剂盒可以达到很好的线性范围(标准线范围可以达到0.1ng/mL~10ng/mL)及和好的灵敏度(0.1ng/mL)。发光溶液的配制本发明采用辣根过氧化酶标记底物发光系统，主要是鲁米诺-过氧化氢系统。所述发光液是0.01M鲁米诺与0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲垸溶液(pH=8.8)和3/10000(体积比)H202的混合液。所述鲁米诺为发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起来，利用酶催化底物的化学发光反应检测产物浓度。其中涉及的发光反应式为本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级；有望在动物性食品(如奶、动物组织、尿样)中的特布他林残留检测中发挥重要作用。图1为本发明的抗原的紫外图谱。图2为本发明特布他林抗体的抑制率曲线。图3为本发明的工作曲线。具体实施例方式实施例l、免疫原、包被抗原的及抗体的制备(1)免疫原的合成将特布他林与牛血清蛋白(BSA)采用l,4-丁二醚法进行偶联得到免疫原。具体包括以下步骤A，称取50mg牛血清蛋白(BSA)溶在3mL50mM碳酸盐(pH10.7)缓冲液中，然后向溶液中加入13.8^L(72.9nmoD的l,4-丁二醚(BDE)，室温反应20小时，得无色澄清溶液A;B，称取30mg(109.4|amol)特布他林溶在1.5mL50mM碳酸盐(pH10.7)缓冲液中,把溶液A通入氮气，随后将特布他林溶液逐滴加入A溶液中，室温反应20小时，得无色澄清溶液；C，将反应液转移到半透膜中，在0-4"C用磷酸盐缓冲溶液(PBS)(0.01M,pH7.4)透析3天，其间每4-6小时换一次透析液；随后用高纯水透析3天，其间每4-6小时换一次透析液；透析完毕，用冷冻干燥机冻干，得白色固体粉末即为免疫原(特布他林与牛血清蛋白的偶联物)，-2(TC保存，备用。(2)包被抗原的合成将特布他林与卵清蛋白(OVA)釆用对氨基苯甲酸法进行偶联得到免疫原。具体包括以下步骤A、称取10mg(73pmol)对氨基苯甲酸(ABA)溶入l.lmL0.2M盐酸中，然后称取6mg(87pmo1)的亚硝酸钠(NaN02)溶在0.35mL的蒸馏水中，04°C搅拌，将亚硝酸钠(NaN02)溶液逐滴加入到对氨基苯甲酸溶液中，避光反应l小时，得溶液A;B、称取20mg(84)amol)沙丁胺醇溶在10mL冰冷的硼砂缓冲液(0.05M)(pH8.5，含0.15M的NaCl)中，04°C搅拌，将上述的A溶液2mL逐滴加入到该溶液中，避光反应2小时,得到桔黄色溶液；C、把溶液加少量的硼酸晶体调pH至7.4，然后加入l19.54mg(2.78pmol)卵清蛋白(OVA)，同时加入160mg(834,1)水溶性碳二亚胺(EDC),48mg(417,ol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),室温搅拌3小时，得桔黄色溶液；D、将反应液转移到半透膜中，在04'C用磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.01M,pH7.4)透析3天，其间每4-6小时换一次透析液；随后用高纯水透析3天，其间每4-6小时换一次透析液；透析完毕，用冷冻干燥机冻干，得淡黄色固体粉末即为包被抗原(特布他林与卵清蛋白的偶联物)，-2(TC保存，备用。(3)特布他林多克隆抗体的制备采用新西兰大白兔作为免疫动物，以特布他林与牛血清蛋白的偶联物为免疫原，首次免疫剂量为500pg/mL，首免时将免疫原溶于入等体积的生理盐水和弗氏完全佐剂制成乳化剂，颈背部多点注射，以后免疫取剂量减半的免疫原溶于等体积的生理盐水和弗氏不完全佐剂混合乳化，首免与二免间隔20天，以后每隔两周免疫一次共免疫五次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7天以后心脏采血，离心得抗血清，得到特布他林多克隆抗体。实施例2、CL-ELISA检测方法的建立(1)抗体与包被抗原浓度的优选(方阵)纵向用每种包被抗原按40.0^g/mL、20.0〃g/mL、10.0^g/mL、5.0〃g/mL、2.5^g/mL、1.25/^g/mL、0.625^g/mL、0.3125〃g/mL的系列稀释度包被酶标板，100〃L/孔，0-4。C放置过夜，用洗涤液洗板三次，每次拍干；250//L/孔封闭溶液封闭，室温放置3小时，洗板三次，每次拍干；加入100/^L/孔一系列稀释的抗体(1:100至1:1024000)，室温放置2小时，洗板三次，每次拍干；加入IOO^L/孔的l:1000的辣根过氧化酶-羊抗兔IgG抗体，室温放置l小时，洗板三次，每次拍干；加入100^L/孔的发光液，测定发光值。以发光值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。(2)抗体灵敏度的测定根据上述对抗体及包被抗原浓度的优选实验，申请人选择并确定抗体浓度为1:600，包被抗原浓度为5^g/mL进行抗体的灵敏度的测定A、包被用0.05MpH9.6的碳酸盐包被溶液将特布他林的包被抗原配成5^g/mL的溶液，每个聚苯乙烯板的反应孔中加4'C过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，300^L/孔，每次5分钟，拍干。(此步简称洗涤，下同)。B、封闭用封闭溶液封闭上述己包被的酶标板，250/dV孔，室温孵2-4小时，然后洗涤。C、加样加稀释特布他林抗体抗体(1:600)50^L/孔与不同浓度的特布他林抗体溶液50^L/孔于上述已封闭的反应孔中，室温2-4小时，然后洗涤。D、加酶标抗体于各反应孔中，加入新鲜稀释辣根过氧化酶-羊抗兔IgG的抗体(1:1000)100//L/孔，1.5小时，洗涤。E、发光于各反应孔中加入临时配制的发光溶液100^L/孔，立即用化学发光免疫分析仪检测。F、检测结果以抑制率计算e/。抑制率二y。B/Bo，B是不伺浓度的药物作为竞争者的发光值，Bo是不加药的发光值。计算50%抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。实施例3、检测特布他林的化学发光酶联免疫试剂盒(1)检测特布他林的化学发光酶联免疫试剂盒的组成A、包被有包被抗原(特布他林与载体蛋白的偶联物)的固相载体(酶标板)；B、特布他林标准溶液0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL。C、酶标羊抗兔抗体溶液酶标羊抗兔抗体为辣根过氧化酶-羊抗兔IgG原液，装入，使用时用洗涤溶液配制成1:1000的工作浓度。D、特布他林抗体溶液用人工免疫抗原免疫动物制备所得的多克隆抗体，将所得特布他林抗体用洗涤溶液稀释成1:600工作浓度。E、发光溶液使用pH8.8的0.0001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液配制成0.01M的鲁米诺溶液，再与&02按照3:10000的体积比混合。F、洗涤溶液含有体积分数0.05%吐温-20的pH7.5、0.1mol/L磷酸盐缓冲液。G、包被溶液1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH9.5。H、封闭溶液配制10gOVA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量比为0.05%的NaN3。(2)酶标板的制备用包被液将包被抗原稀释成5ng/mL，每孔加入IOOpL，4'C过夜，倾去包被液，每孔加入250^L洗涤液洗涤3次,拍干，然后每孔加入封闭液250^L，37'C孵育1h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。实施例4、检测特布他林的化学发光酶联免疫试剂盒的应用(1)试剂的配制A、样品稀释液将试剂盒中提供的浓縮磷酸盐缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍后使用。B、洗涤溶液将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍后使用。C、发光溶液0.01M鲁米诺+0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(pH8.8)+3/10000(体积比)H202。(2)样品前处理A、牛奶首先将购买的纯牛奶样品在4'C、10000转/分钟条件下，离心15分钟，去掉脂肪层；将脱脂的牛奶用洗涤液稀释成1:10，得到待测样品。B、猪尿样将猪尿样品在4'C，10000g离心15分钟，去掉沉淀，将剩余的猪尿用洗涤液稀释成1:10，得到待测样品。C、动物组织取样品与4mL0.1M的盐酸混合，并且放在一起用超生波提取20min，然后10000g离心15min，取上清液用10MNaOH调pH至9.5±0.5，旋涡振荡5min，然后10000g离心15min。取上清液加5mL异丁醇振荡2min，混合物室温下静止15min，然后3000g离心10min，分出有机相，水相再用异丁醇(每次10mL)萃取两次，三次萃取的有机相合并在一起，50-60'C水浴减压蒸干，残余物用洗涤液重新溶解配成1:10的溶液，得到待测样品。(3)检测步骤A、加样向酶标板微孔中加入特布他林系列标准浓度溶液或样品溶50^L，然后加入特布他林抗体溶液50pL，室温(25°C)恒温孵育2.5h;B、洗涤倾出孔中液体，每孔加入洗涤溶液250^L，洗涤3次，拍干；C、加酶标羊抗兔抗体溶液每孔加入酶标羊抗兔抗体溶液100pL，室温恒温孵育lh;D、洗涤倾出孔中液体，每孔加入洗涤溶液250pL，洗涤3次，拍干；E、加发光溶液每孔加入发光溶液100^L;F、检测用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度。(4)结果判断所获得的标准品和样品发光值的平均值除以第一个标准(o标准)的发光值再乘以100，以抑制率为纵坐标，特布他林浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。%抑制率=%标准品发光值(或样品)/o标准品发光值。实施例5试剂盒精密度和准确度试验取O.l，0.5，1，5，10ppb的环丙沙星标样，添加到牛奶样品中，来检测环丙沙星回收率。每个浓度的批间变异系数都以不同的5天的5个重复数据进行计算，批内变异系数以同一天的5次重复数据计算。根据制定的标准曲线的线性方程进行回收率的定量计算。结果见下表:批间添加浓度检测次数检测结果回收率变异系数检测次数检测结果回收率变异系数<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从上述测定结果看，变异系数低于19.9%，回收率在83.8-113%之间。表明本试剂盒有很好的重复性和准确度。权利要求1、一种特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由特布他林与卵清蛋白偶合制成；所述试剂包括特布他林系列标准溶液、酶标羊抗兔抗体、特布他林抗体、发光溶液、洗涤溶液、包被溶液及封闭溶液。2、根据权利要求1所述特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述包被抗原浓度为5^g/mL。3、根据权利要求1所述特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述卵清蛋白的分子量范围是6.7KDa6.8KDa。4、根据权利要求1所述特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述特布他林系列标准溶液分别是O.lng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL。5、根据权利要求1所述特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述酶标羊抗兔抗体为辣根过氧化酶-羊抗兔IgG原液，其工作浓度为1:1000。6、根据权利要求1所述特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述特布他林抗体是由特布他林与分子量范围是6.7KDa6.8KDa的牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫动物制得的多克隆抗体，其工作浓度为1:600。7、根据权利要求1所述特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述发光液是0.01M鲁米诺与0.001M对甲苯酚的三(羟甲基)氨基甲垸溶液和体积比为3/10000H202的混合液。8、根据权利要求1所述特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述洗涤溶液是含有体积分数0.05%吐温-20的pH7.5、0.1raol/L磷酸盐缓冲液。9、根据权利要求1所述特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述包被溶液是每升水中含1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠的溶液，pH为9.5。10、根据权利要求1所述特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述封闭溶液是每升洗涤溶液中含10g卵清蛋白且加入重量分数0.5%NaN3的溶液。全文摘要本发明公开了一种特布他林的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由特布他林与卵清蛋白偶合制成；所述试剂包括特布他林系列标准溶液、酶标羊抗兔抗体、特布他林抗体、发光溶液、洗涤溶液、包被溶液及封闭溶液。本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级；有望在动物性食品(如奶、动物组织、尿样)中的特布他林残留检测中发挥重要作用。文档编号G01N33/543GK101393210SQ200810158140公开日2009年3月25日申请日期2008年10月24日优先权日2008年10月24日发明者锴丁,伟刘,刘中秋,尹伟伟,李伟华,郗日沫申请人:山东大学