专利名称：：猪瘟抗体elisa诊断试剂盒的制作方法猪瘟抗体ELISA诊断试剂盒
技术领域：
：发明涉及一种猪瘟抗体ELISA诊断试剂盒，属于动物用生物制品制造领域。技术背景猪瘟又称经典猪瘟(ClassicalSwineFever,CSF)，是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)引起猪的高度致死性、接触性传染病。是世界粮农组织和各国政府密切关注的主要传染病之一。根据0IE制定的《陆生动物卫生法典》2005年版，CSF被列为法定报告的疫病之一，在我国被列为"一类动物疫病"，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。世界各国都将猪瘟防疫列为国家动物卫生行政工作的重点，采取预防、防疫及检疫措施，以提高养猪产业的收益。在发达国家，以全场扑杀的方式，成功地扑灭猪瘟，成为非猪瘟区；我国则采取免疫、检疫和淘汰带毒猪的综合防疫措施，促进建立无规定动物疫病区，保证养猪业迅速、稳定发展，以点带面，从而达到全面消灭猪瘟的目标，因此猪瘟兔化弱毒疫苗依然是我国用于猪瘟预防控制的唯一手段。通过抗体水平的监测来制定合理、有效的免疫程序是提高群体免疫水平的保证，为猪瘟的综合防治提供了有力的技术支持。多年来，人们一直致力于猪瘟抗体检测试剂盒的开发。猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白是其的主要中和性抗原蛋白，它在病毒多聚蛋白上的氨基酸序列为690aa1063aa，利用该蛋白进行诊断抗体诊断技术的开发研究一致是人们研究的热点。为了获得猪瘟抗体用诊断抗原，先后采用了原核表达E2抗原、真核表达E2抗原以及全病毒纯化等各种方法，但各有不同的问题。主要原因有以下两个方面①原核表达抗原表达抗原为包涵体、敏感性差、酶联反应不稳定；②全病毒纯化抗原采用过两种方法，一种为硫酸铵沉淀法，另一种为超滤浓縮后超速离心法，但成本太高、技术难度大、产量极低，猪瘟病毒容易裂解等。在我国建立的方法也有ELISA方法、血凝抑制试验等，但均存在不稳定的特点。
发明内容是采用基因工程手段，将猪瘟病毒E2基因进行改造以获得蛋白表达量高、稳定性好和免疫原性特异的可溶性E2蛋白。采取的技术策略是应用基因拼接技术在猪瘟病毒E2基因的两侧加上分泌信号肽序列和纯化标签，并嵌合至杆状病毒表达载体中，构建重组杆状病毒，获得可溶性表达抗原，以用于抗体检测试剂盒的组装工作以及猪瘟单克隆抗体的筛选工作。[本发明的技术方案]应用基因拼接技术扩增出蜂素肽基因信号肽序列、多肽接头序列及6XHIS序列的融合序列，并将此序列克隆至载体pFastbacl(Irwitrogen公司产品)，构建了一个命名为pMEL-HIS的载体；应用基因拼接技术，将猪瘟病毒石门株E2基因(SME2)进行PCR扩增并突变，将突变后的猪瘟病毒E2基因序列用EcoRI/SalI双酶切，克隆至载体pMEL-HIS,转化筛选、测序鉴定。将构建的载体命名为pMEL-SE2M-HIS;将载体pMEL-SE2M-HIS转化大肠杆菌DH10Bac,与菌体中基因组重组后，经挑斑、PCR鉴定，转染Sf9细胞，产生重组核型多角体病毒，此病毒命名为苜蓿银纹夜娥核型多角体病毒(Autographacalifornicanuclearpolydedrosisvirus,AcMNPV)(参考黎路林编著.杆状病毒表达载体系统.武汉华中师范大学出版社出版，pl页)VFBMEL-SE2M-HIS株(2008年9月26日本病毒株已送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.2671)。将此病毒培养物进行纯化鉴定，获得猪瘟病毒石门株E2基因可溶性表达抗原，此抗原可用于组装猪瘟病毒抗体检测试剂盒。一、构建路线构建含有猪瘟病毒基因E2基因的重组Ac廳PVVFBMEL-SE2M-HIS的pMEL-SE2M_HIS载体的技术路线(见附图l)。二、载体构建1.含信号肽及6XHIS纯化标签载体(pMEL-HIS)的构建设计4条引物，将信号肽序列、接头序列及6XHIS序列通过应用基因拼接(Genesplicingbyoverlapextension)技术进行PCR扩增，双酶切(BamHI/Kpnl)pFastBacl载体和PCR产物，连接、转化筛选、测序鉴定。重建的载体命名为pMEL-HIS。(1)引物序列为将上述引物稀释至lOOMm备用。(2)具体操作过程如下1)取2XpfuTaqDNApolymerasemix(Tianz公司产品)20)4,MFP、MRP各5W，无酶水补至40W，72。C反应30min。2)取2XpfuTaqDNApolymerasemix(Tianz公司产品)HFP、HRP各，无酶水补至40W，72。C反应30min。3)取2XpfuTaqDNApolymerasemix(Tianz公司产品)20|4,第1、第2步反应产物各1|4，MFP、HRP各lri，无酶水补至40W，94。C预变性3min,然后94。C30sec，55。C30sec,72。C10sec,25cycles,最后72。C反应10min。4)将PCR反应产物电泳，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。5)将纯化回收的PCR产物及pFastBacl用BamHI/Kpnl双酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收纯化。6)将双酶切及纯化回收的PCR产物及pFastBacl载体连接，转化ToplO感受态细胞(Tianz公司产品)，涂板、挑斑筛选。7)将挑取的菌斑进行测序鉴定，证明pFastbacl中克隆的序列为CAGATTCCACGAA6T(nGGCGCCATGGGACATCACCATCACCATCAC6^7MO;克隆序列与设计序列一致。2.突变序列的E2基因有文献报道，密码子的使用频率会严重影响基因的表达量，甚至不表达。E2基因在昆虫细胞中的密码子使用频率低于20%高达40多处。设计了42条引物，应用基因拼接技术，将SME2基因进行PCR扩增并突变。突变后基因的密码子使用频率均高于20%。突变后的序列克隆至pGEM-T-easy(promega公司产品)中，获得的克隆命名为pBSE2M。用于突变反应的模板为带有SME2基因的质粒载体，构建过程参考文献(中国兽医学报2005年V25(6):564566)进行。将突变后的序列克隆至pGEM-T-easy(promega公司产品)中进行测序验证，突变序列与设计序列一致(参见附图2.石门株E2基因原始序列与突变序列比对)。3.AcMNPV重组质粒的构建以pBSE2M为模板，用引物E2MFP(带有EcoRI酶切位点)、E2服P(带有Sail酶切位点)重新扩增，将扩增产物用EcoRI/SalI双酶切，和载体pMEL-HIS连接，转化筛选、测序鉴定。克隆序列与设计的目标序列一致，将构建的载体命名为pMEL-SE2M-HIS。(1)引物序列为E2MFP:AGTAGAATTCAGACTGGCCTGCAAGGAAGATTACAE2MRP:ACGTGTCGACCCAGTACTGATACTCGCCCTTCA(2)操作过程为1)2XpfuTaqDNApolymerasemix(Tianz公司产品)20W,E2MFP、E2MRP各1|4，无酶水补至40W，94。C预变性3min，94。C30sec，55。C30sec，72。Clmin,25cycles，最后72。C反应10min。2)将PCR反应产物电泳，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。3)将纯化回收的PCR产物及pMEL-HIS用EcoRI/Sail双酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收纯化。4)将双酶切及纯化回收的PCR产物及pMEL-HIS线性化载体连接，转化ToplO感受态细胞(Tianz公司产品)，涂板、挑斑筛选。5)将挑取的菌斑进行测序鉴定，证明pMEL-SE2M-HIS中克隆的序列正确。三、重组杆粒DNA将pMEL-SE2M-HIS转化DH10Bac构建出的杆粒DNA命名为pFBMEL-SE2M-HIS。1.试剂配制SOC培养基2%Bactotryptone,0.5%Bactoyeastextract,10.OmMNacl,2.5mMKCl，将以上组分高压灭菌后，加入滤菌的Mg2+溶液和葡萄糖溶液，调至浓度为20mMMgS0"MgCl2(10mMeach),20mM葡萄糖。LA—Bac抗性琼脂平板胰蛋白胨10g，酵母提取物5g,Nacl10g，琼脂12g，1000ml去离子水溶解，高压灭菌，冷却至55'C左右，加入卡那霉素至5(Htg/ml，庆大霉素至7^g/ml，四环毒至10|ag/ml，IPTG(IsopropylP-D-l-Thiogalactopyranoside)至鄭g/ml,Bluogal(5-Bromo-3-indolyl-P-D-galactopyranoside)至100Pg/ml。抗性LB培养基胰蛋白胨10g,酵母提取物5g，Nacl10g，1000ml去离子水溶解，高压灭菌，冷却至55。C左右，加入卡那霉素至50Hg/ml，庆大霉素至7Pg/ml，四环素至10Pg/ml。2.具体操作如下将DH10Bac菌(Invitrogen公司)37。C180r/min培养过夜，次日早取0.5ml3000r/min室温离心5min，弃上清，并将残液吸干。加入50ri克必隆常态转化液(天泽基因公司)和5WPMEL-SE2M-HIS质粒混匀，一20。C冷冻30min，取出后冰上静置10min，加入lmlSOC培养基，37°C180r/rain培养4h.取100rt涂LA—Bac抗性琼脂平板。37。C培养48h。取白斑接种5ml抗性LB培养基，37。C培养过夜。用碱裂解法提取杆粒DNA。PCR鉴定，测序结果与设计序列一致。四、转染及重组Ac丽PV的获得将重组杆粒PFBMEL-SE2M-HIS用转染试剂Cellfectin转染sf9细胞，扩大培养，收集培养上清进行PCR鉴定。证明获得重组AcMNPVVFBMEL-SE2M-HIS。1.试剂转染试齐U:cellfectin(Invitrogen)Grace，sInsectCellCureMedium(powder):GIBC0BRL公司，CatNo:11300-043FetalBovineSerum(FBS):Invitrogen公司，CatNo:26140_079水解乳蛋白(LactalbuminHydrolysate):GIBC0BRL公司，FormulaNo:89-50861N酵母提取物(YeastExtract):OXOID公司，L21TNM-FH培养基取Grace'sInsectMediumpowder(1L量)，水解乳蛋白3.333g，酵母提取物3.333g，NaHC030.35g，加三蒸水800ml，调至pH6.2，用三蒸水定容至1L。加青霉素至终浓度,g/ml，链霉素0.25Pg/ml,两性霉素B0.25Pg/ml，0.22Mm滤膜过滤除菌后加入10%FBS，分装，4。C保存备用。2.操作过程(1)将处于对数生长期的sf9细胞用弯头巴氏吸管吹散后转移至60mm组织培养皿中，吸附约0.5h。数量约2X1(T个细胞，约可铺满70%80%的面积。(2)准备转染液1)100WGrace培养基与cellfectin混合。2)100WGrace培养基与杆粒DNA混合。3)将l)、2)两部分液体轻轻混合，室温静置30min后加入800WGrace培养基，即为转染液。(3)小心地吸走60mm组织培养板上的培养基，并用Grace培养基轻轻漂洗两遍。并吸走所有培养基。(4)将转染液轻轻地全部加入到60mm组织培养板中，与sf9细胞室温作用4h。期间要轻轻摇动数次。(5)4h后将lmlTNM-FH加至60謹组织培养皿中，用封口膜封口后于细胞培养箱中27'C培养。转染后每天观察转染细胞单层的形态变化及生长特征，细胞出现明显的细胞病变，72h后收集上清，做为病毒基础种子液。记为P1Stock。(6)将重组病毒提取DNA进行PCR测序鉴定，序列正确，证明获得了Ac腦PVVFBMEL-SE2M-HIS。五、表达产物分析及鉴定将鉴定好的病毒传代扩大培养，第二代记为P2Stock,第三代记为P3Stock。前三代均做为种毒，取第4代培养上清包被进行ELISA鉴定。1.试剂配制包被液Nam1.59g,Na訊2.93g，溶于1L双蒸水。PBS:NaCl8.0g，KCl0.2g,K,0.2g，Na2HP042.83g，溶于1L去离子水中。Pi3SM:PBS中加入5%脱脂奶粉，用于封闭液。PBST:PBS中加入O.05%Tween-20，用于洗涤液。PBSTM:PBST中加入5X脱脂奶粉，用于稀释血清样本。TMB显色液显色液A:200mgTMB加入到100mL无水乙醇中，充分溶解。显色液B:,%2職14.6g、柠檬酸9.33g,加注射用水至900mL，调pH至5.05.4，补加注射用水定容至1000mL。工作液10mL显色液B加入9mL双蒸水，再加入lmL显色液A，混匀后加入50uL0.75%过氧化氢尿素溶液。终止液'2MH2S0"2.操作过程(1)取病毒培养上清，用包被液稀释50X，每孔包被100W，4x:过夜。(2)弃包被液，每孔加入PBSM30(￥1，37。C封闭40rain。(3)吸干，用PBST洗3次，每次300ri。(4)将猪瘟高免血清用PBSTM稀释500X，每孔加入100pl，37。C温育40min。(5)吸干，用PBST洗3次，每次300W。(6)将朋P标记二抗(Sigma公司)用PBSTM稀释2000X，每孔加入1OOnl，37。C温育30m丄n。(7)吸干，用PBST洗3次，每次300ri。(8)每孔加入IOOWTMB工作液，避光作用10min，加入50W终止液，450咖波长处测吸光值。3.结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4.结果判定AcMNPVVFBMEL-SE2M-HIS获得了分泌性表达，且与对照有明显的差异。至此，E2基因在杆状病毒表达系统得分泌性表达，对猪瘟病原免疫抗原的制备获得了突破性的进展。该表达产物具有开发猪瘟病毒检测ELISA试剂盒的潜力。六、诊断试剂盒的组装及使用1.试剂盒的组分试剂盒组成包括经抗原包被、封闭的ELISA板、服P标记McAb、阳性血清对照、阴性血清对照、IOXPBS、IOXPBST、脱脂奶粉、TMB显色液A和B、0.75%过氧化氢尿素溶液、终止液。2.组分的制备(1)抗原的制备病毒培养待sf9细胞铺满单层，弃培养基，接入重组病毒P3种子液至培养液的0.3%0.5%，2327'C培养至75。Z。CPE产生，收获病毒液。方法一收集病毒培养上清，用硫酸铵沉淀法浓縮，用分子筛层析，收集猪瘟病毒E2蛋白组份，测定蛋白浓度，分装后一80'C冻存备用。方法二收集病毒培养上清，加入O.1%的甲醛溶液灭活病毒，分装后一80'C冻存备用。方法三Ni离子柱HisTrapHP(GEHeathcare产品，17-5247-01)纯化。收集病毒培养上清，加入0.1%的甲醛溶液灭活病毒后，用Ni离子柱纯化，按产品说明书进行，获得的产物为E2重组蛋白，测定蛋白浓度，分装后一8(TC冻存备用。(2)试剂配制1)包被液Nam1.59g，NaHC(X2.93g，溶于1L双蒸水。2)PBS:NaC丄8.Og，KCl0.2g，KH2P040.2g，NaaHPC^2.83g,溶于1L去离子水中。3)PBSM:PBS中加入5%脱脂奶粉，用于封闭液。4)PBST:PBS中加入O.05%Tween-20，用于洗涤液。5)PBSTM:PBST中加入5W脱脂奶粉，用于稀释血清样本。6)TMB显色液显色液A:200tngTMB加入到lOOmL无水乙醇中，充分溶解。显色液B:Na與14.6g、柠檬酸9.33g,加注射用水至900mL，调pH至5.05.4，补加注射用水定容至1000mL。7)工作液10mL显色液B加入9mL双蒸水，再加入lmL显色液A，混匀后加入50uL0.75%过氧化氢尿素溶液。8)终止液2M貼04。(3)ELISA反应板的包被、封闭1)将抗原用包被液按一定浓度稀释后，包被ELISA板，每孔包被100W，4。C包被12h。2)用PBST洗涤3次，每次300W/孔，在洗板机上进行。3)用PBSM进行封闭，每孔300W，37。C封闭40min，用PBST洗涤3次，每次300W/孔，在洗板机上进行。4)将冊P标记标记McAb、猪瘟阳性血清和猪瘟阴性血清(均为中国兽医药品监察所制备供应)及其他成分分装成小份，一一放入试剂盒中，封闭，帖签，4'C保存。3.使用(1)猪瘟阳性、阴性和待检血清用PBSTM稀释25X，每孔加入100W，37。C温育40min。(2)吸干，用PBST洗3次，每次300W。(3)将HRP标记McAb用PBSTM稀释2000X，每孔加入100Ml，37。C温育30min。(4)吸干，用PBST洗3次，每次300W。(5)每孔加入IOOWTMB工作液，避光作用10min，加入50W终止液，450nm波长处读取吸光值。4.结果判定只有阴性对照的平均OD450nm大于0.5，阳性对照的阻断率大于50%，检测结果才有效。阻断率=(阴性平均值0D450nm—待检0D450nm)/阴性OD450nmX100%阻断率>40%为阳性阻断率<30%为阴性阻断率在30%40%为可疑。本发明涉及的苜蓿银纹夜娥核型多角体病毒(Autographacalifornicanuclearpolydedrosisvirus,AcMNPV)VFBMEL-SE2M-HIS株(2008年9月26日本病毒株已送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.2671)。图1构建含有猪瘟病毒pMEL-SE2M-HIS基因的重组核型多角体病毒技术路线图2石门株E2基因原始序列与突变序列比对SE2:石门株E2基因原始序列MUTSE2:石门株E2基因突变序列本发明的优点1本发明中所用的诊断抗原为猪瘟E2蛋白，是评价猪瘟免疫水平的主要蛋白。E2蛋白为猪瘟诱导产生体液免疫的主要优势抗原，抗体产生时间早，持续时间长。2应用基因拼接(Genesplicingbyoverlapextension)的方法对基因进行改造，速度快，准确性高。获得密码子优化的猪瘟病毒SM毒株不带TMR(跨膜区)的全长E2基因。3将蜂素肽基因MEL与目的基因6His重组，并在目的基因与6His之间引入一段柔性氨基酸接头，能够在连接的同时最大可能的保证两抗原间的空间结构，以保持蛋白的天然活性。4用猪瘟E2蛋白建立ELISA诊断方法，具有操作简便、快捷，所需试剂及实验条件简单的优点，并具有良好的特异性与敏感性，为猪瘟的诊断及免疫评价提供了良好的方法。本发明的积极效果使用本发明所涉及的试剂盒对猪瘟诊断及免疫评价快速、敏感、特异，可在2h内完成一次检测。〈110〉中国兽医药品监察所〈120>猪瘟抗体ELISA诊断试剂盒〈160〉7〈210〉1<211〉53〈212〉■〈213〉人工序列〈220〉〈223〉构建含信号肽及6XHIS纯化标签载体(pMEL-HIS)的所用引物MFP:〈400〉153<210〉2〈211〉53〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉构建含信号肽及6XHIS纯化标签载体(pMEL-HIS)的所用引物MRP:〈400>253〈210>3〈211〉56〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉构建含信号肽及6XHIS纯化标签载体(pMEL-HIS)的所用引物HFP:<400〉3<210〉<211><212><213><220><223><400〉451廳人工序列构建含信号肽及6XHIS纯化标签载体(pMEL-HIS)的所用引物HRP:451<210〉5<211>135<212>廳<213>人工序列〈200〉<223>pFastbacl中克隆的序列<400>5<210〉6<211〉35〈212〉廳<213>人工序列<220><223〉构建核型多角体病毒重组质粒所用引物E2MFP:<400〉6AGTAGAATTCAGACTGGCCTGCAAGGAAGATTACA35〈210〉7〈211〉33〈212〉DNA<213>人工序列<220>〈223〉构建核型多角体病毒重组质粒所用引物E2MRP:〈400>7ACGTGTCGACCCAGTACTGATACTCGCCCTTCA3权利要求1.一种猪瘟病毒的ELISA诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包括经重组苜蓿银纹夜娥核型多角体病毒CGMCCNo.2671制备的抗原包被、封闭的ELISA板、HRP标记McAb、阳性血清对照、阴性血清对照、10×PBS、10×PBST、脱脂奶粉、TMB显色液A和B、0.75％过氧化氢尿素溶液、终止液。2.如权利要求1所述的一种猪瘟病毒的ELISA诊断试剂盒，其特征在于重组杆状病毒CGMCCNo.的重组过程包括1)应用基因拼接技术扩增出蜂素肽基因信号肽序列、多肽接头序列及6XHIS序列的融合序列，并将此序列克隆至载体pFastbacl，构建了一个命名为pMEL-HIS的载体；2)应用基因拼接技术，将猪瘟病毒石门株E2基因SME2进行PCR扩增并突变，将突变后的猪瘟病毒E2基因序列用EcoRI/Sail双酶切，克隆至载体pMEL-HIS,转化筛选、测序鉴定。将构建的载体命名为pMEL-SE2M-HIS;3)将载体pMEL-SE2M-HIS转化大肠杆菌DH10Bac，与菌体中基因组重组后，经挑斑、PCR鉴定，转染Sf9细胞，产生编号为CGMCCNo.2671重组的苜蓿银纹夜娥核型多角体病毒VFBMEL-SE2M-HIS株。3.如权利要求1所述的一种猪瘟病毒的ELISA诊断试剂盒，其特征在于其包被抗原是将CGMCCNo.2671重组苜蓿银纹夜娥核型多角体病毒Sf9细胞的培养物，经过浓縮、纯化及鉴定，获得猪瘟病毒石门株E2基因可溶性表达抗原。全文摘要本发明涉及一种猪瘟病毒的ELISA诊断试剂盒。本发明是应用基因拼接技术在猪瘟病毒E2基因的两侧加上分泌信号肽序列和纯化标签，并嵌合至苜蓿银纹夜娥核型多角体病毒表达载体中，构建重组苜蓿银纹夜娥核型多角体病毒CGMCCNo.2671，获得包被ELISA板猪瘟病毒石门株E2基因可溶性表达抗原。使用本发明所涉及的试剂盒对猪瘟诊断及免疫评价快速、敏感、特异，可在2h内完成一次检测。文档编号G01N33/543GK101441217SQ20081022340公开日2009年5月27日申请日期2008年9月28日优先权日2008年9月28日发明者璐徐,琴王,范学政,赵启祖申请人:中国兽医药品监察所