专利名称：测定NT-proBNP的方法
测定NT-proBNP的方法
技术领域：
本发明涉及测定哺乳动物中的NT-proBNP或其片段的方法。
心房钠尿肽(ANP)、脑钠尿肽(BNP)和C型钠尿肽(CNP)属于这样的激素家族，所述激素可以由心房、心室和血管内皮细胞分泌。
所有钠尿肽在C-末端处都具有相同的由二硫键连接的17氨基酸的环状结构。这个部分负责它们的生物学活性。目前，已表征了3种受体，即ANP-A受体(特异于ANP和BNP ) 、 ANP-B受体(特异于CNP和ANP)和清除受体(clearance receptor) 。 BNP首次分离自猪脑，并且后来也在猪心脏中发现。在文献中已描述了，钠尿肽保护生物体免于液体过量和高血压。已在综述出版物中广泛描述了钠尿肽的生物学、生物化学和病理生理学作用。现在，钠尿肽作为用于在人中心脏病的诊断和治疗控制的血清标志物的价值已得到了充分证明。
在人中，主要由心室分泌的BNP的成熟形式从高分子前阶段(即proBNP (1-108))形成。在生理学上有活性的C-末端肽，即proBNP(77-108 )(也称为BNP-32)，由32个氨基酸组成，在血浆中循环的N-末端形式由76个氨基酸组成(NT-proBNP (1-76))。此外，还已描述了 pre-proBNP的片段8-29和31-57，其中特别地，用于测量NT-proBNP 1-76的片段8-29的测定提供了类似的临床数据。
心脏病不仅在人中起重要作用，动物，尤其是宠物例如犬和猫，或者有用动物例如马，也受这些疾病的折磨。患有心脏病的马一般不是非常健康的，它们快速出汗，它们的脉搏增加，它们呼吸短促或发热。所有马中大约0. 3%具有先天性心脏缺陷，它们的动脉可以运输比健康状态下更少的氧。然而，在大多数情况下，心脏问题在生命过程中发展，心律失常频繁发生，但在静止状态下大多数是正常的。病理性心律失常是可以由缺氧或感染引起的心肌损伤的征兆。心肌的炎症被称为心肌炎。如果心肌纤维的化学结构发生改变，那么心脏将不再能够适当地泵血，人们称之为心肌病。心内膜的炎症由通过血液，例如经由发炎的蹄或关节到达心脏的细菌引发。在心包膜积液的情况下，水通过血管壁进入心包膜。通常，对心脏问题不进行治疗将导致心功能不全。在轻度情况下，循环将会具有平衡效应，在重度情况下，预期会出现心力衰竭。在患有心脏右半部分的瓣膜缺损的马中，保留在
器官中的血液将导致肝硬化。心脏病由兽医借助于听诊、超声学或ECG来进行诊断。最初，马不应当经历任何应激，并且理想地，它应当,皮圏留在开放的马厩或外部的运马用带顶拖车中，从而使得给心脏供应大量的氧。心脏病的治愈或治疗分别可能花费非常长的时间，治疗在任何情况下将花费4-6周。某些马可以永久治愈，其他马在药疗法停止时将会出现复发。然而，即使在治愈的情况下，也不再能够从所迷马要求得到最大性能。由于心脏能够最初通过更努力地工作来抵消功能障碍，所以此类疾病在大多数情况下将仍是无法检测的，后果是心脏状态将由于增加的心脏运转而恶化。当动物的心脏不再能够补偿虛弱时，在大多数情况下将能够识别出由于心脏病而引起的症状，例如疲劳、循环功能不全、疲倦。在此种情况下，心脏病已进展得如此之远，从而几乎不可能完全治愈。因此，尽可能早地在马中诊断出心脏病将具有极大的重要性，并且可以避免不可挽回的损伤，或甚至防止
在运动中所使用的马不得不无法取消地被禁止参与涉及赛跑和锦标赛的运动。
心脏瓣膜和心肌的慢性改变通常是无法治愈的，心脏病的再进一步的进展可以通过使用药物来减慢。也出于该原因，发展中的心脏病的早期诊断是重要的。常规地，主要是将物理方法用于这个目的，例如心音的听诊、心电图的记录、X射线和超声波检查。这些检查方法主要具有下述缺点它们只有在已可看见或可听见的心脏损伤能够被
直接检测之后才能进行。此外，物理检查方法需要合适和普遍昂贵的
装置以用于作出合适的诊断。
总体上，马的心脏病高度类似于在人中的类似疾病。在许多心脏病，例如心功能不全、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、左心室肥大和功能障碍中，释放出BNP。这种激素引起经由肾的液体的分泌，并因此调节心血管系统。因为这种肽在心脏中产生，并且在心脏受到过度紧应激和充血时越来越多地产生，所以血液中BNP水平的检测是用于评估心功能不全的合适方法。
也如同其他钠尿肽一样，BNP在调节水平衡和血压方面起重要作用。如果使心脏壁伸展，那么它释放更多的BNP,这导致经由肾的钠和液体的分泌，并且导致血管的扩张，总而言之，这能够降低血压并且充填心脏。BNP由心肌细胞作为proBNP来合成，proBNP最终被切割成N-末端的proBNP和BNP。 BNP的这两个部分净皮分泌到血液中，并且可以在其中被检测到。
一般地，动物中的心脏病在下列相关的出版物中进行了讨论Bright JM和Cali JV， J Am Vet Med Assoc 2000, 216:1110-4;Guglielmini C， Vet Res Commun 2003， 27 Suppl 1:555; Bos謂d A等人，J Small AnimPract 2003， 44:104-8; Takemura N等人，J VetMed Sci 2003， 65:1265-7; Mac-Donald KA等人，J Vet Intern Med2003， 17:172-7; Greco DS等人，Can Vet J 2003， 44: 293-7; MonnetE等人，J Am Vet Med Assoc 1997， 211: 569-72; Hamlin RL等人，JVet Intern Med 1996， 10: 85-7; Gaschen L等人，J Vet Intern Med
1999, 13:346-56。
借助于其可以在个体血清中分别检测出人proBNP或其片段的多
种方法是现有技术中已知的。EP 0 648 228 Bl、 WO 03/87819和FR 2
843 396在此处可以作为例子而提及。
在US 2004/0018577中，一^开了包括至少三种抗体的免疫测定法，所述抗体都能够结合分析物的不同表位。此处，待检测的分析物特别涉及关于心脏病的标志物的检测，其中 一般还可以检测BNP和proBNP。
Biondo A. W.等人(Vet, Pathol. 2003， 40 (5): 501-506 )描述了借助于多克隆抗体来检测猫中的ANP和BNP的方法，所述多克隆抗体分别针对包含氨基酸1-28的ANP的肽，和针对包含proBNP的氨基酸43-56的肽。在EP 1 016 867 Al中，描述了用于检测哺乳动物中的preproBnP的免疫测定法。此处，使用针对包含人BNP的氨基酸27-102、 73-102和27-64的肽的抗体。
Jortani S.A.等人(Clin. Chem. 2003， 50 (2): 265-278 )描述了 BNP及其前原形式和原形式作为关于心脏病的可能标志物的用途。这篇文章未提及任何适合于检测马中的心脏病的BNP的优选肽区域。
在W0 2000/35951中，公开了几种针对其可以产生抗体的肽，所述抗体适合于诊断心脏病的方法。此处，/〉开了包含人Nt-pro-BNP蛋白的氨基酸1-13、 37-49和65-76的三种肽，其也可以用于产生针对这些肽的抗体。
在WO 2006/027374 A中，^>开了用于犬和猫的特异性BNP测试。已显示，借助于其中所公开的抗体，还可以在某些其他动物中检测BNP，然而迄今为止无法提供马BNP的特异性检测。
在Mifune H等人(Anat. Embryol. (Berl) 192 (1995): 117-21 )中，描述了检测马心脏的心房中的免疫反应性ANP和BNP肽的方法。
在EP 1 557 431 Al中，公开了定量人BNP的方法，其中使用针对包含人BNP的氨基酸残基5-13、 1-10、 15-25和17-32的表位的抗体。
Richter R.等人(Acta Anat (Basel) ， 162 (1998): 185-93 )描述了在马心脏中ANP的定位。
此外，分别用于检测人proBNP及其片段的几种测试试剂盒正在进行销售(例如，来自Roche和Biomedica )。然而，不存在有借助于其可以在马样品中特异性地测定proBNP的已知方法。因此并且由于成本密集且复杂的马的体格检查，本发明的目标是提供分别用于在来自马的样品中测定proBNP及其片段的合适工具。特别地，以此将使得能够及时诊断早期的心脏病。
因此，本发明涉及测定马NT-proBNP或其片段的方法，所述方法
包括下述步骤
-提供马样品，-使该样品与至少一种特异性地结合马NT-proBNP的抗体接触，
和
-测定该样品中存在的马NT-proBNP或其片段的存在情况和/或浓度。
采用本发明，提供了马NT-proBNP的测定，因为公开了针对这个物种的特异性抗体。以这种方式，可以达到有效且早期地诊断马中的心脏病，该诊新是高度相关的。
优选地，在马NT-proBNP或其片段的测定中，所述至少一种抗体结合来自SEQ ID No. 1的(当然，马特异性的)NT-proBNP表位，特别是选自具有下列序列的表位的表位PLGGLGPASEQS(SEQ IDNo. 3)、PASEQSGIQELL ( SEQ ID No. 4 ) 、 LLDRLGDSVLEP ( SEQ ID No. 5)、SVLEPQAE匿L ( SEQ ID No. 6 ) 、 PQAERMTLEPLQ ( SEQ ID No. 7 )、EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 ) 、 LQQDRGPAEASE ( SEQ ID No. 9 )、DRGPAEASETRG (SEQ ID No. 10) 、 PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11)、RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12) 、 LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13)、PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14)或LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15)。
优选地，在马NT-proBNP或其片段的测定中，另外还使用对于马NT-proBNP非特异性的至少一种NT-proBNP抗体。
根据本发明方法的一个优选的实施方案，另外还使用对于马pre-proBNP特异性的至少一种抗体，特别是特异性地结合来自SEQ IDNo. l的至少一种表位的抗体，所述表位选自具有序列SPK薩RNSGCFG(SEQ ID No. 16)或DRIGSFSGLGCN (SEQ ID No. 17)的表位。
应当指出，马NT-proBNP序列和proBNP序列分别作为关于整个马科的例子而提及，由此，本文公开的序列也包括偏离本文7>开的序列的在这个科其他属动物的proBNP序列中的各个氨基酸，只要这些偏离氨基酸不以使得特异性结合不再可能的方式与本文公开的抗体的表位相关。本文公开的关于其他物种的氨基酸序列已在公共数据库中公开。
在根据本发明的方法中所使用的样品包括液体样品，例如血液、尿，还有组织样品，例如心脏肌肉系统或脑的组织切片。需要时，可
10以适当地制备样品，例如以便有助于样品随后与本发明抗体的接触或
者使得样品随后与本发明抗体的接触成为可能。因此，包含proBNP、NT-proBNP或其片段的级分分别可以由血液样品提供，或者组织样品可以例如进行匀浆并且同样地与非蛋白质级分相分开。
至少一种抗体与样品中的马NT-proBNP的表位的结合表示，所述抗体能够结合在特定蛋白质的指定序列区域中的表位，除了该指定区域之外，这种抗体不能特异性地结合该蛋白质的表位。
根据本发明，能够结合马特异性表位的抗体可以用于测定NT-proBNP和proBNP或其片段。然而，可能有利的是，使用数种(例如，2、 3、 4或5种)能够结合NT-proBNP的不同表位的抗体。
可以通过现有技术中已知的方法来测定样品中存在的马NT-proBNP或其片段的存在情况和/或的浓度。例如，在此处应当分别提及在液体样品中施行酶免疫测定法(例如ELISA)或者在组织样品中施行免疫组织化学方法。
根据本发明的"抗体"还包括能够识别根据本发明的表位的抗体的片段。因此，抗体可以例如仅由具有抗原结合位点的F(ab)部分组成。这些抗体片段可以进一步是双特异性抗体或异微型抗体(heterominibody)的一部分(参见例如，EP 1 100 830 Bl)。
根据本发明的"NT-proBNP或其片段"包括所有这样的NT-proBNP片段，所述片段在体内形成或在体外产生(例如，通过将样品与蛋白酶或化学物质例如CNBr相混合)，并且具有根据本发明的表位。
在根据本发明的方法中，可以使用数种能够特异性地结合马proBNP上的数种不同表位的抗体。为此，根据本发明可以使用至少一种能够结合至少一种表位的抗体。此外，此处应当提及，本文所示的氨基酸区域不必要仅具有一种表位，而是依赖于其大小还可以包含数种表位。因此，根据本发明的方法包括使用能够特异性地结合至少一种表位的数种抗体的组合。
根据一个优选的实施方案，所述至少一种抗体是多克隆的和/或单克隆的。当然，根据本发明，完整抗体的功能性变化形式、其片段或衍生物也由本领域技术人员归于术语"抗体"之下，或者被理解为等价于所述抗体的药剂。
在根据本发明的方法中所使用的抗体可以是多克隆的，也可以是
单克隆的。为了产生这些抗体，使用包含本文公开的马proBNP的氨基酸区域的肽片段。这些肽片段可以合成产生(Merri-f ield R. P. , 1963，J Am. Chem. Soc 85， 2000， 149)，重组产生，或者通过重组或天然来源的proBNP的化学或酶促降解来产生。依赖于其大小，从中回收的肽将被结合至免疫原性栽体(例如KLH)，或者直接用于产生多克隆或单克隆抗体(例i。， K6hler G.和Milstein C， 1975， Nature256: 495; Galfre等人，1977， Nature 266:550 )。根据本发明，也可以重组产生抗体。产生重组抗体的方法是本领域技术人员充分已知的(参见,例如,Sambrook等人，Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 2001)。
根据进一步的优选实施方案，至少一种另外的抗体与所述至少一种抗体或所述至少一种表位结合，由此，例如根据本发明的测试可以作为夹心式观'J定法(sandwich assay)来进行。
另外的抗体与所述至少一种抗体的结合使得能够分别定性和定量地测定后者，并且间接地测定结合至所述至少一种抗体的表位。如果所述至少一种另外的抗体与所述至少一种4^位结合，那么经由酶免疫测定法可以定性和定量地测定所述至少一种抗体与所述至少一种表位的结合，如果例如所述至少一种抗体固定在固相上。
优选地，所述至少 一种抗体和/或所述至少一种另外的抗体是经标记的。
在这种情况下，所述至少一种抗体和/或所述至少一种另外的抗体通过下列物质进行标记酶，例如过氧化物酶，特别是辣根过氧化物酶，生物素，荧光染料，特别是荧光素(FITC， DFTF) , R-藻红蛋白(PE ),多甲藻-叶绿素-蛋白(PerCP )和串接缀合物(tandemconjugate),例如PE-Cy5或PE-德克萨斯红，胶体金或放射性核素。通过标记这两种抗体之一，分别地，可以通过次级反应来测定或者还可以直接测定与所述至少一种表位相结合的经标记的抗体的存在
情况和浓度。而所述抗体本身可以通过A蛋白缀合物(例如，A蛋白-金缀合物)来检测。
根据一个优选的实施方案，将所述至少一种抗体或所述至少一种另外的抗体结合至固相。
通过所述至少一种抗体或所述至少一种另外的抗体的所述结合，可以产生例如抗体芯片、包被的微量滴定板或侧流装置(lateral flowdevices),它们可以在多种方法中4吏用。
优选地，马proBNP或其片段的测定通过选自下列的方法来进行放射免疫测定法、免疫结合测定法、Western印迹、免疫组织化学、酶免疫测定法、侧流装置(LFD，测试条(test strips))及其组合。
上述方法是本领域技术人员充分已知的。这些方法的综述可以例如在"Bioanalytik" ( Lottspeich和Zorbas， Spektrum Verlag 1998 )中找到。侧流装置(LFD，测试条)已公开在例如冊02/059567中。
根据进一步的方面，本发明还涉及特异性地结合马NT-proBNP的抗体或抗体混合物。根据本发明，"特异性地结合"意指马形式的该蛋白质被这些抗体特异性地识别，并且这些抗体不结合其他物种的proBNP。在这种情况下，如果抗体在可由本领域技术人员容易地决定的某些条件下显示出这种特异性，则是足够的，即使在较不严格的条件下(在抗原/抗体结合测定法中)，这种特异性不存在。特别地，根据本发明，"特异的"意指根据本发明的抗体或抗体混合物(例如，多克隆抗体制备物或者识别不同表位的单克隆抗体的混合物)分别在结合测定法中能够将马NT-proBNP与人、鼠类、大鼠、猪、牛科动物、犬科动物、猫科动物或绵羊proBNP区分开(即，分别地，牵涉不同的结合，或者专一地结合马preBNP)。
优选地，根据本发明的抗体或抗体混合物特异性地结合来自SEQID No. 1的至少一种表位，所述表位选自具有下列序列的表位PLGGLGPASEQS (SEQ ID No. 3) 、 PASEQSGIQEIX (SEQ ID No. 4)、LLDRLGDSVLEP ( SEQ ID No. 5 ) 、 SVLEPQAE匿L ( SEQ ID No. 6 )、PQAE薩LEPLQ ( SEQ ID No. 7 )， LQQDRGPAEASE (SEQ ID No. 9)、 PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11) LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13) LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15)
EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 )、 DRGPAEASETRG ( SBQ ID No. 10)， RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12)、 PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14)、 SP薩RNSGCFG (SEQ ID No. 16)
或DRIGSFSGLGCN (SEQ ID No. 17)。与本文提及的马特异性表位的 特异性结合通过根据本发明的抗体来达到，优选以较大的多肽，主要 以马pre-proBNP、 proBNP、 NT-proBNP或BNP。在这种情况下，根据 本发明的抗体不牵涉与其他物种的相应同源多肽的任何显著结合，至 少在足够严格的条件下不显著结合(即，诸如通常在BNP的临床免疫 诊断方法中使用的那些条件)。根据本发明的抗体优选地通过表位特 异性亲和层析或作为表位特异性单克隆抗体来产生(在每种情况下， 通过使用表位作图)。
根据进一步的方面，本发明涉及具有根据SEQ ID. No. 1的氨基 酸序列的多肽或其特异性片段，特别是SEQ ID. No. l的氨基酸8-113、 8-81和82-113。氨基酸1-7不再存在于pre-proBNP中(信号序列)； 成熟的马BNP激素从氨基酸82 (S)处开始。SEQ ID No. l的"特异 性"片段是这样的片段，所述片段与已知pre-pro-BNP序列相差至少 一个氨基酸残基，并且包含至少7个，优选至少8个，特别是至少10 个氨基酸。特别优选的本发明片段优选地包含选自下列的一个或多个 表位PLGGLGPASEQS (SEQ ID No. 3) 、 PASEQSGIQELL (SEQ ID No. 4 ) 、 LLDRLGDSVLEP ( SEQ ID No. 5 ) 、 SVLEPQAE丽L ( SEQ ID No. 6 )、 PQAERMTLEPLQ ( SEQ ID No. 7 ) 、 EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 )、
LQQDRGPAEASE (SEQ ID No. 9)、
PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11)
LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13)
LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15)
DRGPAEASETRG (SEQ ID No. 10)、 RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12)、 PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14)、
,SPKMMRNSGCFG (SEQ ID No. 16)
或DRIGSFSGLGCN (SEQ ID No. 17)。
因此，本发明还涉及具有选自下列序列的氨基酸序列的多肽PLGGLGPASEQS ( SEQ ID No. 3 )，
LLDRLGDSVLEP ( SEQ ID No. 5 )，
PQAERMTLEPLQ ( SEQ ID No. 7 )、
LQQDRGPAEASE ( SEQ ID No. 9 )、
PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11)
LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13)
LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15)
PASEQSGIQELL ( SEQ ID No. 4 )、
SVLEPQAERMTL ( SEQ ID No. 6)、
EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 )、
DRGPAEASETRG (SEQ ID No. 10)、
RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12)、
PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14)、 SPKMMRNSGCFG (SEQ ID No. 16)
或DRIGSFSGLGCN (SEQ ID No. 17)。
根据一个优选的实施方案，本发明的多肽分别是化学合成的，或 从样品中分离的，或重组产生的。
为了合适地从分离自样品或重组产生的肽中产生所述表位，可以 通过本身已知的酶促或化学方法来进行进一步加工所述肽。根据本发 明的多肽也可以作为与另外的分子的缀合物来提供，优选地在所述肽 的N-或C-末端处与另外的分子的缀合物，特别是与并非天然地和本发 明多肽相连接的另外多肽的缀合物。
本发明的进一步的方面涉及根据本发明的抗体或抗体混合物在根 据本发明的方法中用于测定马NT-proBNP或其片段的用途。 本发明的肽可以以经标记的形式用于竟争性免疫测定法。 优选地，根据本发明的肽用于产生抗体或抗体混合物。 此外，根据本发明的肽在根据本发明的方法中用作阳性对照或用 作用于浓度测定的标准。
本发明的进一步的方面涉及用于测定马NT-proBNP或其片段的试 剂盒，其包含至少一种根据本发明的抗体或者至少一种根据本发明的 抗体混合物；用于定性和/或定量地检测所述至少一种抗体或所述至少 一种抗体混合物与马NT-proBNP或其片段的结合的工具；和任选地， 作为阳性对照或作为用于浓度测定的标准的根据本发明的肽(即，马 proBNP或其片段)。
根据本发明，所述试剂盒可以包含至少一种另外的抗体。 该另外的抗体具有对于所述至少一种抗体的亲和性或者还有对于所述至少一种表位的亲和性。
根据一个优选的实施方案，所述至少一种抗体和/或所述至少一种 另外的抗体是经标记的。
优选地，所述标记包括酶，例如过氧化物酶，特别是辣根过氧 化物酶，生物素，荧光染料，特别是荧光素(FITC, DFTF) , R-藻红 蛋白(PE)，多甲藻-叶绿素-蛋白(PerCP)和串接缀合物，例如PE-Cy5 或PE-德克萨斯红，胶体金或放射性核素。
本发明的进一步的方面涉及本发明的试剂盒在测定马proBNP的 方法中的用途。
根据进一步的方面，本发明涉及重组产生本发明的多肽的方法， 其中将编码这些多肽的核酸引入合适的宿主生物中，以本身已知的方 式由所述宿主表达所述多肽，并且回收所表达出的多肽。这些方法是 本领域技术人员已知的，并且包括合适的宿主、表达系统和就这样回 收所述多肽的方法。
另一方面，本发明的多肽也可以是化学合成的，优选经由固相方 法(Merryfield)。同样地，关于此，本领域技术人员可用许多本身 已知的方法。
本发明还涉及本发明的抗体用于在马中诊断心脏病的用途。在这 种情况下，抗体可以在已知用于人的装置(set-up)中使用。本发明
的多肽也可以例如用作标准、比较用样品，或者用于滴定仍未反应的抗体。
将通过下列实施例和附图更详细地说明本发明，然而并不局限于此。
图1显示了各个物种的已知BNP序列(SEQ ID No. 32-39 )相比
于根据本发明的序列而言的比对；
图2显示了马pre-proBNP变体(SEQ ID No. 40-45 )的i殳计；
图3显示了各个物种的pre-proBNP的比较结构分析；
图4显示了马pre-proBNP ( eq-pre-proBNP )的最可能变体的结
构分析；图5显示了 eq-pre-proBNP的分离；
图6显示了在1. 2%琼脂糖凝胶上的总RNA的分析M) GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas) , 150 ng; 1)总RNA，心脏的右半部 分，lug; 2)总RNA，心脏的左半部分，lyg;
图7显示了在1. 2。/。琼脂糖凝胶上的ds cDNA的分析M) GeneRuler 腿Ladder Mix( Fermentas ) ， 150 ng; 1)来自马心脏组织的ds cDNA, 120 ng;
图8显示了来自马的pre-pro-BNP的cDNA的部分序列；
图9显示了由各种钠尿肽的序列而获得的系统树；所比较的钠尿
肽的各自氨基酸序列得自相关的序列数据库；
图IO显示了对于各个物种的NT-proBNP而言，NT-proBNP-抗血清
的特异性。
实施例
实施例1:
人马； re-; roJy^y^^/^设 yv
尽管已经阐明了类似于人pre-proBNP的某些物种(犬、猫、牛) 的那些分子的氨基酸序列，但迄今为止无人能够分离出马的 pre-proBNP并且对其进行表征。这可能是由于不同动物物种的 pre-proBNP分子的低的序列同源性(图1)。因此，已开发了可以相 应于马的pre-proBNP的氨基酸链段的序列。先前公开的其他物种的 pre-proBNP分子的序列并未使得这些序列显而易见，因为，如已经提 及的，这些序列仅存在微小的相关性。已通过新方法选择出了具有假 设的序列变体的最有希望的那些(图2)，在所述新方法中借助于蛋 白质组学输入来对所述序列实施分子分析。
在这样做时，在某些区域中具有经建立的序列的一些变体令人惊 讶地显示出所谓的识别因子(recognition factor)的显著相关性，
这暗示了这些结构的高度的分别在结构和功能上的保守性，并因此暗示了关于所述序列变体的正确性而言的高度可能性。图3给出了所施 行的分子分析的概况。图4显示了对于最可能的序列变体的类似的结 构分析。
因为识别因子图中的峰相应于具有高度的抗原性和表位可用性的 区域，所以推断，针对区域1-20和45-55的抗体应当适合于制备马 eq-pre-proBNP。产生此类抗体，并且用它们来分离下文描述的分子。
么^Cj&清辦务马AV尸；
借助于免疫亲和层析来纯化马pre-proBNP，并且在竟争性ELISA 中进行检测。
将马血清在2000 rpm下离心10分钟，并且在添加1 ml/1
Proclin300后j^存于-20。C。
给链霉抗生物素蛋白-Sepharose (AMERSHAM)加载纯化的生物素
化的S2190抗体AA 45-55。(柱参数100 m g抗体/ml链霉抗生物素
蛋白-Sepharose)。洗脱参数结合緩沖液，0.05M硼酸盐，pH 8. 0;
洗脱緩冲液，0.1 M甘氨酸緩冲液，pH 2.0， 0.5 ml/分钟。 义借勿于f爭遂^趁^ ^-; re-;7roAV尸； 通过使用针对序列1-20的抗体在ELISA中检测回收的
eq-pre-proBNP。将相应序列的经过氧化物酶标记的肽用作示踪分子。
图5显示了免疫反应性与亲和层析的洗脱特性曲线图的相关性。
由于该可良好测量的免疫反应性，因而假定eq-pre-proBNP事实
上已得到分离，并且基于测定出的部分序列，进行eq-pre-proBNP的
分子生物学扩增(4)。
《^C^《马心處逸织W^ ) W哞^"增w;7re-/;roAV/V 趟始#辨
在RNALater中，具有来自马的心脏组织的两个小管，分别将它们 命名为"右"和"左，，。 ,g WW的为、庠
根据生产商的说明书，用来自Quiagen的RNeasy Fibrous Tissue Midi Kit来分离总RNA。将来自心脏的左半部分和右半部分的各200 mg组织分别用于分离。
在1. 2%琼脂糖凝胶上分析总RNA的品质(图6 )。 c細合底.
才艮据生产商的说明书，用来自BD Biosciences的Library Construction Kit来进行第一链cDNA的合成。作为模板，使用1/i g 的总RNA。使用5' PCR引物和CDS III/3' PCR引物，通过PCR扩增 (15个循环)来制备双链cDNA (ds cDNA)。
在1. 2%琼脂糖凝胶上分析ds cDNA的品质(图7 )。
m ,增；
通过所给出的参考序列，得到几种PCR引物。对于proBNP基因的 3'末端的扩增，使用基因特异性正向引物和3' cDNA合成引物。对于 5'末端的扩增，使用基因特异性反向引物和覆盖SMARTIV寡核苷酸的 3'区域的引物。
经由制备型琼脂糖凝胶来分开特异性PCR产物，并且从凝胶中切 出所述片段。根据生产商的说明书，用来自Macherey-Nagel的 NucleoSpin Extract II Kit来分离所述DNA。
所述PCR片段各自用基因特异性引物进行测序。用程序SeqMan (腿Star Lasergene Sof tware )对序列数据进行^修整，并且将所获 得的序列与来自Genbank数据库的核苷酸和蛋白质序列进行比较。
将显示出极佳的与proBNP序列的同源性的PCR片段克隆到质粒 pAllilO中。分离出几个克隆的质粒DNA，并测序。用程序SeqMan来 对序列数据进行修整，去除载体序列，并且装配所获得的序列。鉴定 出不同长度的转录物。这是由于转录物各自在不同位置处被多腺苷酸 化。所得到的共有序列相应于最短的转录物，并且显示在图6中。
为了扩增proBNP特异性PCR片段，使用27聚体 (5'-CTCCTGCTCCTCCTSTTCTTGCACCTG-3' ( SEQ ID No. 18))。字母 S表示核苷酸C或G。在所述克隆中发现了这两种变体。因此，所获得 的序列的前27个核苷酸(9个氨基酸)不能被认为是确定的，因为它
19们不由引物预先决定。因此，来自马的pre-proBNP的推导出的氨基酸 序列可以如下所示
SPLGGRSYPL GGLGPASEQS GIQELLDRLG DSVLEPQAER MTLEPLQQDR GPAEASETRG AAPTGVLGPR TKVLQALRGL RSPKMMRNSG CFGRRLDRIG SFSGLGCNVL RRY (Seq.ID.No.1)
马proBNP序列如下所示(活性BNP激素加有下划线)；因此， NT-proBNP序列由SEQ ID No. 2的未加下划线的部分组成
YPLGGLGPAS EQSGIQELIiD RLGDSVLEPQ AERMTLEPLQ QDRGPAEASE TRGAAPTGVL GPRTKVLQAL RGLRSPKMMR NSGCFGRR!LD RIGSFSG!LGC NVLRRY (Seq.ID.No.2)
为了扩增该前肽的完整的5'末端，合成了 22种序列特异性反向 引物，并且在各种条件下进行PCR扩增。获得特异性PCR片段并测序， 然而无法测定出该前肽的5'序列。可能，不能扩增5'末端，因为总 RNA显示出降解的征兆。可能，proBNP的5'末端已被降解。
借助于ClustalW方法，在程序MegAlign (DNAStar Lasergene Software)中将根据SEQ ID No. 1的氨基酸序列与类型A、 B和C的 钠尿肽的各种序列进行比较。在系统树中图解说明了所检测出的序列 的系统发生关系(参见图9)。图9显示了，来自马的proBNP位于B 型钠尿肽的簇群中，并且展示出最高的与来自猪的肽序列的同源性。
乂本发'^^拔伴时橫弄^:
本发明抗体的特异性的主要特征在于，它们能够经由马 pre-proBNP中的独特表位而将马分子与其他已知物种(人、小鼠、大 鼠、猪、牛、犬、猫和绵羊)的同系物区分开。
关于表位PLGGLGPASEQS ( SEQ ID No. 3)的特异性例如表示，本 发明的抗体结合这个表位，而不结合或以显著(-例如在ELISA中可 区分)更低的亲和力结合下列序列PLGSPGSASDLE (人)(SEQ ID No.19) ， PLGSPSQSPEQF (小鼠)(SEQ ID No. 20) , PLGSPSQSPEQS (大 鼠)(SEQ ID No. 21) , PLGGAGLASELP (猪)(SEQ ID No. 22)， PLGGPGPVSELP (牛)(SEQ ID No. 23) , PLGGRSPASEAS (犬)(SEQ ID No. 24 ) ， PLGGPGPASEAS (猫)(SEQ ID No. 25 )和PLGGPGSASELP (绵羊)(SEQ ID No. 26)。对于下列其他优选的表位而言，类似地 保持这一含义PASEQSGIQELL (SEQ ID No. 4) ， LLDRLGDSVLEP (SEQ ID No. 5 ) ， SVLEPQAE丽L ( SEQ ID No. 6 ) ， PQAE丽LEPLQ ( SEQ ID No. 7 ) , EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 ) ， LQQDRGPAEASE ( SEQ ID No. 9) ， DRGPAEASETRG (SEQ ID No. 10) ， PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11) ， RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12) ， LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13) , PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14) ， LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15 ) , SPKMMRNSGCFG ( SEQ ID No. 16 )或DRIGSFSGLGCN ( SEQ ID No. 17)(各自与根据图1的序列进行比较)。与本文提及的马特异性表 位的特异性结合通过本发明的抗体来达到，优选地在与较大的多肽结 合的范围内，主要是与马pre-proBNP、 proBNP、 NT-proBNP或BNP结合。
实施例2:
实验目的
验证所产生的针对马NT-proBNP的绵羊抗血清的"物种特异性"。 才法..
测试马抗血清与来自其他物种的NT-proBNP的反应性。 平板的包被
将来自各个物种的重组NT-proBNP( 1 ja g/ml， 200 u g/孔，pH 9. 6, 0.02 M碳酸盐緩冲液)于4。C在微量滴定板上包被过夜。洗涤平板， 并用封闭緩冲溶液(包含2%蛋白胨(w/v)和0. 1% (w/v)脱脂奶粉的 10 mM PBS pH 7. 4)封闭1小时。
吸出封闭溶液，并将平板在3(TC下干燥过夜。組5^-橫举程y^
在0. 1 M PBS， pH 7. 3中以1: 10000稀释针对马NT-proBNP的抗 血清，并且将200 m 1这种溶液施加在已用重组NT-proBNP包被的平板 上。在环境温度下温育2小时后，洗涤平板，并且使200 y 1兔抗绵羊 -HRP缀合物掺混30分钟。再次洗涤平板，并与200 y 1四甲基联苯胺 (TMB) —起温育IO分钟。用50iil 0. 1M硫酸来终止反应，并且用 标准的微量培养板阅读装置于450 nm处测量光密度。
潜^z
用下文所示的序列(人proBNP， SEQ ID No. 27;小鼠proBNP， SEQ ID No. 28;大鼠proBNP， SEQ ID No. 29;猫proBNP， SEQ ID No. 30;马proBNP， SEQ ID No. 31)来测试与下列物种的重组NT-proBNP 的反应性。proBNP，2345678970727375 Z61778，920
人HPLGSPGSASDLETsGl_QEQ
小鼠YP匕GsPSQSPEQFKMQK匕LE
大鼠HPLGsPSQSPEQSTMQKLLE
猫HPl_GGPGPASEASA1QEl_
马YPLGGLGPASEQsGIQEL
272223242526272829303338
人RNHLQGKLsELQVEQTsLEP
小鼠■L1REKSEEMA
大鼠L1REKSEEMAQRQLSKDQGP
猫匕DGl_RDTVSELQEAQMAl_GP
马DRLGDSVLEPQAERMTLEP
4243454647484950 5254555657585960
人QEsPRPTGVwKsREVATEG
小鼠QRQLl_KDQGl_TKEHPKR
大鼠TKELl_VLRSQDSAFRIQE
猫LQQGHSPASWEAQEPPAR
马LQQDRGPAEASTRGAAPTG
626364656667686970777273747576
人，RGHRKMVLYTlLRAPR
小鼠VLRSQGSTl_RVQQRPQ
大鼠RLR
猫VLAPHDNVLRA匕RRl_G
马V匕GPRTKVl_QALRGLR
将抗血清与固定的NT-proBNP分子的相对亲和力与关于马 NT-proBNP而言的抗原的亲和力相联系(与马NT-proBNP的亲和力-100%)
人猫大鼠小鼠马
相对亲和力2%7%5%1%画
潜论,
所形成的绵羊抗马NT-proBNP抗血清是特异性的，其仅显示出微小 的与人、猫、大鼠或小鼠NT-proBNP的交叉反应性。
2权利要求
1.测定马NT-proBNP或其片段的方法，所述方法包括下列步骤-提供马样品，-使该样品与至少一种特异性地结合马NT-proBNP的抗体接触，和-测定该样品中存在的马NT-proBNP或其片段的存在情况和/或浓度。
2. 根据权利要求l的方法，其特征在于，在马NT-proBNP或其片 段的测定中，所述至少一种抗体特异性地结合来自SEQ ID No. 1的至 少 一种特异性NT-pr oBNP表位，特别是选自具有下列序列的表位的表位 PLGGLGPASEQS ( SEQ ID No. 3 ) 、 PASEQSGIQELL ( SEQ ID No. 4 )、 LL亂GDSVLEP ( SEQ ID No. 5 ) 、 SVLEPQAE丽L ( SEQ ID No. 6 )、 PQAE丽LEPLQ ( SEQ ID No. 7 ) 、 EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 )、 LQQDRGPAEASE (SEQ ID No. 9) 、 DRGPAEASETRG (SEQ ID No. 10)、 PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11 ) 、 RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12)、 LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13) 、 PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14)或 LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15)。
3. 根据权利要求1或2的方法，其特征在于，在马NT-proBNP或 其片段的测定中，另外还使用对于马NT-proBNP非特异性的至少一种 NT-proBNP抗体。
4. 根据权利要求1-3中任一项的方法,其特征在于，在马 NT-proBNP或其片段的测定中，另外还使用对于马pre-proBnP特异性 的至少一种抗体，特别是特异性地结合来自SEQ ID No. 1的至少一种 表位的抗体，所述表位选自具有序列SPKMMRNSGCFG (SEQ ID No.") 或DRIGSFSGLGCN (SEQ ID No. 17)的表位。
5. 根据权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于，所述至少一种抗体是多克隆的和/或单克隆的。
6. 根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于，所述至少一种抗体和/或所述至少一种另外的抗体是经标记的。
7. 根据权利要求6的方法，其特征在于，用过氧化物酶特别是辣根过氧化物酶、生物素、荧光染料、胶体金或放射性核素来标记所述至 少 一种抗体和/或所述至少 一种另外的抗体。
8. 根据权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于，将所述至少 一种抗体或所述至少一种另外的抗体结合至固相。
9. 根据权利要求1 - 8中任一项的方法，其特征在于，马NT-proBNP 或其片段的测定通过选自下列的方法来进行放射免疫测定法、免疫结 合测定法、Western印迹、免疫组织化学、酶免疫测定法、侧流装置(LFD, 测试条)及其组合。
10. 抗体或抗体混合物，其特征在于，它特异性地结合马 NT-proBNP。
11. 根据权利要求10的抗体或抗体混合物，其特征在于，它结合 来自SEQ ID No. 1的至少一种表位，所述表位选自具有下列序列的表 位PLGGLGPASEQS (SEQ ID No. 3) 、 PASEQSGIQELL (SEQ ID No. 4)、 LLDRLGDSVLEP ( SEQ ID No. 5 ) 、 SVLEPQAERMTL ( SEQ ID No. 6 )、 PQAE丽LEPLQ ( SEQ ID No. 7 ) 、 EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 )、 環DRGPAEASE (SEQ ID No. 9) 、 DRGPAEASETRG (SEQ ID No- 10)、 PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11) 、 RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12)、 LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13) 、 PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14)、 LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15) 、 SPK画RNSGCFG (SEQ ID No. 16)或 DRIGSFSGLGCN (SEQ ID No. 17)。
12. 具有根据权利要求SEQ ID. No. 1的氨基酸序列的多肽或其特 异性片段，特别是具有SEQ ID. No. l的氨基酸8-113、 8 - 81和82 -113的片段。
13. 多肽，其包含有选自下列序列的氨基酸序列PLGGLGPASEQS (SEQ ID No. 3 ) 、 PASEQSGIQELL ( SEQ ID No. 4 ) 、 LLDRLGDSVLEP (SEQ ID No. 5 ) 、 SVLEPQAERMTL ( SEQ ID No. 6 ) 、 PQAE匿LEPLQ (SEQ ID No. 7 ) 、 EPLQQDRGPAEA ( SEQ ID No. 8 ) 、 LQQDRGPAEASE(SEQ ID No. 9) 、 DRGPAEASETRG ( SEQ ID No. 10) 、 PAEASETRGAAP (SEQ ID No. 11) 、 RGAAPTGVLGPR (SEQ ID No. 12) 、 LGPRTKVLQALR (SEQ ID No. 13) 、 PRTKVLQALRGL (SEQ ID No. 14) 、 LQALRGLRSPKM (SEQ ID No. 15) 、 SPK隱NSGCFG (SEQ ID No. 16)或DRIGSFSGLGCN (SEQ ID No. 17)。
14. 根据权利要求12或13的多肽，其特征在于，它是化学合成的 多肽，从样品中分离的多肽，或重组产生的多肽。
15. 根据权利要求IO或11中任一项的抗体或抗体混合物在根据权 利要求1 - 9中任一项的方法中用于测定马NT-proBNP或其片段的用途。
16. 根据权利要求12-14中任一项的肽用于产生根据权利要求10 或11中任一项的抗体或抗体混合物的用途。
17. 根据权利要求12 一 14中任一项的肽在根据权利要求1 - 9中任 一项的方法中作为阳性对照或作为用于浓度测定的标准的用途。
18. 用于测定马NT-proBNP或其片段的试剂盒，其包含至少一种根 据权利要求IO或11的抗体或者至少一种根据权利要求IO或11的抗体 混合物；用于定性和/或定量地检测所述至少一种抗体或所述至少一种 抗体混合物与马NT-proBNP或其片段的结合的工具；和任选地，作为阳 性对照或作为用于浓度测定的标准的根据权利要求12-14中任一项的 肽。
19. 根据权利要求18的试剂盒，其特征在于，所述用于定性和/ 或定量地检测所述至少一种抗体或所述至少一种抗体混合物与马 proBNP或其片段的结合的工具包括至少一种另外的抗体。
20. 根据权利要求18或19的试剂盒，其特征在于，所述至少一种 抗体和/或所述至少一种另外的抗体是经标记的。
21. 根据权利要求18-20中任一项的试剂盒，其特征在于，用过 氧化物酶特別是辣根过氧化物酶、生物素、荧光染料、胶体金或放射性 核素来标记所述至少一种抗体和/或所述至少一种另外的抗体。
22. 根据权利要求18 - 21中任一项的试剂盒在根据权利要求1 - 9 中任一项的方法中的用途。
23. 产生根据权利要求12-14中任一项的多肽的方法，其特征在 于，将编码所述多肽的核酸引入合适的宿主生物中，以本身已知的方式 由所述宿主表达所述多肽，以及回收所表达出的多肽。
24. 产生根据权利要求12-14中任一项的多肽的方法，其特征在 于，所述多肽是化学合成的。
25. 根据权利要求10或11的抗体用于在马中诊断心脏病的用途。
26. 根据权利要求12 - 14中任一项的多肽用于在马中诊断心脏病 的用途。
全文摘要
本发明涉及测定马NT-proBNP或其片段的方法，所述方法包括下列步骤提供马样品，使该样品与至少一种特异性地结合马NT-proBNP的抗体接触，和测定该样品中存在的马NT-proBNP或其片段的存在情况和/或浓度。
文档编号G01N33/74GK101627310SQ200880007351
公开日2010年1月13日 申请日期2008年3月7日 优先权日2007年3月7日
发明者G·哈瓦, W·沃洛兹祖克 申请人:生物医学医药产品有限责任两合公司