监测视网膜病的方法

专利名称：监测视网膜病的方法
技术领域：
本发明涉及在活体视网膜内监测视网膜病的方法。
背景技术：
对于对"初级"视网膜病(源于眼睛障碍)和对"次级，，视网膜病(源 于在除了眼晴之外的器官的系统障碍)的活体临床前期筛查，以及对于候 补治疗剂的功效和可能的毒性的监测，在视网膜病的实验模型的视网膜中 的gliotic反应的无创伤性荧光分子成像受到关注。
各种眼部条件以及在眼睛外部的众多系统可引起视网膜病，而视网膜 病是导致视场损失或致盲的视网膜非炎性变性疾病。
利用视网膜检查和/或视神经检查可诊断多种视网膜障碍。这种障碍的 例子包括高血压、与外围细动脉收缩相关联的系统血压的慢性增加(Tien Yin Wong， 2004; Hammond S， 2006; Topouzis F， 2006 )、血管病 (Yamakawa K, 2001; McCulley TJ， 2005)、先天性心脏病 (Mansour 等人，2005)、自身免疫性疾病(例如风湿性关节炎，其引起关节和其他身 体部位的慢性炎症)(Giordano N, 19卯；Aristodemou P, 2006 )、多发性 硬化症(其包括对中枢神经系统(CNS )中的神经元髓鞘的破坏)(Lucarelli MJ， 1991; Kenison JB, 1994; Lycke J， 2001 )、神经纤维瘤病(Chan CC, 2002; Karadimas P， 2003; Ruggieri M， 2004 )、莱姆神经疏螺旋体病
5(Burkhard等人，2001 )、唐氏综合症(Satge D， 2005; Liza-Sharmini AT, 2006 )、孤独症(Ek等人，1998 )、镰状细胞贫血(Sandstrom H， 1997; Chalam KV, 2004; Shakoor A， 2005; Lima C S， 2006 )、传染病例如HIV( A R Irvine, 1997; Kozak 1， 2005; V T Phaml， 2005 )和细胞巨化病毒(Vogd JU， 2005; Zhang M， 2005a; Zhang M5 2005b )、糖尿病(Antonetti DA， 2006; Takahashi H， 2006; Vujosevic S， 2006 )、甲状腺障碍症(Bahceci UA， 2005; Mader MM, 2006; Roberts MR5 2006 )、肝脏障碍症(Heidrun Kuhrt, 2004; Coiakogiu Onder, 2005 )、眼部疾病例如视网膜襞裂症(Kirsdi等人，1996 )、 老年性黄斑变性(Guidry等人，2002)和青光眼(Wang L, 2002)、以 及坤申经组织变性疾病(Blanks JC， 1996a; Helmlinger D， 2002 )。
视网膜的活体成像方法通常为反射成像或造影注射荧光血管造影术
(Hawes NL, 1999; Bruce E. Cohan, 2003 )，但这些方法不允许看到分子 级的改变。此外，在注射造影剂时可能导致疤痕、渗漏和发炎反应，影响 所获得的效果(Ritter等人，2005 )。
因此，存在对这样的视网膜病模型的需求，该视网膜病模型允许活体、 无创伤性地监测视网膜病的状态，用于与疾病t艮、预后、以及对潜在的 治疗功效和毒性的评估有关的应用。

发明内容
在一个方面，本发明提供一种监测视网膜病的方法，其包括提供活 的转基因的非人类的动物，该动物具有视网膜病或具有易患视网膜病的体 质，其中在GFAP助催化剂的控制下对荧光蛋白质编码的核酸分子被整合 到所述转基因的非人类的动物的基因组中；以及在所述转基因的非人类的 动物的视网膜神经胶质中在第一时刻活体检测所述荧光蛋白质的第一焚光 水平，并且在第二时刻活体检测所述荧光蛋白质的第二荧光水平。
在另一方面，本发明还提供一种监测视网膜病的方法，其包括提供 活的第一转基因的非人类的动物，该动物具有视网膜病或具有易患视网膜 病的体质，其中在GFAP助催化剂的控制下对荧光蛋白质编码的核酸分子被整合到所述第一转基因的非人类的动物的基因组中；提供活的第二转基 因的非人类的动物，该动物不具有视网膜病或不具有易患视网膜病的体质， 其中在GFAP助催化剂的控制下对荧光蛋白质编码的核酸分子被整合到所 述第二转基因的非人类的动物的基因组中；以及在所述第一转基因的非人
类的动物的视网膜神经胶质中活^测所述荧光蛋白质的第一荧光水平， 并且在所述第二转基因的非人类的动物的视网膜神经胶质中活体检测所述 荧光蛋白质的第二荧光水平。
在结合附图阅览了对本发明的具体实施例的以下描述之后，对于本领 域普通技术人员而言，本发明的其他方面和特征将变得明显。


在通过实例示例本发明的实施例的附图中
图1:成年鼠视网膜的视神经盘中的经盐水处理的和神经毒物KA诱 导的GFP提高的荧光分子成像。GFP荧光在第7天在视神经盘的边缘附 近达到最大值；
图2:在单次ip注射之后7天视网膜的神经纤维层(NFL )中的显示 出KA诱导的神经M增生的整个视网膜的平铺图像。在经盐水处理的受 控鼠的整个视网膜中可看到GFP和GFAP表示的基准水平；尺度条 =200/tnr，
图3:在单次神经毒物ip注射(箭头所示)之后7天通过反应星形胶 质细胞的突起和细胞体而被包膜的经KA处理的鼠(右侧合并的图像)的 gliotic视网膜中的视网膜脉管系统。用转基因GFP标示星形M细胞体和 突起，但GFAP标示通常被限定为突起(箭头所示)。在经盐水处理的受 控鼠(左侧合并的图像)的整个视网膜中可看到GFP和GFAP (红色)表 示的基准水平；尺度条-50/un;
图4:聚焦在以贯穿整个视网膜的深度等间距设置的经KA处理的鼠 的视神经盘处的一系列共焦图像表明在神经毒物的单次ip注射之后7天诱 导的神经胶质增生。在从神经纤维层(NFL)和神经节细胞层开始进入内部丛状层(15-20/on)的约0-15/tm处的星形胶质细胞体和突起中显示出神 经胶质增生的程度。另外，在20gm处清楚示出的是在浮见神经盘附近区域 中Mtiller细胞的反应性突起的横断图显著的位置。在经盐水处理的受控鼠 的整个视网膜中也可看到有关转基因GFP表示水平的各种深度信息；尺度 条=100/*111;
图5:在神经毒物的施用之后7天在整个海马的星形胶质细胞(绿色， 10Am的大小)中的神经毒物KA诱导的严重神经胶质增生，如通过转基 因GFP荧光和GFAP抗体着色(红色)所揭示的。经盐水处理的受控鼠 大脑的海马中可看到GFP和GFAP表示的基准水平；尺度条=200^11。在 合并图像中以黄色指示由GFP和GFAP双重标示的细胞；
图6:在神经毒物的施用之后7天在海马的CA1区域中的神经毒物 KA诱导的神经胶质增生。在经盐水处理的受控鼠大脑的CA1区域中可看 到GFP和GFAP表示的基准线水平；尺度条-100/im;
图7:在神经毒物的施用之后7天在海马的CA3区域中的神经毒物 KA诱导的神经月交质增生。在经盐水处理的受控鼠大脑的CA3区域中可看 到GFP和GFAP表示的基准线水平；尺度条=100/*111;
图8:在神经毒物的施用之后7天在海马的齿状脑回区域中的神经毒 物KA诱导的神经胶质增生。在经盐水处理的受控鼠大脑的齿状脑回中可 看到GFP和GFAP表示的基准线水平；尺度条400/mi;
图9:在成年鼠视网膜的视神经盘中的经盐水处理的和神经毒物 2'-CH3-MPTP诱导的GFP提高的焚光分子成像。GFP焚光在第1天在视 神经盘的边缘附近达到最大值；
图10:在神经毒物的施用之后一天黑质的星形胶质细胞(绿色， 10^n 的大小)中的神经毒物2'-CH3-MPTP诱导的神经胶质增生，如通过转基 因GFP荧光和GFAP抗体着色(红色)所揭示的。经盐水处理的受控鼠 大脑的黑质中可看到GFP和GFAP表示的基准水平。箭头指示由GFP和 GFAP双重标示的一些细胞；尺度条-50pm;
图11:在经神经毒物处理的大脑的黑质密部(SNpc)区域中，在神经毒物的施用之后一天，多巴胺神经元中的具有可见的去酪氨酸羟化酶(TH) 的星形胶质细胞(红色， 20/tm的大小)中的神经毒物2'-CH3-MPTP诱 导的神经胶质增生。经盐水处理的鼠大脑的SNpc中检测到GFP和TH表 示的基准线水平；尺度条-50^n;
图12:在经神经毒物处理的大脑的紋状体中，与在中脑SNpc中的 2'-CH3-MPTP的神经毒害效果类似地，在转基因GFP紋状体星形胶质细 胞中神经毒物的施用之后一天，观测到急剧的神经胶质增生。由于紋状体 中的TH的低基准表示水平，伴随着在GFP标示的星形胶质细胞中的急剧 的神经胶质增生，不能直观地观测到TH表示的变化；
图13:在成年鼠视网膜的视神经盘中的经盐水处理的和神经毒物 IDPN诱导的GFP提高的荧光分子成像。GFP荧光在第7天在视神经盘的 边缘附近达到最大值；
图14:在神经毒物的施用之后7天主要在嗅球(合并图像中的箭头所 示)的小球层(GL)的星形胶质细胞(绿色， 10pm的大小)中的神经 毒物IDPN诱导的急剧的神经胶质增生，如通过转基因GFP荧光和GFAP 抗体着色(红色)所揭示的。经盐水处理的鼠大脑的嗅球中可看到GFP和 GFAP表示的基准线控制水平；尺度条-100/im;以及
图15:在神经毒物的施用之后7天，在嗅球7的GL和粒细胞层(GCL ) 的星形月交质细胞中的神经毒物IDPN诱导的神经胶质增生。经盐水处理的 受控鼠大脑的嗅球中可看到GFP和GFAP表示的基准水平。在合并图像 中以黄色指示由GFP和GFAP双重标示的细胞；尺度条=200#111。
具体实施例方式
本发明涉及允许以无创伤性方式，包括以分子水平，活体监测疾病的 视网膜病的模型。该活体模型提供用以研究疾病进展以及对源于例如神经 组织变性疾病和神经毒性的诱因的疾病和障碍症的治疗的方法。在此描述 用于对动物模型中的视网膜神经胶质成像的方法，并且这些方法可提供实 现对初级和次级^L网膜病的诊断的实时效用，并用于评估治疗剂混合物的
9功效和神经毒性。这些方法是非治疗方法，其被设计为辅助表征和理解视 网膜病，即使在某些情况下，使用活体非人类的动物模型可测试潜在的治
疗或处理，例如，用于估定任何潜在的治疗或处理的功效、作用或毒性的 目的。
视网膜由几个神经元层(包括神经节细胞层(GCL ))和神经胶质(包 括星形胶质细胞和Miiller细胞)。神经节细胞将信号从前面的感光细胞经 由轴突传送到视神经，然后传送到大脑。由于视网膜和视神经为大脑的胚 胎赘生物(embryonic outgrowths ),它们常常被用作CNS的简单模型。 眼睛的清澈的光学介质允许在被标示的疾病突M展时直接可视，使得视 网膜和视神经成为对CNS的活体研究的最容易触及的部件。由于视网膜与 CNS相连，在神经组织变性疾病(例如阿尔茨海默氏病和帕金森症)中， 其也影响，并且由此代表CNS的状况。在阿尔茨海默氏病的情况下，已证 明与年龄匹配控制相比在视网膜神经节细胞中存在总体25%的降低
(Blanks JC， 1996b )。
由于视网膜是具有有限数目的不同细胞类型的高度组织化和均匀的组 织，与CNS的其他区域相比，对具有视网膜相关疾病的视网膜的监测便于 识别在特定疾病病理学中所涉及的细胞(Morgan J.， 2005)。因此，对视
帮助判断预后和监测患者的疾病进展。由于其可及性，视网膜不仅允许系 统影响风险减小的治疗载体的局部应用(基因转移和施药)，而且便于估 定治疗策略和医药试验(Helmlinger D， 2002 )。
本发明的发明人开发了 一种在视网膜病的活体动物模型中使用荧光指 示蛋白质(例如绿色焚光蛋白质(GFP))来监测视网膜病状况的方法， 其中该荧光指示蛋白质耦合到神经自纤维酸性蛋白(GFAP)助催化剂。 GFAP表示为变性的视网膜病，且由此用作与视网膜病的疾病状况相关联 的特定生物标记。本活体方法允许更高的形态细节以及对^L网膜病的发展 病理估定和在疾病的疗程内的潜在的治疗，且由此可用于估定和表征不同 的疾病阶段，包括发作、发展、退行和恢复。本发明在活的动物中活体执行，且由此可在同一动物中在一时间段内执行，在该时间段内，疾病状况 可能改变。
GFAP主要在CNS的与通过正调节GFAP而在神经胶质增生期间的 损伤处相对应的正常和反应性神经胶质细胞中。在视网膜中，星形胶质细 胞和Mtiller细胞属于神经胶质细胞类型(Dyer MA, 2000 )，且通常包含 低水平的GFAP。然而，由于应力或损伤，这些细胞显示出充分的GFAP 产量增加，导致细胞增殖和形状改变(Milena Kuzmanovic， 2003 )。先前 的研究表明，GFAP可成像在正常的神经胶质细胞以及在固定的组织或离 体的活组织中退化的细胞上(Brenner M, 1994; Blanks JC， 1996a; Cordeiro等人，2004; Morgan J., 2005 )。这里，本发明的发明人已论证了 ， 包括在一时间段内，在GFAP助催化剂的控制下表示的荧光标记蛋白质可 被用于在具有视网膜变性或具有视网膜病或具有易患视网膜变性或视网膜 病的体质的活的动物中进行活体视网膜成像，以监测视网膜病的疾病状况。
为了监测神经变性的状况或发展，本方法在GFAP助催化剂控制之下 利用表示荧光蛋白质(例如GFP)的活的小动物疾病模型。也就是，通过 例如基因或化学技术而具有视网膜病或者具有易发展视网膜病的体质的
GFAP-GFP转基因动物提供用于活体视网膜成像的活的动物，用以监测视 网膜病或与视网膜病相关的疾病或障碍症，或者用以估定在视网膜病或与 视网膜病相关的疾病或障碍症中的治疗的功效或毒性。
这些方法与组织学方法(Sediger等人，2005 )相比的优点在于，在这 样的系统中随着时间流逝实时追踪病理发展而不需要外原染色的简单性， 该系统可对应于治疗或可显示出进一步的变性。
由此，提供一种监测视网膜病的方法，其包括检测视网膜的神经^:
(即，Miiller细胞和星形月M细胞)中的荧光蛋白质的荧光水平，所述焚 光蛋白质包括转基因的非人类的动物的视神经(无髓鞘的许旺氏细胞)， 该动物具有包括视网膜变性的视网膜病或易患视网膜病的体质，并且该转 基因动物在GFAP助催化剂的控制之下表示荧光蛋白质。
荧光蛋白质的表示是在转基因动物中的GFAP助催化剂的"控制之下"，意味着GFAP助催化剂可操作地与荧光蛋白质的编码序列相关联且 是导引荧光蛋白质编码序列的转录的助催化剂。由此，相对于没有任何此 种因子的表示，激活或提高从GFAP助催化剂转录的因子会导致转基因动 物中的荧光蛋白质的表示增加，并且抑制或阻碍从GFAP助催化剂转录的 因子会导致转基因动物中的荧光蛋白质的表示减少。通过检测在转基因动 物的视网膜神经M细胞中的荧光蛋白质的表示水平，无创伤性地检测焚 光蛋白质的表示水平。
为了在希望的时间段内监测视网膜病，可以在同一活的动物中，在第 一时刻检测荧光蛋白质的第一荧光水平，然后在第二时刻检测荧光蛋白质 的第二荧光水平。可将第二荧光水平与第一荧光水平比较，以估定疾病状 况的变化。
同样地，为了固定疾病状况，可以与负性控制动物才莫型相比地进行对 视网膜病的监测。由此，在GFAP助催化剂的控制之下表示荧光蛋白质但 不具有视网膜病或不具有易患视网膜病的体质的转基因的非人类的动物可 用于提供与视网膜病无关的视网膜中的蛋白质荧光标准，由此允许比较具 有视网膜病或具有易患视网膜病的体制的动物与不具有这样的视网膜病或 不具有易患视网膜病的体制的动物中的疾病状况。
对视网膜病的监测包括在一时间段内追踪疾病发作、发展、退行和恢 复或者预后，还包括在一时间段内追踪对治疗的反应以及追踪治疗的副作 用(包括毒性)。
所述视网膜病可以是任何视网膜病，包括初级视网膜病和次级视网膜 病，并且可以是在转基因动物中的疾病或基因条件的结果，或者可以是通 过用神经毒素或i欠射线治疗转基因动物而被化学或辐射诱导的视网膜病， 如下所述。
由此，对视网膜病的监测可包括对荧光蛋白质的焚光水平进行监测和 定量，以估定在任何与视网膜病相关的疾病或障碍症中的视网膜的疾病状况。
与视网膜病相关的疾病或障碍症是指任何可引起、导致视网膜变性、视网膜神经胶质增生或视网膜病(包括初级视网膜病和次级视网膜病)或 者与视网膜变性、视网膜神经^/贡增生或枧网膜病相关联的疾病、障碍症 或条件。
视网膜病理包括作为视网膜病或与视网膜病相关的疾病或障碍症的结
果或者与其相关的^L网膜的变性或疾病，且包括^f见网膜神经胶质的变性。 易患视网膜病的体质是指对发展视网膜病的易受性或倾向(包括基因倾向) 的增加的风险。
对视网膜病的监测包括对视网膜神经M^t增生、视网膜变性、或视网 膜病的监测和定量，所述视网膜神经胶质增生、视网膜变性、或涉及神经 组织变性的视网膜病的疾病包括帕金森病和阿尔茨海默氏病病、源于眼 部的初级^L网膜病(包括^L网膜襞裂症、老年性黄斑变性和青光眼)、以 及源于系统疾病的次级视网膜病，所述系统疾病包括糖尿病视网膜病、肝 脏病^L网膜病、肾脏病视网膜病、高血压、血管病、先天性心脏病、自身 免疫性障碍症(包括风湿性关节炎)、多发性硬化、神经纤维瘤病、莱姆 神经疏螺旋体病、唐氏综合症、孤独症、镰状细胞贫血、HIV和巨细胞病 毒属感染、曱状腺障碍症或肝脏障碍症。
"疾病状况"是指在具体的时间点在具体的转基因的非人类的动物中 视网膜病或视网膜变性的程度。疾病状况包括疾病的阶段(包括发作之前 的阶段)以及疾病的程度。通过随着时间流逝追踪转基因动物的视网膜神 经胶质中的荧光水平，且将荧光水平的变化与视网膜病相比较和相关联， 包括与没有视网膜病或易患视网膜病的体质的转基因动物相比较，估定疾 病状况。如上所述，GFAP表示用作4见网膜病的特定的生物标记，由此，
视网膜病的指示器。
非人类的转基因动物可以是任何动物，包括哺乳动物，包括啮齿动物， 包括鼠。在特定实施例中，非人类的动物为鼠。非人类的动物可以具有这 样的条件，其中，由于视网膜神经胶质的反应性改变，GFAP表示被提高。 在特定实施例中，该动物对于M突变是同型的，包括具有FVB/N基因背景的鼠。M突变导致由于对PDE6B酶亚组编码的基因的突变而引起的视 网膜变性表型。
非人类的动物是具有转基因的转基因动物，其包含与对荧光蛋白质编 码的序列可操作相关联的GFAP助催化剂。以允许通过检查视网膜而检测 视网膜神经自细胞中或活的动物中的荧光蛋白质的方式表示转基因。视 网膜的神经自细胞也被称为视网膜神经自，包括Mtiller细胞和星形胶 质细胞，且还包括^见神经的无髓鞘的许旺氏细胞。由此，转基因动物可具 有在被整合到其基因组中的GFAP助催化剂的控制之下对荧光蛋白质编码 的核酸分子。
在特定实施例中，转基因包括与对荧光蛋白质编码的序列可操作地相 关联的GFAP助催化剂，该荧光蛋白质与多腺苷酸化信号可操作地相关联。 将理解，转基因构造将包括允许在GFAP助催化剂的控制之下表示转基因 动物中的神经胶质细胞内的荧光蛋白质的必要的调整元素。
当以功能关系设置序列时，第 一核酸序列与第二核酸序列可操作地相 链接。例如，如果助催化剂激活编码序列的转录，则编码序列可操作地链 接到该助催化剂。
GFAP助催化剂是任何导？ 1神经胶质纤维酸蛋白质的表示的助催化 剂。在特定实施例中，GFAP助催化剂包括位于人类GFAP基因的侧面的 2.2 kb 5'区，如在Zhuo等人，1997和在Brenner等人，1994的文献中所述。
萸光蛋白质可以是任何这样的蛋白质，其发荧光，且当通过检查表示 该蛋白质的活的动物的视网膜而在视网膜神经M"细胞中表示时可视。例 如，荧光蛋白质包括GFP、 GFP S65T、增强的GFP (EGFP) 、 EBFP、 EBFP2 、 Azurite、 mKalamal、 ECFP、 Cemlean、 CyPet、 YFP、 Citrine、 Venus、 或YPet。在特定实施例中，荧光蛋白质是GFP，包括人化的GFP，包括 GFP的S65T突变。人化的蛋白质是指这样的蛋白质，其中维持氨基, 列，但该氨基酸序列由这样的编码序列表示，在该编码序列中，已通itA 类核糖体关于密码子的用法对密码子进行了最优化。
所述转基因的非人类的动物还具有视网膜病或具有易患视网膜病的体质。如上所述，视网膜病是指与视网膜病有关的视网膜的疾病或障碍症。 由此，转基因动物具有容易朝向发展初级或次级视网膜病M的基因体质， 或者具有初级或次级视网膜病，或者具有包括视网膜或神经变性的视网膜 病，其可发展为初级或次级视网膜病。
由此，可通过使在GFAP助催化剂的控制之下表示荧光蛋白质的转基 因动物与提供用于初级或次级视网膜病的基因或分子模型的动物杂交，产 生所述转基因的非人类的动物，其中提供用于初级或次级视网膜病的基因 或分子模型的动物包括用作用于以下疾病的模型的动物，这些疾病包括神 经组织变性疾病(包括帕金森病和阿尔茨海默氏病)、视网膜襞裂症、青 光眼(包括鼠模型DBA/2J)、糖尿病、肝炎、可导致视网膜病的肾脏障 碍症、高血压、血管病、心血管病、肺部障碍症、自身免疫性障碍症(包 括风湿性关节炎)、多发性硬化、神经纤维瘤病或曱状腺障碍症。
可替代地，所述转基因动物科具有视网膜病或由暴露于化学试剂(例 如神经毒素)而诱导的视网膜病。公知诱导视网膜病理或视网膜病的几种 神经毒素，包括l-曱基-4-苯基-l，2，3，6-四氢吡啶(MPTP )、红藻氨酸(KA ) 以及3，3-亚氨基二丙腈(IDPN)。
已确定可由KA诱导的谷氨酸盐受体相关的神经毒性(Megumi Honjo， 2000a)。由于已证明KA在鼠中诱导正在进行的抽搐以及海马(CA )神 经元的变性和在剩余的CA中的超兴奋性，KA已被用于才莫拟癫痫症。当 与抗痉挛药一起緩慢施用时，KA可用于模拟阿尔茨海默氏病(AD) (Olney, 1990 )。 一项这样的研究表明在向初生的鼠进行KA的脑室内施 加时，可看到海马锥形神经元的明显减少(Dong等人，2003) 。 AD是一 种影响海马和其他边缘结构(Khachaturian， 1985 )、脑皮层相关区、视觉 皮质且沿着大脑的中心4见觉路径(Blanks JC， 1996b )的痴呆障碍症。AD 的组织病理学特征典型地包括神经元损失、神经原纤维缠结、神经炎斑和 粒状空泡变性(Khachaturian, 1985)。研究表明，AD患者遭受视觉缺陷， 全部缘于在视网膜和中心视觉路径(Blanks JC， 1996b )中的神经节细胞变 性和视神经病(Blanks等人，1989)。当注射到眼睛的玻璃体中时，KA被证明诱导导致神经元坏死的谷氨酸盐受体相关的神经毒性，以及在视网膜
的MtiUer细胞中的GFAP的正向调节(Megumi Honjo, 2000b )。
暴露于MPTP会导致黑质密部(SNpc)中的多巴胺能神经元的变性
(Chen等人，2003 )。由于在二十世纪八十年代发现MPTP具有诱导帕金 森病症状的能力，该神经毒物已被广泛用于产生用于帕金森病(PD)的疾 病动物模型。特别地，对PD的鼠模拟已被广泛用于对多巴胺能神经元坏 死的机理的研究以及对实验性神经元保护治疗的研发(Przedborski等人, 2001; Przedborski和Vila, 2001; Bove等人，2005 )。目前，PD被认为是老 化大脑的笫二位最常见的变性性障碍症，其中阿尔茨海默氏病是最常见的。 PD的特征在于以下症状静止时的颤抖、有意运动的迟緩、僵硬以及姿势 的不稳定性，并且主要归因于黑质紋状体多巴胺能路径的神经元的损失， 导致大脑多巴胺能水平的不足(Marin等人，2005) 。 PD还与视觉系统的 神经元变性相关联，如在帕金森患者中所观察到的。相当多的精神躯体和 电生理学证据表明，PD患者的视觉功能紊乱起因于可能在视网膜中的多巴 胺能不足(Bodis-Wollner， 1990; Peters等人，2000 )。系统施加的MPTP 还被证明会影响视网膜中的神经元和神经胶质细胞。在一项这样的研究中， 在鼠中全身注射MPTP之后 一周内，在内部外部视网膜中观测到小神经胶 质激活作用。在注射之后几天神经胶质细胞的GFAP免疫反应性也提高
(Chen等人，2003 )。
1DPN是一种神经毒物，其在对实验动物施用之后，诱导人类神经障 碍症6Y〃es & /a 7^ /Wte综合症的症状。GY〃m & /fl 综合症的特征 在于抖动、无意识的肌肉运动和发声抽搐。动物模型中的神经毒物的突出 的神经学综合症是"ECC综合症"(兴奋、舞蹈和转圏运动)(Wakata 等人，2000) 。 IDPN引起神经纤维轴突病，该病的特征在于在神经元轴突 的近段中以及在有髓鞘的细胞体的核周体中神经丝的积聚(Seoane等人, 1999)。其已证明会沿着暴露的非吸入路径在嗅黏膜中引起坏疽(Genter 等人，1996)。除了视网膜和小阜的进行性变性和反应性神经胶质增生，在 动物模型的眼睛中还观测到角膜的暗晦、脉管变化以及视网膜的分离
16(Seoane等人，1999 )。例外的是，星形胶质细胞和Miiller细胞的反应性 神经胶质增生也是与IDPN神经病相关联的常见特征。该报导描述了在 FVB/N背景中，在先前建立的GFAP-GFP转基因鼠模型(Zhuo等人，1997 ) 中对通过三种神经毒物来例证的神经变性的视网膜gliotic响应的无创伤性 成像的方法，该FVB/N背景具有相对高的对神经变性疾病的易感性
(Mineur YS， 2002 )。神经变性是由注射神经毒物而引起的，这些神经毒 物？ 1起神经损伤和如在诸如阿尔茨海默氏病和帕金森病的疾病中所见的临 床症状的相同才莫式(Landrigan PJ, 2005; Bezard E, 2006; Novikova L, 2006)。与先前的方法不同，该模型允许在视神经盘和中央视网膜中的星 形神经胶质的进行性和活体可视化。
类似地，可通过将视网膜暴露于辐射而诱导视网膜病理或视网膜病。 例如，可将激光用于诱导视网膜病，包括青光眼，如在Grozdanic等人，2003 中所述。
用于构造转基因、转基因栽体和转基因动物的方法和技术在本领域中 公知，食寸^口，i口在Sambrook等人的(2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual,第三版，Cold Spring Harbour Laboratory Press中所述。例如， 可通过在这样的条件下将转基因组织注射到鼠受精卵的前核中而产生转基 因鼠，所述条件允许将转基因稳定地整合到鼠基因组中。其中GFAP助催 化剂可操作地链接到GFP的编码序列的转基因鼠以及这种鼠的产生方法 在美国专利6,501,003和Zhuo等人，1997中已进行了描述。
该方法包括在活的转基因动物的视网膜中活体检测荧光蛋白质的荧光 水平，该动物是在GFAP助催化剂的控制之下表示的荧光蛋白质的转基因 动物，并且该动物具有易患视网膜病的体质或具有视网膜病。
可以使用公知的在完整的细胞中检测荧光标记物的方法来执行检测。 例如，如在Zhuo等人，1997和美国专利6,501,003中所述，可4吏用激光共 焦显微镜方法。可使用扫描激光检眼镜检查方法，例如，采用使用来自点 光源的激光束的扫描激光检眼镜，并使用光电倍增管来检测反射光。先前 已描述了对啮齿动物使用扫描激光检眼镜成像的方法(Hossain等人，1998;Khoobehi和Peyman， 1999; Cordeiro等人,2004; Genevois等人，2004; Jaissle等人，2001; Xu等人，2003; Seeliger等人，2005; Paques等人，2006 )， 下面在实例1中阐述这些方法。
检测包括对荧光蛋白质的荧光水平进行定量以及估定在转基因动物的 视网膜神经^t中的荧光蛋白质的表示的质量。例如，使用包括检眼镜检 查方法的荧光显微镜技术检测到的荧光图像可被计算机捕获，且使用标准 可用的成j象软件进行定量。可在存在高背景荧光的条件下用于改善信号质 量的方法在共同待审的国际申请IMAGING AVERAGING中进行了描述， 该国际申请要求在2007年5月2日提交的美国临时申请60/924,162的优先 权。
为了监测疾病发作、疾病发展或疾病退行，可在特定的动物中间隔地 或在一时间段内执行检测。如上所述，可将在后时刻检测到的荧光蛋白质 的荧光水平与在前时刻检测到的荧光水平相比较。并且，可将荧光水平与 在表示焚光蛋白质但不具有视网膜病或不具有易患视网膜病的体质的转基 因动物中的荧光水平相比较。这样的检测允许建立或限定参数，这些参数 包括与特定的视网膜病相关疾病或障碍症相关联或者与特定的疾病阶段相 关联的细胞或分子改变或事件，产生这样的方法，所述方法可应用于关于 与视网膜病相关的疾病或障碍症的诊断或预后的临床情况中。
可选地，可对转基因动物进行用于与视网膜病相关的疾病或障碍症的 潜在治疗，并且可以通过在潜在治疗之前、期间或之后的一段潜在治疗疗 程内检测荧光蛋白质的荧光水平来执行检测。
潜在治疗可以为任何这样的治疗，该治疗被测试其对视网膜病相关的 疾病或障碍症的效果，并且潜在治疗可包括食谱安排、受控的环境条件、 或者潜在的治疗剂的施用。
由此，检测还可以在存在或不存在潜在治疗的施用的情况下执行，该 潜在治疗包括潜在的治疗剂，包括药物、药剂或生物制剂，允许监测治疗 效果和/或潜在治疗的神经毒性。
并且，可以在当前描述的方法中施用用于其他疾病、障碍症或条件的
18治疗备选，并且监测可以允许判断用于治疗不相关的障碍症的治疗剂的神 经毒性。
技术人员熟悉用于这些方法中的对转基因非人类的动物施加潜在治疗 备选的标准实验室技术和制度。
可以与其他方法联合使用所描述的方法，这些其他方法包括对转基因
动物的蛋白质生物学(proteomic)和代谢组学(metabolomic)仿形，由
此提供荧光蛋白质的表示水平与视网膜病相关疾病和障碍症的阶段和类型 之间的分子链接以及对这种疾病和障碍症的潜在治疗。
并且，根据上述方法，当前预期的是对用于监测视网膜病的转基因非 人类动物的应用。
本方法和应用通过以下非限制性实例进一 步进行示例。
实例
实例1
在该研究中，用三种神经毒物治疗在神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP) 助催化剂的控制之下表示绿色荧光蛋白质(GFP)的转基因鼠，以引起视 网膜神经胶质增生，这三种神经毒物为l-曱基-4(2，-曱基苯基)-l，2，3，6-四氢 吡咬(2，-CH3-MPTP )、红藻氨酸(KA )以及3，3-亚氨基二丙腈(IDPN )。 在2周的时间段内使用共焦扫描激光检眼镜(SLO)对进行性视网膜神经 胶质增生进行无创伤性成像，以使视神经盘和中央视网膜的神经胶质中的 GFP荧光的改变可视化。通过对一见网膜整体安装件(whole-mount)的内 生GFAP的转基因GFP和免疫组织化学(IHC)着色，神经毒物诱导的 视网膜神经胶质增生得以核实，并与在大脑的其他部分中的神经胶质增生 相关联，所述其他部分包括黑质密部(SNpc)、紋状体、海马和嗅球，它 们分别是MPTP、 KA和IDPN的优选目标。这些发现表明，这里描述的 在神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和实时荧光成像助催化剂的控制之下 表示绿色荧光蛋白质(GFP)的转基因鼠中使用视网膜神经胶质增生的方 法是用于直接监测视网膜神经胶质增生以及用于间接预测在大脑中发生的 神经胶质增生的有用的临床前期工具。材料和方法
4^差效G7^1P-G^尸戚如先前所述对转基因GFAP-GFP鼠进行繁殖 和基因分型(genotype ) ( Zhuo等人，1997 )。在^f究中使用在FVB/N 背景中的成年鼠(8-10个周大)。由National University of Singapore animal holding unit提供动物管理。包括本研究的实验协议得到Institutional Animal Care and Use Committee的批准。
y婢经善參;^W:f^在本研究中，使用作为MPTP的更有效相似体的1-甲基-4(2，-甲基苯基)-l,2，3，6-四氢吡啶(2，-CH3-MPTP )来在成年大脑中诱 导神经胶质增生(Abdel-Wahab, 2005 )。试验化合物2，-CH3-MPTP (M103)、 KA (K0250)和IDPN (317306)购于Sigma-Alddch (St. Louis, MO， USA)。 治疗组中的每只鼠受到4次腹膜内(ip) 2，-CH3-MPTP注射(盐水中15 mg/kg， ip,每2小时一次)、 一次KA注射(盐水中25mg/kg， ip)或3 次IDPN注射(500 mg/kg， ip，每天一次)。对于每个神经毒物治疗组(n=3 )， 使用盐水作为用于控制组(n=3)的士某介物。经过14天的时间内执行视网 膜成像。
动浙的黃y务通过用购于Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)的 Avertin (1.5% 2,2,2-三溴乙醇；T48402 )的0.15ml/10g体重量的ip注射麻 醉鼠，并且用一滴0.5%的Cyclogy顿消毒眼药溶液(盐酸环喷托酯，Alcon , Puurs, Belgium )扩张其瞳孔。定制的PMMA硬接触透镜(来自Cantor & Nissel ( Northamptonshire, UK))用于校正光学像差且用于避免鼠眼睛脱 水。在扫描激光检眼镜成像之前通过眼科专家的仔细检查排除任何角膜或 晶状体的不透明性的存在。
々溜谈^检媒镜"LO，成谬对于这里所述的工作，采用为用于鼠 而修改的Heidelberg Retina Angiograph (HRA ll)扫描激光检眼镜 (Heidelberg Engineering, Dossenheim, Germany)的第二版。扫描激光检目艮 镜(SLO)是基于用来自点光源的激光束对眼底的扫描的眼底成像技术， 同时通过光电倍增管检测反射光。入射和反射光沿共轴路径。因此，与常 规眼底相机相比，可使更多的光通过小的眼睛。已经公开了对大鼠(Hossain等人，1998; Khoobehi and Peyman, 1999; Cordeiro等人，2004; Genevois等 人，2004 )和鼠(Jaissle等人，2001; Xu等人，2003 )的SLO成像的几篇报 导，其中最近的研究是(Seeliger等人，2005 )和(Paques等人，2006 )利 用HRA第一版(或HRA I)评估鼠眼底。HRA II特征为在短波长范围内 的两种Argon激光(488nm和514nm )以及在长波长范围内的两种红外二 才及管激光器(795nm和830nm ) 。 488nm和795nm激光器分别用于荧光 素和艇青绿jk管造影术。合适的分别为500nm和800nm的阻挡过滤器不 改变波长地去除反射光，且允许仅仅由经激励的染料发射的光通过。在光 学分辨率为10/im/像素且伴随三个视场(标称值为15°、 20。和30°)时最 高清晰度为768x768像素。使用0.25屈光度的步增量，焦距在+12/-12屈 光度的范围内可调。可使用显示采集模式(每个图像48ms至96ms)。在 所关注的任何区域内，可以自动获取最高为8mm的最大深度的层析图像 (z-扫描)的叠层。
减辨應整伴安装伴和f瘦邀织化夢(7好C人在用IXPBS灌注鼠之后， 之后为4%新鲜的低聚甲醛(lxPBS，pH7.4)，提取大脑，并摘除眼睛。 在4。C下将这些眼睛立即固定在4%的低聚甲醛中并隔夜，之后在中线处解 剖这些眼睛，其中剥离晶状体和玻璃体。然后在没有脉络膜和巩膜且整体 安装在玻璃载片的条件下解剖视网膜。利用用于荧光的Vectorshield安装 介质(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA; H1000 )来安装整 个视网膜。首先在4。C下将大脑固定在4。/。的低聚甲醛中4个小时，然后隔 夜在4"C浸泡在30%的甜味剂中。将处理后的大脑组织插入OTC冷冻介 质中，以在低温保持器(Leica Microsystems, Nussloch GmbH; CM-3050S ) 上制作切片。与视网膜整体安装一起将根据Atlas of Mouse Brain (Franklin 和Paxi画,2001)的海马(前自画1.94mm,耳间1.86mm) 、 SNpc (前囱 -3.16mm，耳间0.64mm)和嗅球(前囱4.28mm,耳间8.08mm)的冠状 冻切片(10/im )用于利用对抗GFAP的兔子多克隆抗体(在1:200的稀释 液中)的IHC (Dako, Z0334 )。将SNpc和统状体(前囱0.62mm,耳间 4.42mm)的切片用于利用对抗络氨酸羟化酶的兔子多克隆抗体(在1:200
21的稀释液中)的IHC ( TH; Chemicon, CA, USA; Ab- 152 )。在室温下在 1:100的稀释溶液中用共辄到Texas-red (Abeam, Ab7088)的山羊IgG对组 织切片上的束繂主抗体染色，并l吏用共焦显孩支镜(LSM 510 META, Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena Germany)使其可视化。 结果
洽/L4谬寻的视河處^经^^增i的为、f成谬图1中示出了在KA 中且经盐水处理的成年鼠的视网膜成像的代表性实例。从注射神经毒物之 后第1天直到其在第7天达到最大荧光，经神经毒物处理的鼠的视神经盘 显示出主要在视神经头的边缘处GFP荧光的逐渐提高。分析了来自经KA 处理和盐水处理的成年鼠的视网膜整体安装件的平铺图像。在施用神经毒 物之后的7天，通过经神经毒物处理的鼠的反应性星形胶质细胞体以及视 神经盘和周边视网膜中的突起的过度生长和增生状态，可以看出在神经纤 维层(NFL)中具有过表示的转基因GFP和内生的GFAP的严重的神经 月缓增生(图2)。如在图3的合并的转基因GFP和抗-GFAP图像中的箭 头所示，,K应性星形胶质细胞的突起和细胞体包膜的神经毒物处理过的 鼠的视网膜血管揭示出网状分布以及在NFL中星形M细胞与血管之间 的关联性，表明星形胶质细胞是脉管神经胶质鞘，且是血液-视网膜阻挡的 一部分。有趣地，远离视神经头，GFP信号在细胞体和突起中显著，而 GFAP标示典型地被限制为仅仅在周边视网膜中的星形的反应性星形胶质 细胞的突起(图3中的箭头所示)。图4示出聚焦在贯穿整体安装的视网 膜的深度以5/tm的等间距设置的经KA处理和盐水处理的鼠的一 系列共焦 图像，表明在经处理的和控制的鼠之间存在GFAP-GFP转基因表示的定性 差异。围绕视神经盘的共焦图像示例出在从约0-15pm处的NFL和神经节 细胞层开始进入内网织层(15-20/mi)的星形胶质细胞体和突起中的神经 胶质增生的程度，此处可以看到来自Miiller细胞的端脚(细胞突起)的 GFP荧光的大量小焦距。用GFAP抗体(红色)培养且在同一聚焦平面上 与转基因GFP报告物(reportcr)—起可视化的冷冻大脑切片的IHC着色表 明，KA引起严重的反应性神经M增生(即，GFAP和GFP的正向调节)。当与盐水控制的相同区域比较时，急剧的神经胶质增生显示出在整个海马
区(图5 )，尤其在CA1 (图6 ) 、 CA3 (图7 )和齿状脑回(图8 )的局部区域中GFP和GFAP表示的极高水平。
洽2'-C好W^^户//趟的魂风虔禅经^^l兰的为、"^戎^:对于第二神经毒物2'-CH3-MPTP的情况，视神经盘的荧光分子视网膜成像清楚地表明在施用神经毒物之后24小时时GFP表示的最大增加(图9 ) 。 GFP荧光最高的区域主要位于视神经盘的存在轴突纤维束和视网膜脉管系统的聚集处的边缘区域中。为了识别出大脑子区域和显示神经胶质增生的细胞类型，从用2'-CH3-MPTP或盐水处理、与转基因GFP标记物协同地用GFAP抗体(红色)或TH抗体(红色)着色的成年鼠的大脑，制备包含SNpc和紋状体区域的冷冻切片。2'-CH3-MPTP引起GFP增加，并且，在系统施用神经毒物之后仅仅一天时，在受激的星形胶质细胞中存在较低程度的GFAP增加。与经盐水处理的鼠大脑相比，在神经毒物处理的鼠大脑的黑质(图10 )中广泛发生神经胶质增生，在所述脑中对应地标记在SNpc (图11)中去TH免疫反应性中脑多巴胺能神经元。然而，与紋状体中的GFP的大幅增长的同时，TH表示水平没有可检测得到的改变(图12)。
由/Z)/W f/趟的视/^^^经^^增4:的分^戎谬为了获得对用KA和2'-CH3-MPTP得到的观察的额外支持，在单独的实验中使用神经毒物IDPN。与KA情况相似地，1DPN处理的鼠的视神经盘在施用神经毒物之后第7天这一时刻处显示出GFP荧光的最大提高，而盐水处理的鼠在2个周的过程期间仅仅显示出焚光的中度变化(图13)。在比较盐水处理和IDPN处理的鼠的嗅球的对应切片时追踪反应性神经胶质增生的发作，主要在嗅球的小球层(GL)中存在与GFAP免疫反应性细胞共同局域化的显著更多的GFP正性的星形神经胶质(图14)。除了图15中示出的GL中的聚集之外，还存在在粒细胞层(GCL )中存在的GFAP正性细胞的强烈增加。
讨论
在鼠中，可利用活体视网膜成像工具的可用性，以在发展和疾病期间对鼠眼内脉管系统(Ritter等人5 2005 )和视神经盘(Bruce E. Cohan, 2003 ) 成像。摧毁性(knockout)转基因鼠模型还被用于调查视网膜和神经元变 性(Jaissle等，2001; Helmlinger D， 2002 )。在不同组织中过表示 (over-expressing) GFP的在组织专用的助催化剂的控制之下的转基因鼠 模型可被并入对特定疾病的研究中。例如，使GFP表示的锥体视蛋白助催 化剂(Fd和Hughes, 2001)与疾病模型交叉可被用于研究由随着时间的流 逝的退行性疾病引起的锥体的损失。类似地，可用GFP标示脉管目标。在 例如平滑肌tv-肌动蛋白助催化剂的控制之下产生GFP的转基因允许在不 施加染料的条件下使视网膜脉管可视化(Tsai等人，2002 )。在该研究中表 明，用作与hGFP-S65T报告基因相关联的神经胶质增生病理标记物的 2.2-kb人类GFAP基因助催化剂允许对星形胶质细胞核Miiller细胞行为 进行实时荧光分子成像，这使得能够在相当长的时间段内对助催化剂活性 进行监测和量化。使用对经神经毒物处理的鼠眼睛的荧光分子成像，可以 活体观察鼠—见神经盘中的GFP的表示的变化，揭示出有关神经M^增生处 理的重要特征。
在视网膜和大脑二者中，以与内生的GFAP基因相同的方式调节GFP 转基因的表示。对三种经神经毒物处理的鼠的分子视网膜成像表明，视神 经盘的星形胶质细胞中的增加的GFP表示的水平明显足以容易地进行活 体可视化、监测和量化(图1)。为了证实活体成4象数据，通过IHC检查 整体安装的视网膜的转基因GFP和内生GFAP水平。发现经KA处理 的鼠的整体安装的视网膜中观测到的视网膜神经胶质增生与先前公开的研 究相一致，在所述先前^Hf的研究中，在施用KA之后在Miiller细胞和星 形胶质细胞中检测到增加的GFAP水平(Sahel等人，1991; Megumi Honjo， 2000b)。此外，在像SNpc、紋状体和嗅球、CA1、 CA3和海马的齿状脑 回区域的大脑各种区域中的急剧的神经胶质增生证实了三种神经毒物 (KA、 2'-CH3-MPTP、 IDPN)的作用引起视网膜神经M增生，表明这 里所述的实时荧光成像方法是用于直接监测视网膜神经胶质增生以及用于 间接预测在大脑中发生的神经胶质增生的有用的临床前期工具。
24如在该研究中所说明的，本GFAP/GFP报告物系统提供了使视网膜神
经胶质活体可浮见的方法，并且其对损伤的响应代表了对初级和次级视网膜 病的临岸、前期筛查以及对药物化合物的功效和神经毒性的评估的实时效 用。使用安装有广角物镜的SLO来以单细胞分辨率获得对周边视网膜和 Mtiller细胞的分子视网膜成像是可行的。这样的改进的SLO配置允许分 析视网膜脉管结构的改变和不同来源的视网膜病的模式。特别地，当用例 如磁共振成像(MRI)和正电子发射断层显像(PET)的视网膜电图描记 术(ERG)和3D成像方式补充时，当前的分子视网膜成像方法不仅可用 于检测视网膜病，还可以用于获得对药物化合物的功效和神经毒性的分子 标识，并且可揭示出对深藏在大脑内的疾病区的更精确的实时信息。此外， 通过整合来自分子视网膜成像和纳米级的血清生物标记的系统(蛋白质生 物学和代谢组学)仿形的数据，还可以将具有^L网膜病症状的系统疾病准 确定位到具体的器官(Hood等人，2004 )。
像每一个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出通过参考而^ 皮并 入。任何出版物的引用都用于其在提交日之前的公开内容，且不应由于现物。
如在该说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文明确地另有 规定，否则单数形式的"一"、"一个"和"该"包括复数范围。如在该 说明书和所附权利要求书中所使用的，术语"包括"、"包含，，以及这些 术语的其他形式旨在以非限制性包容的方式包括引用的特定要素或组件， 而不排除任何其他要素或组件。除非另有规定，在此所使用的所有科技术 语具有对于本发明所述领域的普通技术人员而言普遍理解的意义相同的意 义。
根据本发明的教导对于本领域普通技术人员而言很明显地，在不脱离所附 权利要求的精神或范围的情况下，可以对本发明进行特定的改变和修改。参考文献
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3权利要求
1.一种监测视网膜病的方法，包括提供活的转基因的非人类的动物，该动物具有视网膜病或具有易患视网膜病的体质，其中在GFAP助催化剂的控制下对荧光蛋白质编码的核酸分子被整合到所述转基因的非人类的动物的基因组中；以及在所述转基因的非人类的动物的视网膜神经胶质中在第一时刻活体检测所述荧光蛋白质的第一荧光水平，并且在第二时刻活体检测所述荧光蛋白质的第二荧光水平。
2. 根据权利要求l的方法，其中所述转基因的非人类的动物为鼠。
3. 根据权利要求1或2的方法，其中在检测之前，将所述转基因的非 人类的动物暴露于潜在的治疗，并且其中监测包括对视网膜病退行、视网 膜病恢复、或者视网膜病发作的延迟的监测。
4. 一种监测视网膜病的方法，包括提供活的第一转基因的非人类的动物，该动物具有视网膜病或具有易 患视网膜病的体质，其中在GFAP助催化剂的控制下对荧光蛋白质编码的 核酸分子被整合到所述第 一转基因的非人类的动物的基因组中；提供活的第二转基因的非人类的动物，该动物不具有视网膜病或不具 有易患视网膜病的体质，其中在GFAP助催化剂的控制下对荧光蛋白质编 码的核酸分子被整合到所述第二转基因的非人类的动物的基因组中；以及在所述第一转基因的非人类的动物的视网膜神经胶质中活体检测所述 萸光蛋白质的第一荧光水平，并且在所述第二转基因的非人类的动物的视 网膜神经胶质中活体检测所述荧光蛋白质的第二荧光水平。
5. 根据权利要求4的方法，其中所述第一转基因的非人类的动物和所 述第二转基因的非人类的动物为鼠。
6. 根据权利要求4或5的方法，其中在检测之前，将所述第一转基因 的非人类的动物暴露于潜在的治疗，并且其中监测包括对视网膜病退行、 视网膜病恢复、或者视网膜病发作的延迟的监测。
7. 根据权利要求6的方法，其中在检测之前，将所述第二非人类的动 物暴露于所述潜在的治疗。
8. 根据权利要求2或5的方法，其中所述鼠具有FBV/N的基因背景。
9. 根据权利要求1至8中任何一项的方法，其中所述GFAP助催化 剂为侧接人类GFAP基因的5， 2.2kbase区域。
10. 根据权利要求1至9中任何一项的方法，其中所述荧光蛋白质包 括GFP、 GFP S65T、 EGFP、 EBFP、 EBFP2、 Azurite、 mKalamal、 ECFP、 Cerulean 、 CyPet、 YFP、 Citrine 、 Venus或Ypet。
11. 根据权利要求10的方法，其中所述荧光蛋白质包括GFPS65T。
12. 根据权利要求1至11中任何一项的方法，其中所述视网膜病包括 初级视网膜病或次级视网膜病。
13. 根据权利要求12的方法，其中所述初级视网膜病包括与视网膜襞 裂症、老年性黄斑变性、或青光眼相关的视网膜病。
14. 根据权利要求12的方法，其中所述次级视网膜病包括以下相关的 视网膜病帕金森病、阿尔茨海默氏病、糖尿病视网膜病、肝脏病视网膜 病、肾脏病视网膜病、高血压、血管病、先天性心脏病、风湿性关节炎、 多发性硬化、神经纤维瘤病、莱姆神经疏螺旋体病、唐氏综合症、孤独症、 镰状细胞贫血、HIV感染、巨细胞病毒属感染、曱状腺障碍症或肝脏障碍 症。
15. 根据权利要求1至14中任何一项的方法，其中所述视网膜病或易 患视网膜病的体质是遗传的。
16. 根据权利要求1至14中任何一项的方法，其中所述视网膜病是辐 射诱导的。
17. 根据权利要求1至14中任何一项的方法，其中所述视网膜病是化 学诱导的。
18. 根据权利要求17的方法，其中所述视网膜病是由l-甲基-4-苯基 -l,2，3,6-四氢吡咬、红藻氨酸或3,3-亚氨基二丙腈诱导的。
19. 根据权利要求1至18中任何一项的方法，其中检测包括扫描激光检眼镜检查方法。
20. 根据权利要求1至19中任何一项的方法，其中间隔地或在一时间 段内执行检测，以监测视网膜病发作、视网膜病发展、视网膜病退行、视 网膜病恢复或视网膜病预后。
21. 根据权利要求1至20中任何一项的方法，其中监测包括对潜在的 治疗剂的治疗效果的监测。
22. 根据权利要求1至20中任何一项的方法，其中监测包括对潜在的 治疗剂的神经毒性的监测。
全文摘要
本发明提供一种在活的转基因的非人类的动物中监测视网膜病的方法，该方法包括提供活的转基因的非人类的动物，该动物具有视网膜病或具有易患视网膜病的体质，其中在GFAP助催化剂的控制下对荧光蛋白质编码的核酸分子被整合到所述转基因的非人类的动物的基因组中；以及在所述转基因的非人类的动物的视网膜神经胶质中活体检测所述荧光蛋白质的荧光水平。
文档编号G01N33/48GK101688858SQ200880022995
公开日2010年3月31日 申请日期2008年5月2日 优先权日2007年5月2日
发明者G·何, L·卓, S·库马尔 申请人:新加坡科技研究局