用³¹P核磁共振分析环境样品时消除磁性离子干扰的方法

专利名称：用³¹P核磁共振分析环境样品时消除磁性离子干扰的方法
技术领域：
本发明涉及对环境样品中磷组成的分析，尤其涉及用3'P核磁共振分析环境样品时消 除磁性离子干扰的方法。
技术背景磷是生物所必需的营养元素，也是生物生长的限制性元素。我国陆地表层大量水体(湖 泊、水库以及部分河流等)出现的富营养化，主要是水环境中磷含量过高引起的。环境中 的磷由无机磷和有机磷组成，无机磷主要指磷酸根磷和多聚磷，有机磷则由含磷的不同分 子有机化合物组成，包括膦酸、磷酸单酯、磷酸二酯等。磷化合物种类不同，在环境中的 迁移能力以及对生物生长的贡献有很大差异。因此，要深入了解环境中磷的迁移活性，以 及对生物生长的潜在影响，需要获得环境中磷组成的信息。当前，31P核磁共振("P-NMR)是分析环境样品中磷组成最主要的技术，与高效液相 色谱(HPLC)、化学提取和分离等方法相比，该技术对样品的前处理要求简单，能一次性 获得多个磷化合物或化合物基团的信息，应用优势十分明显。但磁性离子干扰是影响 3'P-醒R分析效果最主要的问题，由于环境样品(如土壤、沉积物)中存在大量的铁、锰 等化合物。使用碱性提取剂提取磷化合物的同时，铁、锰等磁性离子也被提取出来进入溶 液。当这些离子的含量过高时，会极大地影响3卞-NMR测定，突出表现在波峰的峰宽大幅 度增加，使得处于相邻位置的波峰之间发生重叠，从而增加磷化合物或化合物基团鉴别的 难度，同时降低波峰面积积分的准确度，给定量分析造成较大的误差.目前，已经发展了一些用于消除磁性离子干扰的方法，主要有两类(l)在提取环境 样品的磷组分之前，用还原剂、络合剂或阳离子树脂对环境样品进行前处理，通过还原、 络合或吸附作用除去大量铁、锰离子，从而消除或降低其干扰；(2)在提取环境样品的磷 组分之后，向提取液或经过浓縮后的提取液中添加还原剂、络合剂或阳离子树脂，通过还 原、络合作用降低其干扰的程度，或通过吸附作用去除铁、锰离子，消除其干扰。上述两 种方法都有一定的应用，但均存在比较明显的缺陷或局限性。前一种方法，前处理在去除 铁、锰离子的同时，不可避免地造成部分磷组分的损失，此外，前处理进行后，样品中残 留有大量的溶解态铁、锰离子，这些离子在进行磷组分提取后大部分仍然被保留下来，从 而使得磁性离子的干扰更加强烈。后一种方法，向提取液中添加阳离子树脂去除铁、锰离 子的同时，带负电荷的磷组分可通过阳离子桥被间接吸附，从而造成磷组分的损失；向经 过浓縮后的提取液中加入还原剂或络合剂，尽管不造成磷组分的损失，但在强碱性条件下 还原或络合作用受到很大限制，其消除效果十分有限。 发明内容本发明目的是提供一种用31P核磁共振分析环境样品时消除磁性离子干扰的方法，能在 磷组分不损失的前提下，非常显著地消除磁性离子的干扰，同时操作方法简便，适用于推广和应用。本发明上述目的通过以下技术方案实现用3卞核磁共振分析环境样品时消除磁性离 子干扰的方法，其特征是首先用碱性提取剂提取出环境样品中不同组分的磷，然后加入 8—羟基蝰啉溶液，将此时的含磷溶液pH值调至8.0-9.5，含磷溶液中的铁、锰离子与8一羟基蝰啉充分发生沉淀反应，通过离心法除去铁、锰等沉淀物后，含磷溶液用于3'P核磁共振分析。所说碱性提取剂可以是0. 1 0.5 mol/L的氢氧化钠溶液或相近浓度的氢氧化钠与乙 二胺四乙酸(EDTA)、氢氧化钠与氟化钠(NaF)组成的混合溶液。 具体可按以下步骤操作(1) 首先用未经稀释的12mol/L浓HC1配置8—羟基蝰啉溶液将浓HC1滴加到8 — 羟基蝰啉固体，直至固体全部溶解、定容，8—羟基蝰啉溶液浓度为1一3%;(2) 使用碱性提取剂提取环境样品中不同组分的磷，测定提取液中铝、铁、锰离子的 含量，根据需要处理的提取液体积，计算需要加入的8—羟基蝰啉摩尔数，根据步骤(1) 配置的8—羟基蝰啉溶液浓度，确定需要加入的8—羟基蝰啉溶液体积；(3) 根据步骤(2)确定的8—羟基蝰啉加入体积，向提取液中缓慢滴加8—羟基蝰啉 溶液，同时手动摇晃，使得8—羟基蝰啉在提取液中分布均匀；(4) 用3.5 mol/L的盐酸将提取液pH值调至9.0，摇动2分钟，静置半小时；(5) 将出现沉淀的混浊液装入离心管，在10000转/分钟速度下离心10分钟，再用 0. 45Wn滤膜过滤；(6) 步骤(5)得到的上清液经浓縮后用于3'P核磁共振分析。其中，步骤(2)测定提取后的含磷溶液中铝、铁、锰离子的含量，取出不少于10ml 体积的含磷溶液，计算该溶液中含有的铝、铁、锰离子摩尔数，加入8—羟基蝰啉的摩尔 数即为三者摩尔数之和的3倍(铁、铝离子与8—羟基蝰啉按摩尔比1: 3发生沉淀反应， 锰离子与8—羟基蝰啉按摩尔比1: 2发生沉淀反应， 一般提取后含磷的溶液中铁、铝离 子的含量高于锰离子，为简化计算，8—羟基蝰啉溶液的加入量按含量高的铁、铝离子反 应比例来确定)。本发明的优点及有益效果(1) 能够完全消除磁性离子的干扰当按操作要求添加8 —羟基蝰啉溶液后，通过沉淀可去除提取液中90%的铁离子和80%的锰离子，上述去除比例能够完全消除磁性离子 的干扰。(2) 在实施过程中不造成磷组分的损失由于8 —羟基蝰啉仅同阳离子作用，对带负电荷的磷离子不产生影响，因此磷组分能够完整地被保留下来。(3) 操作十分简便，所需成本低该方法仅需要增加8—羟基蝰啉滴加和调节pH两 个步骤，处理单一样品的时间不超过lh，同时可成批处理。8—羟基蝰啉价格十分低廉， 处理费用低。


图1是太湖沉积物样品提取液在不同pH条件下使用过量8—羟基蝰啉沉淀后磷、铁、 锰离子的去除率；
图2是太湖沉积物样品提取液在pH 9.0条件下使用不同剂量8—羟基蝰啉沉淀后 磷、铁、锰离子的去除率；
图3是太湖沉积物样品提取液在未处理和使用不同方法处理后的的31P-NMR波谱；
图4是图3各波谱中磷酸根的峰宽。
具体实施例方式
下面以太湖沉积物提取液的处理为实例，对本方法做进一步说明。
图1太湖沉积物样品提取液在不同pH条件下使用过量8—羟基蝰啉沉淀后磷、铁、锰 离子的去除率。通过此图可确定，使用8—羟基蝰啉沉淀的最佳pH在9.0，铁、锰离子的 去除率分别接近90%和80%，处理后磷的含量维持不变。
图2太湖沉积物样品提取液在pH 9. 0条件下使用不同剂量8—羟基蝰啉沉淀后磷、铁、 锰离子的去除率。通过此图可确定，当8—羟基蝰啉的添加剂量为铝、铁、锰离子三者摩 尔数之和的3倍时，对铁、锰离子的去除效果达到最佳，并趋于稳定。
图3是太湖沉积物样品提取液在未处理和使用不同方法处理后的的3'P-剛R波谱。图中 a说明未处理的样品波谱出现明显的重叠；图中b、 c说明向浓縮后的提取液中分别加入 10X的BD溶液和100mMEDTA溶液后，波峰之间仍然有较为明显的重叠；图中c说明向提 取液中加入chelex阳离子交换树脂后，尽管重叠基本消失，但原样品中多聚磷的信息没 有出现，反映该处理方法造成磷组分的损失；图中d说明提取液经过8—羟基蝰啉处理后， 原样品波谱中出现的重叠问题消失，同时波峰数明显增多，反映该方法完全消除了磁性离 子的干扰问题，同时磷组分没有损失。
图4为图3各波谱中磷酸根的峰宽。磁性离子的干扰程度可通过磷酸根峰(化学位移 6 7 ppm处)的峰宽反映，峰宽值约大，干扰越强，波峰之间的重叠越严重。通过不同 处理之间的峰宽值比较可知，本方法对磁性离子干扰的消除效果明显优于其他方法。 本发明方法所需试剂
1) 碱性提取剂称取10g NaOH和18. 6g EDTA(Na盐)溶解到1. 0升去离子水，配置成 0.25M NaOH+50mM EDTA混合液，该溶液是提取土壤和沉积物磷最常用的提取剂。
2) 3%的8—羟基蝰啉溶液称取3g8—羟基蝰啉，滴加浓HCl直至8—羟基蝰啉溶解， 将溶液定容至100ml。
3) lOOmM乙二胺四乙酸(EDTA)溶液称取37. 2g EDTA(Na盐)溶解到1. 0升去离子水 中。
4) BD溶液向1 mol/L的碳酸氢钠溶液加入1.5X的保险粉，将溶液pH调至8.5。
5) 阳离子树脂Chelex树脂，购自Sigma公司。
6) 重水(HA)。
所需设备超低温冰箱、冷冻干燥机、往复式振荡机、离心机、旋转蒸发仪、水浴式真 空泵、电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)以及Bruker AV400核磁共振仪。 操作步骤1、 采集太湖新鲜沉积物，在一40 —80'C条件下冷冻4h，然后在冷冻干燥机上进行 真空冷冻干燥。干燥好的沉积物经过研磨、过筛(100目)后，常温下密封保存待用。
2、 称取2g沉积物，加入40ml 0.25M NaOH+50mM EDTA混合液，25。C恒温振荡16h， 10000 rpm离心20分钟后，保留上清液(即提取液)。
3、 取2ml提取液，稀释5倍后，用ICP-AES测定溶液中的磷、铁、铝、锰离子的含量。
4、 取20ml提取液，计算需要加入的8—羟基蝰啉溶液(3%)的体积。向提取液滴加 8—羟基蝰啉溶液，同时小幅度摇晃。
5、 将加入8—羟基蝰啉的提取液pH用3.5M的HC1调至9.0，摇动2分钟，此时出现 大量黄绿色沉淀，将出现沉淀后的混浊液静置半小时。
6、 将混浊液装入40ml的离心管，在10000rmp速度下离心10分钟后，再用0. 45m 滤膜过滤，得到澄清的溶液。将离心和过滤所得的沉淀用少量去离子水洗两次后，洗脱液 与澄清溶液合并。
7、 将步骤6得到的溶液放入洗瓶中，在30t旋转蒸发浓縮到lml。
8、 将浓縮液加入10%的重水后，在161. 98 MHz下进行31P-NMR分析。采用BRUKER标 准腔5mmBB0探头，脉冲45'，延迟时间6秒，获取时间0.5 s，环境温度20'C。单个样 品扫描次数在17000 26000之间，分析时间在12h至18 h之间。3'P化学位移以85% H3P04 为基准，组成鉴别参考磷标样的化学位移，分别为膦酸(20ppm)、芳香族二酯(7.4ppm)、 正磷酸(6 7 ppm)、正磷酸单酯(4 6卯m)、磷脂(1 3 ppm) 、 DNA(O ppm)、焦磷酸(-3. 5 -4.5 ppm)、多聚磷末端磷(-3 -4 ppm)和多聚磷中间磷(-17 -19 ppm)。
9、 通过面积积分得到"P-NMR波谱中各类型磷化合物或化合物基团的组成比例，同时 测量磷酸根的峰宽(即峰高一半处的宽度)。
权利要求
1、用31P核磁共振分析环境样品时消除磁性离子干扰的方法，其特征是首先用碱性提取剂提取出环境样品中不同组分的磷，然后加入8-羟基蝰啉溶液，将此时的含磷溶液pH值调至8.0-9.5，含磷溶液中的铁、锰离子与8-羟基蝰啉充分发生沉淀反应，通过离心法除去铁、锰等沉淀物后，用于31P核磁共振分析。
2、 根据权利要求1所述用"P核磁共振分析环境样品时消除磁性离子干扰的方法，其 特征是所说碱性提取剂为0.1 0.5mol/L的氢氧化钠溶液或相近浓度的氢氧化钠与乙 二胺四乙酸或氢氧化钠与氟化钠的混合溶液。
3、 根据权利要求2所述用3'P核磁共振分析环境样品时消除磁性离子干扰的方法，其 特征是按以下步骤-(1) 首先用12mol/L的浓HC1配置8—羟基蝰啉溶液将浓HC1滴加到8—羟基蝰啉 固体，直至固体全部溶解、定容，8—羟基蝰啉溶液浓度为1一3%;(2) 使用碱性提取剂提取环境样品中不同组分的磷，测定提取液中铝、铁、锰离子的 含量，根据需要处理的提取液体积，计算需要加入的8—羟基蝰啉摩尔数，根据步骤(1) 配置的8—羟基蝰啉溶液浓度，确定需要加入的8—羟基蝰啉溶液体积；(3) 根据步骤(2)确定的8—羟基蝰啉加入体积，向提取液中缓慢滴加8—羟基蝰啉 溶液，同时手动摇晃，使得8—羟基蝰啉在提取液中分布均匀；(4) 用3.5 mol/L的盐酸将提取液pH值调至9.0，摇动2分钟，静置半小时；(5) 将出现沉淀的混浊液装入离心管，在10000转/分钟速度下离心10分钟，再用 0. 45Mm滤膜过滤；(6) 步骤(5)得到的上清液经浓縮后用于"P核磁共振分析。
4、 根据权利要求3所述用3'P核磁共振分析环境样品时消除磁性离子干扰的方法，其 特征是步骤(2)测定提取后的含磷溶液中铝、铁、锰离子的含量，取出不少于10ml 体积的含磷溶液，计算该溶液中含有的铝、铁、锰离子摩尔数，加入8—羟基蝰啉的摩尔 数即为三者摩尔数之和的3倍。
全文摘要
³¹P核磁共振分析环境样品时消除磁性离子干扰的方法，用氢氧化钠等碱性提取液将环境样品中不同组分的磷提取出来以后，利用8-羟基蝰啉沉淀去除含磷提取液中大量的铁、锰等磁性离子，从而大幅度降低³¹P-NMR波谱峰宽，显著提高磷组分的鉴别与定量分析。与现有的方法相比，该方法消除磁性离子干扰的效果更加显著，且在处理过程中不造成磷的损失，操作简便，成本低，其优势十分明显。
文档编号G01N1/28GK101629882SQ200910183048
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月5日 优先权日2009年8月5日
发明者丁士明, 白秀玲 申请人:中国科学院南京地理与湖泊研究所